Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Samenvatting

Een toegankelijke, open-source microfluïdische workflow wordt gepresenteerd voor de geparallelliseerde analyse van plasmideretentie in bacteriën. Door fluorescentiemicroscopie toe te passen om de aanwezigheid van plasmide in eencellige microkolonies in gelmicrodruppels te kwantificeren, biedt deze methode een nauwkeurig, toegankelijk en schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.

Samenvatting

Plasmiden spelen een cruciale rol in de synthetische biologie door de introductie en expressie van vreemde genen in verschillende organismen mogelijk te maken, waardoor de constructie van biologische circuits en routes binnen en tussen celpopulaties wordt vergemakkelijkt. Voor veel toepassingen is het van cruciaal belang om functionele plasmiden te behouden zonder antibioticaselectie. Deze studie introduceert een op open hardware gebaseerde microfluïdische workflow voor het analyseren van plasmideretentie door het kweken van afzonderlijke cellen in gelmicrodruppels en het kwantificeren van microkolonies met behulp van fluorescentiemicroscopie. Deze aanpak maakt de parallelle analyse van talrijke druppels en microkolonies mogelijk, wat een grotere statistische kracht oplevert in vergelijking met traditionele plaattelling en de integratie van de test in andere microfluïdische workflows van druppels mogelijk maakt. Door plasmiden te gebruiken die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen naast een niet-specifieke fluorescerende DNA-kleuring, kunnen afzonderlijke kolonies worden geïdentificeerd en gedifferentieerd op basis van plasmideverlies of fluorescerende markerexpressie. Met name deze geavanceerde workflow, geïmplementeerd met open-source hardware, biedt nauwkeurige stroomregeling en temperatuurbeheer van zowel het monster als de microfluïdische chip. Deze functies verbeteren het gebruiksgemak, de robuustheid en de toegankelijkheid van de workflow. Hoewel de studie zich richt op Escherichia coli als experimenteel model, ligt het ware potentieel van de methode in de veelzijdigheid ervan. Het kan worden aangepast voor verschillende onderzoeken die kwantificering van fluorescentiesignalen van plasmiden of vlekken vereisen, maar ook voor andere toepassingen. De adoptie van open-source hardware verbreedt het potentieel voor het uitvoeren van high-throughput bioanalyses met behulp van toegankelijke technologie in diverse onderzoeksomgevingen.

Inleiding

Plasmiden zijn essentiële genetische elementen in prokaryote cellen en dragen aanzienlijk bij aan microbiële evolutie door laterale DNA-overdracht en snelle aanpassing aan veranderingen in de omgeving ^1,2. Deze extrachromosomale DNA-moleculen dragen genen die voordelige eigenschappen bieden, zoals antibioticaresistentie, metabolische functies en virulentiefactoren, waardoor ze waardevol zijn voor microbiologisch onderzoek, synthetische biologie en evolutiestudies². Het onderhoud van plasmide in celpopulaties is echter een uitdaging vanwege de metabole belasting van replicatie en segregatie, wat vaak resulteert in plasmideverlies zonder selectiedruk³. Bovendien vereist stabiele overerving mechanismen zoals toxine-antitoxine en partitioneringssystemen, wat het onderhoud van het plasmide complexer maakt. Het beoordelen van de stabiliteit van plasmiden onder verschillende omstandigheden is cruciaal voor zowel fundamenteel onderzoek als praktische toepassingen die plasmiden gebruiken als primair onderzoekselement ^4,5. De meeste huidige methoden voor het beoordelen van de stabiliteit van plasmide hebben aanzienlijke beperkingen: op flowcytometrie gebaseerde methoden leveren indirecte gegevens op populatieniveau, vereisen dure apparatuur en missen directe visualisatie van kolonies⁶. Bulk transcriptomics- en proteomics-methoden zijn duur, leveren slechts gemiddelde cellulaire responsen op en kunnen de plasmideretentie in individuele kolonies niet direct kwantificeren⁶. Traditionele methoden zoals seriële verdunning en passage zijn eenvoudig maar tijdrovend en missen precisie en representeerbaarheid⁷. Over het algemeen blijft het een uitdaging om kwantitatief het aantal kolonies af te leiden of te projecteren dat in de loop van de tijd een specifiek functioneel plasmide of selectiedruk behoudt.

Om deze uitdagingen aan te gaan, wordt een nieuwe microfluïdische workflow gepresenteerd die gebruik maakt van open hardware-onderzoeksinstrumenten om fluorescerende signalen in meerdere geïsoleerde bacteriekolonies te kwantificeren, met behulp van Escherichia coli als model. Deze methode maakt een hoge doorvoer en nauwkeurige analyse van plasmideretentie onder verschillende omstandigheden of selectiedruk mogelijk. Analyse van de resolutie van één cel biedt een nauwkeurige methode om geïsoleerde kolonies te manipuleren, wat gevoelige gegevens oplevert over de kwantificering van plasmiden die kunnen helpen bij het beoordelen van de retentie- en verliespercentages⁴.

Microfluïdica, met name druppelmicrofluïdica, is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het inkapselen en manipuleren van individuele cellen in gecontroleerde omgevingen⁸. In het bijzonder kunnen microgeldruppels afzonderlijke cellen inkapselen voor een hoge doorvoer en nauwkeurige analyse zonder dat het nodig is om druppeltjes in olie te houden⁹, waardoor een gecontroleerde studie van de plasmidedynamiek in een gedefinieerde micro-omgeving mogelijk is. Na inkapseling van celsuspensies rechtstreeks uit een pipetpunt¹⁰, kunnen fluorescentietechnieken worden gebruikt om de groei van microkolonies in druppeltjes te volgen, waardoor een gedetailleerde analyse van plasmideretentie en -segregatie onder verschillende selectiedrukken mogelijk is³.

De voordelen van deze methode ten opzichte van traditionele bulkcultuurtechnieken zijn onder meer een grotere precisie, verminderde variabiliteit en de mogelijkheid om analyses met een hoge doorvoer uit te voeren. Open-source microfluïdica-technologie overwint de beperkingen van dure propriëtaire systemen, zoals problemen met toegankelijkheid, aanpassingsvermogen en onderhoud, die vaak de voortgang van het onderzoek belemmeren 11,12,13. Door te demonstreren hoe de geavanceerde experimentele workflow van plasmideretentieanalyse in microgels kan worden toegepast met open-source instrumentatie, wordt een toegankelijke en betrouwbare methode geboden voor onderzoek in plasmidebiologie, toepassingen van synthetische biologie en technieken voor microfluïdische druppelanalyse.

Samenvattend presenteert dit artikel een toegankelijke methode voor het kwantitatief beoordelen van plasmideretentie in E. coli met een hoge statistische power. De mogelijkheden van deze methode maken het een waardevol hulpmiddel voor het bevorderen van het begrip van plasmidebiologie en het verbeteren van toepassingen in synthetische biologie.

Protocol

Figuur 1geeft een schematisch overzicht voor het beoordelen van de plasmidestabiliteit in E. coli. Nadere gegevens over de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel. De ruwe gegevens en de visualisatiescripts zijn beschikbaar op https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK.

Figuur 1: Protocol van dag tot dag voor de beoordeling van de stabiliteit van het plasmide in E. coli. Blauwe pijlen geven stappen gedurende de dag aan en paarse pijlen geven nachtelijke incubatie aan. Elke incubatie van vloeistof en agar werd uitgevoerd bij 37 °C naast een afzonderlijke negatieve controlebuis/plaat. Merk op dat de voorbereiding en passages van de celcultuur niet nodig zijn voor monsters uit de echte wereld waarin plasmideverlies mogelijk al is opgetreden, dus het protocol moet worden teruggebracht tot een dag of twee als een plaatreferentiecultuur is opgenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereiding van microfluïdische chips

OPMERKING: In dit protocol kunnen verschillende commerciële of aangepaste chipontwerpen worden gebruikt voor celinkapseling die in staat is om water-in-oliedruppels met een diameter van minder dan 100 μm te genereren in een druppelregime. Voor dit onderzoek is de chip ontworpen en gefabriceerd (zie artikelgegevens https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK) volgens dezelfde ontwerp- en fabricagemethode als gerapporteerd in een eerder gepubliceerd rapport¹⁴.

1. Verkrijg of bereid een PDMS-op-glas microfluïdische chip voor met behulp van een mastermal die is ontworpen voor het genereren van gel-microdruppels.
2. Injecteer een waterafstotende oplossing (fluoralkylsilaan) in de chip om de binnenste microkanalen hydrofoob te maken. Laat de oplossing in de inlaten trekken en zorg ervoor dat alle kanalen gevuld zijn met vloeistof. Laat de gevulde kanalen ongeveer 30-60 seconden rusten.
3. Verwijder de oplossing uit het apparaat door lucht in de binnenste microkanalen te laten ontsnappen. Gebruik een lege luchtspuit om de lucht weg te spoelen en een absorberend doekje over de andere poorten om spatten te voorkomen.
4. Bak het behandelde apparaat 15 minuten op 65 °C op een kookplaat om overtollige oplossing te verdampen. U kunt het apparaat ook een nacht in de koelkast (4 °C) bewaren.
   OPMERKING: De microfluïdische chip is klaar voor gebruik. Het protocol kan hier gepauzeerd worden.

2. Voorbereiding van het monster

1. Cellen oogsten
   OPMERKING: Celcultuur in druppeltjes kan relevante gegevens opleveren over de dynamiek van het plasmide. Als experimenteel bacteriemodel wordt een E. coli TOP10-stam gebruikt met het plasmide pCA_Odd1 (zie gedeponeerde gegevens https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK) dat codeert voor een superfolder groen fluorescerend eiwit (sfGFP) en kanamycine-resistentie¹⁵. Bacteriën, plasmide en groeimedia kunnen variëren op basis van het experimentele systeem.
   1. Bereid Luria Bertoni (LB)-Agar door 25 g voorgemengde LB en 12 g agar op te lossen in 800 ml gedestilleerd water (dH₂O). Bereid ook vloeibare LB-media voor door 25 g voorgemengde LB op te lossen in 800 ml dH₂O. Autoclaveer de oplossingen en laat ze afkoelen tot ongeveer 60 °C. Ga naar een steriele omgeving zoals een afzuigkap voor de volgende stappen.
      OPMERKING: Het voorgemengde LB-poeder bevat 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g NaCl. Zelfgemengde LB-agar-media kunnen ook worden gebruikt.
   2. Voeg 50 μl kanamycine (bereid in een dosis van 100 mg/ml) toe aan 50 ml vloeibare LB-Agar (eindconcentratie: 100 μg/ml). Meng de oplossing door de tube een paar keer om te keren.
   3. Giet ongeveer 15 ml vloeibare LB-agar per petrischaaltje (90 mm x 15 mm). Maak twee platen klaar: één voor de negatieve controle (contaminatiebewaking) en één voor de experimenteercultuur. Laat de LB-agar-oplossing afkoelen en stollen tot de kleur op beide platen verandert van donker naar helder.
   4. Gebruik een steriele lus om de E. coli-stam op de kweekplaat te verspreiden met behulp van de streakplaattechniek. Plaats de glycerolbouillon E. coli direct na gebruik terug in de –80 °C. Sluit beide platen en incubeer ze een nacht bij 37 °C (dag 1).
   5. Controleer op dag 2 op het negatieve controleplaatje of er een kolonie is als signaal van besmetting (herhaal dan de stappen uit 2.1.4.). Identificeer enkele fluorescerende kolonies op de E. coli-plaat met behulp van een blauwlichtstraler om een vloeibare kweekvoorraad te bereiden.
   6. Open onder steriele omstandigheden de plaat en gebruik een steriele lus of een pipetpunt van 200 μl om de geselecteerde kolonie te pakken en over te brengen naar een kweekbuisje met 5 ml verse vloeibare LB-media en 5 μl kanamycine (bereid op 100 mg/ml). Bereid een negatieve controlebuis zonder inoculatie voor voor de monitoring van de besmetting. Incubeer de kweekbuizen een nacht bij 37 °C terwijl u schudt bij 220 tpm.
   7. Laat het monster nog 3 dagen in media zonder antibiotica lopen om omstandigheden te simuleren waaronder plasmideverlies kan optreden. Breng op dag 3, 4 en 5 50 μl van de nachtcultuur over in een nieuwe kweekbuis met 5 ml vloeibare LB zonder antibiotica. Incubeer een nacht bij 37 °C met schudden bij 220 tpm. Herhaal deze stap tot dag 6 en verkrijg een laatste cultuur van 5 ml na in totaal vier passages.
   8. Breng 50 μL over van de laatste nachtcultuur naar een nieuwe kweekbuis met 2 ml vloeibare LB. Laat de cultuur een optische dichtheid (OD600) van 0,3 bereiken met behulp van een spectrofotometer (ongeveer 3-4 uur).
      OPMERKING: De verse cultuur moet worden gebruikt voordat de OD600 toeneemt om ervoor te zorgen dat bacteriën zich in de logaritmische groeifase bevinden. Als de gewenste concentratie niet wordt bereikt, herhaal dan vanaf stap 2.1.8.
2. Cel-agarose mix voor inkapseling
   OPMERKING: Concentratieregeling is essentieel om inkapseling van druppels door één cel te garanderen. De vereiste celconcentratie kan worden berekend voor een beoogde inkapselingssnelheid en een specifiek druppelvolume, zoals weergegeven in het volgende voorbeeld:
   Druppelvolume (_V-druppel): Als er druppels van 50 μm worden gegenereerd
   
   
   Gewenste cellen per druppel (C_pd): gemiddeld één cel per vijf druppels (0,2 cellen/druppel)
   
   Verdunningsfactor: De initiële celconcentratie wordt verkregen in stap 2.1.8
   
   Hier worden druppels van 50 μm of 100 μm (zonder druppelsplitsing) (65-520 pL) gegenereerd waarbij ongeveer één cel per vijf druppels is ingekapseld, of 1,6 cellen per druppel zonder te splitsen. Gebruik voor E. coli de conversiefactor van 1 OD600-eenheid ≈ 7,8 x 10⁸ cellen/ml¹⁶. Vermenigvuldig de OD600-waarde uit stap 2.1.8 met de conversiefactor om de beginconcentratie (cellen/ml) van de cultuur te verkrijgen.
   1. Resuspendeer E. coli uit de bereide kweekvoorraad in vloeibare LB zonder kanamycine in een concentratie van 6,2e+6 cellen/ml (doelconcentratie voor druppels met een diameter van 50 μm). Bewaar de bacteriënsuspensie op kamertemperatuur tot het mengen met agarose.
      OPMERKING: Antibiotica onderdrukken de negatieve vorming van microkolonies, dus het is essentieel om het uit te sluiten van de media voor experimenten met plasmideverlies.
   2. Bereid agarose met een ultralage geleertemperatuur voor door deze in vloeibare LB te verhitten tot 90 °C in een concentratie van 2% (m/v). Schud het mengsel 10 minuten in een temperatuurgeregelde shaker.
   3. Verlaag de temperatuur van de thermoshaker tot 39 °C om de agaroseoplossing af te koelen. Plaats tegelijkertijd de bacteriesuspensiebuis gedurende 4 minuten in de thermoshaker om deze op te warmen tot 39 °C.
   4. Meng de bacteriën en de agarosesuspensies in een verhouding van 1:1 om een agaroseconcentratie van 1% (w/v) te verkrijgen met celsuspensie van 3,1e+6 cel/ml. Bereid de negatieve controleoplossing (contaminatiebewaking) met dezelfde agaroseconcentratie met behulp van vloeibare LB in plaats van de bacteriënsuspensie.
      OPMERKING: De agarosecelsuspensie moet snel worden gebruikt om concentratieveranderingen als gevolg van bacteriegroei te voorkomen. Houd de thermoshaker op 39 °C om de agarosevloeistof te bewaren totdat deze in de tipverwarmer is geladen voor het genereren van druppels.

3. High-throughput teelt van één kolonie

1. Experimentele opstelling
   1. Bouw of verkrijg het volledige open-source flowplatform (zie https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), inclusief gasdrukdrivers en flowsensoren. U kunt ook de eenvoudigere open-source hardware-stroboscoop-verbeterde microscopiefase bouwen (zie bouwinstructies https://wenzel-lab.github.io/strobe-enhanced-microscopy-stage/ en projectrepository https://github.com/wenzel-lab/strobe-enhanced-microscopy-stage).
      OPMERKING: Men kan ook een traditionele microfluïdica-opstelling gebruiken met een commerciële microscoop, hogesnelheidscamera en mogelijkheden voor het verwarmen van monsters.
   2. Integreer het open-source Raspberry Pi-gebaseerde druk- en debietcontrollersysteem zoals gedocumenteerd in de aangewezen repository (https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller).
      OPMERKING: Het modulebesturingselement wordt geïllustreerd en er wordt een back-up van gemaakt in de gegevensopslagplaats (https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK. Als alternatief kunnen traditionele drukregelaars of spuitpompen met een hoog koppel worden gebruikt.
   3. Voeg een glazen dia en pipettipverwarmers (https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring) toe aan de opstelling om de temperatuur van het agarosecelmonster te regelen wanneer het de chip binnenkomt.
      OPMERKING: Deze heaters, geïllustreerd in de gegevensopslagplaats (https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform en https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), zijn een belangrijk kenmerk van het open-source controllersysteem dat het werken met agarose mogelijk maakt en zijn mogelijk niet beschikbaar in andere commerciële systemen.
2. Inkapseling van één cel
   1. Plaats de microfluïdische chip op de stroboscoopversterkte microscopietrap en zorg ervoor dat de druppelgeneratiejunctie (kruising van de waterige en oliefasen) zichtbaar is.
   2. Stel de pipetpuntverwarmer en de glazen schuifverwarmer in op 40 °C met behulp van de besturingssoftware-interface.
   3. Gebruik een spuit met slang en PDMS-plug om het 1% agarosemengsel met celsuspensie in een pipetpunt van 200 μl te laden. Steek de punt in de tipverwarmer en plaats deze op de inlaat van de waterige fase in de microfluïdische chip. Vervang de PDMS-afdichting van de tip door een afdichting die is aangesloten op de slang van het stroomregelsysteem en start de infusie van de celsuspensie.
   4. Steek het uiteinde van de uitlaatslang in een afvoerslang en stel debieten of drukken van twee fasen in op de gebruikersinterface om vloeistof langzaam naar het microfluïdische kanaal te brengen. Gebruik 200 μL/h (180 mbar) voor de waterfase en 1700 μL/h (320 mbar) voor de oliefase. Wacht 1 minuut voor de stabilisatie van de druppelvorming.
      OPMERKING: Drukwaarden zijn afhankelijk van de kanaalgroottes van het chipontwerp en het kan zijn dat de stroomwaarden moeten worden aangepast voor verschillende ontwerpen voor het genereren van druppels.
   5. Zodra de druppelvorming stabiel is, brengt u het afval en de opvangslang over naar de verzamelbuis. Ga door met het verzamelen van druppels totdat het monsterreservoir leeg is. Herhaal de stappen 3.2.3 tot en met 3.2.5 om de negatieve controlevloeistof uit stap 2.2.4 in te kapselen.
      OPMERKING: De monsterafname moet binnen 15 minuten zijn voltooid.
   6. Bewaar de verzamelbuisjes op ijs tijdens het genereren van druppels of plaats ze na het experiment gedurende 1 uur op 4 °C om agarose in de druppels te laten geleren.
      OPMERKING: De microfluïdische chip kan opnieuw worden gebruikt als de microkanalen niet verstopt zijn en dezelfde suspensie is geladen. Gooi de pipetpunt weg nadat u de emulsie hebt gegenereerd (stappen 3.2.3-3.2.5).
3. Koloniegroei en afgifte van emulsie
   1. Breng de microdruppeltjes met bacteriën en de negatieve controle in druppels over naar een incubatiekamer die is ingesteld op 37 °C.
   2. Incubeer de microdruppels gedurende ten minste 4 uur of een nacht om voldoende koloniegroei mogelijk te maken. Controleer of de negatieve controle geen tekenen van besmetting vertoont via helderveldmicroscopie.
   3. Om de kolonies uit de emulsie te bevrijden, verwijdert u met een pipet of een spuit met een naald zoveel mogelijk olie van onder de gelmicrodruppelemulsie (hier werd naald maat 21 G gebruikt).
   4. Breng 50 μL van de gelmicrodruppels over in een nieuw microbuisje en bewaar dit bij 4 °C voor verdere druppelanalyse. Voeg aan de resterende emulsie een 1:1 mengsel van gefluoreerde olie toe met 1H,1H,2H,2H-perfluor-1-octanol (PFO) in een volume dat gelijk is aan de emulsie.
   5. Voeg ongeveer 200 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer, of 0,9% w/v NaCl-buffer, toe aan de emulsie. Draai het mengsel en draai het kort naar beneden in een centrifuge met vaste snelheid.
   6. Verwijder voorzichtig de oliefase van de onderkant van de vloeistofinterface en gooi 100 μL PBS van de bovenkant weg. Herhaal stap 3.3.4-3.3.5 om gewassen microgels in PBS-buffer te verkrijgen met minimale of geen olieresten.
      OPMERKING: De microgels nestelen zich op de vloeistofinterface; Vermijd het verwijderen ervan samen met de oliefase.

4. Analyse van één kolonie

1. Cel kleuring
   OPMERKING: Veel verschillende kleurcombinaties werken voor dit protocol. In wezen moet een DNA- of celwandkleuring worden gekozen die een kleur heeft die verschilt van het fluorescerende eiwit dat door het plasmide wordt gecodeerd en die kan worden geanalyseerd met behulp van de beschikbare filtercombinaties op de fluorescentiemicroscoop. Hier werd het DNA van cellen gekleurd met propidiumjodide (PI) om de fluorescentie te onderscheiden van het groene fluorescerende eiwit dat op de plasmiden codeert, maar er kunnen veel andere DNA-kleuringen worden gebruikt.
   LET OP: PI is een potentieel carcinogeen en moet worden behandeld met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Gooi de kleurstof veilig en in overeenstemming met de lokale regelgeving weg.
   1. Centrifugeer de gewassen microgels op ongeveer 80 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg met behulp van een pipet.
   2. Breng 50 μL van de microgels over in een nieuw microbuisje om te dienen als negatieve controle voor de ethanolbehandeling.
      OPMERKING: PI-kleuring komt alleen binnen in cellen met aangetaste membranen, zoals cellen die zijn aangetast door een ethanolbehandeling.
   3. Voeg een gelijke hoeveelheid 70% ethanol toe aan de overige microgels en meng kort met een vortex. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om bacteriële membranen te permeabiliseren voor PI-kleuring. Herhaal stap 4.1.1.
   4. Voeg een gelijk volume van 0,9% w/v NaCl toe aan de microgels en draai kortstondig. Herhaal stap 4.1.1.
   5. Voeg 2 μL PI (1 mg/ml) toe aan beide microbuisjes. Meng grondig en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
      OPMERKING: Als de negatieve controle een rood fluorescerend signaal vertoont via fluorescentiemicroscopie, kan de integriteit van kolonies zijn aangetast tijdens hun blootstelling aan andere oplossingen in de voorgaande stappen.
2. Microscopie
   OPMERKING: Druppels en microgels worden afgebeeld met een omgekeerde epi-fluorescentiemicroscoop om de verdeling van de druppelgrootte en de fluorescentie van bacteriekolonies in microgels te verkrijgen (Figuur 2). Hier wordt een open-source omgekeerd microscopieplatform (https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform)¹⁷ gebruikt met een 10x 0,3NA-objectief, een witte LED-array voor helderveldverlichting en een 470nm LED voor excitatie. Commerciële epi-fluorescentiemicroscopen kunnen worden gebruikt om druppeltjes en microgels af te beelden. Kalibratie is vereist omdat verlichting en filters variëren afhankelijk van het model, het merk en de gebruikte fluorescerende eiwitten.
   1. Breng 2 μL gelmicrodruppels over in een objectglaasje van de beeldkamer en voeg 5 μL gefluoreerde olie toe om een monolaag van druppels te vormen voor een optimale beeldvorming.
      OPMERKING: Celtelkamers of eenvoudige microfluïdische kamers kunnen helpen de emulsie dun te verspreiden en het droogproces te vertragen.
   2. Activeer op de microscoop de witte LED-matrixverlichting van bovenaf voor helderveldbeeldvorming. Monteer het voorbereide objectglaasje, stel scherp op het monster en zoek een monolaag druppels. Maak een helderveldafbeelding.
   3. Zonder het monster te verplaatsen, kunt u een fluorescentiebeeld van de kolonies vastleggen door over te schakelen naar de 470 nm LED voor excitatie. Pas het filterwiel aan zodat het wordt uitgelijnd met het groene golflengtefilter voor sfGFP-beeldvorming. Scan alle gebieden met monolagen van druppels en herhaal de stappen 4.2.2-4.2.3 om statistische robuustheid van de druppelanalyse te garanderen.
   4. Breng 2 μL van de gekleurde microgels over in een beeldkamerchip en 5 μL van 0,9% w/v NaCl om een monolaag van microgels te helpen vormen. Dicht de inlaat en uitlaat van de chip af om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen.
      OPMERKING: Verdamping kan de colokalisatie van de fluorescerende labels beïnvloeden. Microfluïdische kamers worden aanbevolen voor langdurige beeldvorming.
   5. Herhaal stap 4.2.2–4.2.3. Pas het rode golflengte-intervalfilter aan voor PI-beeldvorming en leg de respectieve beelden vast.
   6. Nadat de beeldvorming op één locatie is voltooid, zoekt u het volgende geschikte gebied op de objectglaasje met een monolaag microgels en herhaalt u het beeldvormingsproces om statistische robuustheid en uitgebreide analyse van het monster te garanderen.

Figuur 2: Microscopiebeelden en hun analyse. Fluorescentiebeeldvorming en analyse van kolonies in microgels. (A-C) Beeldkanalen verkregen via helderveld- en fluorescentiemicroscopie met de omgekeerde microscoop. Het samengestelde beeld (D) toont de aanwezigheid van een negatieve kolonie (alleen rode fluorescentie) in de microgels. (E-H) Resultaten van de workflow voor beeldanalyse. Door ROI's te genereren, kunnen kolonies worden geïdentificeerd op rode en groene kanalen en kunnen de signalen worden gekwantificeerd om de aanwezigheid van negatieve kolonies te definiëren. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Analyse van afbeeldingen
   OPMERKING: Om de fluorescentiesignalen van de ingekapselde kolonies te analyseren en zeldzame gebeurtenissen te identificeren, kunnen beelden van helderveld- en fluorescentiebeeldvorming worden verwerkt met Fiji/ImageJ (Figuur 3). Deze stappen kunnen worden geïmplementeerd in een macroscript en de parameterwaarden kunnen variëren, afhankelijk van de optische configuratie.
   1. Open de afbeeldingen van de groene en rode kanalen. Definieer een rechthoekig interessegebied (ROI) dat begint bij coördinaten (500, 500) met elk een breedte en hoogte van 2000 pixels.
      OPMERKING: Deze parameters zijn van toepassing op afbeeldingen van 3000 x 3000 pixels en de ROI definieert het gebied met een betere verlichting.
   2. Snijd de afbeelding bij tot de gedefinieerde rechthoekige ROI. Trek een constante waarde van 10 af van de intensiteit van elke pixel en pas een afvlakkingsfilter toe op de afbeelding om achtergrondruis te verminderen en de interessante objecten duidelijker te maken.
      OPMERKING: Alleen dit gebied wordt gebruikt voor verdere analyse.
   3. Dupliceer de afbeelding van het rode kanaal en zet deze om in een binair masker om de zeldzame gebeurtenissen met betrekking tot het plasmide te identificeren. Stel de drempelwaarden in tussen 10 en 255. Pixels binnen dit bereik worden beschouwd als voorgrond (interessante objecten), terwijl andere als achtergrond worden behandeld.
   4. Voer morfologische bewerkingen uit om kleine openingen te dichten en eventuele gaten in de interessante objecten op te vullen. Pas het stroomgebiedalgoritme toe op afzonderlijke overlappende objecten binnen het binaire masker.
   5. Analyseer de deeltjes in het binaire masker. Denk alleen aan deeltjes met een grootte groter dan 30 pixels en een circulariteit tussen 0,50 en 1,00. De resultaten worden samengevat en toegevoegd aan de resultatentabel. Sla de set ROI's op die door de deeltjesanalyse zijn gedetecteerd voor verdere visualisatie.
   6. Geef de opgeslagen ROI's weer op de afbeeldingen van de groene en rode kanalen. Meet de intensiteit of andere eigenschappen van de ROI's in deze afbeeldingen. Noteer de metingen in de resultatentabel en sla de resultaten op in afzonderlijke CSV-bestanden voor verdere statistische analyse.

Figuur 3: Workflow voor beeldanalyse om negatieve kolonies te identificeren. De afbeelding illustreert een stapsgewijze workflow om fluorescentiebeelden automatisch te verwerken en te beoordelen. De workflow is gebaseerd op de colokalisatie van fluorescentielabels en deeltjesanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. De test van de agarplaatvergelijking

OPMERKING: Om de druppelmethode te vergelijken met een traditionele plaattest, werd de kwantificering van fluorescerende kolonies van dezelfde E. coli-stam verkregen in stap 2.1.8. werd uitgevoerd met behulp van petrischalen. Dit diende als een analoge controlemethode om de stabiliteit van het sfGFP-plasmide te meten. Zie ook de methode-illustratie in Figuur 1.

1. Bereid LB-agar (zonder antibioticum) zoals beschreven in stap 2.1.1 van de sectie Celoogst. Koel de agar af tot onder 60 °C en homogeniseer.
2. Giet in een steriele omgeving 15 ml van het agarmedium in elk petrischaaltje. Laat de platen stollen met de deksel gedeeltelijk open tot ze klaar zijn voor gebruik.
3. Inoculeer drie platen met elk 10 μL van een E. coli-cultuur in LB-media met een OD600 van 0,007 ± 0,002. Verdeel gelijkmatig met behulp van een L-vormige spreider. Incubeer de platen bij 37 °C, gesloten en omgekeerd. Bereid een controleplaat voor zonder bacteriën onder dezelfde omstandigheden.
4. Maak na 24 uur fluorescentiebeelden van de platen met behulp van de FluoPi, een open-source fluorescentiebeeldvormingssysteem (https://github.com/RudgeLab/FluoPi)¹⁵.
   OPMERKING: De FluoPi bestaat uit een Raspberry Pi-camera met een blauw excitatielicht op een golflengte gecentreerd op 470 nm en acrylexcitatie- en emissiefilters.
5. Tel handmatig de fluorescerende en niet-fluorescerende kolonies in elke plaat met behulp van de vastgelegde afbeeldingen.

Resultaten

Validatie van celinkapseling en microkolonievorming

De celinkapseling kan visueel worden bevestigd door helderveldmicroscopie uit te voeren op de gelmicrodruppels voordat de emulsie wordt gebroken en de microgels worden gewassen. Een representatief resultaat van de emulsie in deze stap is weergegeven in figuur 4.

Figuur 4: Doorsnede van een overlay-afbeelding van een fluorescentiemicroscopie. Na een nacht incubatie, representatieve microkolonies van sfGFP die E. coli-kolonies tot expressie brengen in gelmicrodruppels. Er werd gebruik gemaakt van een microscoopobjectief met een vergroting van 10x en een NA van 0,30. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Resultaten van beeldanalyse

Zodra microgels zijn gekleurd en helderveld, evenals fluorescentiekanalen die op verschillende posities zijn verkregen, kunnen de kolonies die in de originele afbeeldingen als negatief zijn geïdentificeerd, worden gevisualiseerd (zie figuur 5A). Gegevens die uit alle afbeeldingen van één experiment zijn geëxtraheerd, kunnen worden uitgezet om de fluorescentieverhouding van verschillende kolonies te laten zien, waarbij de kolonies worden gemarkeerd die plasmide-gecodeerde fluorescentie hebben verloren (zie figuur 5B). De resultaten geven aan dat 100 kolonies hun plasmide of plasmidefunctionaliteit verloren op een totaal van 2785 geanalyseerde microkolonies, wat overeenkomt met 3,6%.

Figuur 5: Kwantificering van negatieve microkolonies. (A) Doorsnede van een overlay-afbeelding van een fluorescentiemicroscopie. Na verwijdering en kleuring van de olie vertoonden representatieve kolonies in microgels die sfGFP tot expressie brachten en twee negatieve kolonies de rode fluorescentie van de DNA-kleuring (zwart omcirkeld). Schaalbalk: 100 μm. (B) Spreidingsdiagram van de fluorescentiewaarden van individuele microkolonies geëxtraheerd uit 16 meerkanaals microscopiebeelden. Kolonies zonder enige groene fluorescentie werden geteld als negatief, zoals in rood aangegeven in de grafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Kwantificering van agarplaten

Afbeeldingen van de drievoudige platen zijn te zien in figuur 6, met niet-fluorescerende kolonies aangegeven met witte pijlen. De eerste plaat (Figuur 6A) toonde in totaal 213 kolonies, waarvan er 1 niet fluorescerend was. De tweede plaat (Figuur 6B) had in totaal 49 kolonies, zonder niet-fluorescerende kolonies. De derde plaat (Figuur 6C) toonde in totaal 252 kolonies, waarvan er 6 niet fluorescerend waren. Deze resultaten komen overeen met een gemiddeld verlies van kolonieplasmide van 2,3%, met een grote standaarddeviatie van 3,2.

Figuur 6: Identificatie van negatieve kolonies op platen. (A-C) Fluorescerende en niet-fluorescerende E. coli kolonies op LB-agar platen (diameter: 90 mm, hoogte: 15 mm). Het entmateriaal, afgeleid van E. coli met sfGFP uit -80 °C voorraad, werd op dag 1 gestreept, op dag 2 gekweekt met antibioticum en van dag 3 tot 6 dagelijks 1:100 verdund om plasmideverlies mogelijk te maken. Kolonies werden gedurende 24 uur bij 37 °C geïncubeerd en in beeld gebracht in een FluoPi-kamer. Niet-fluorescerende kolonies werden versterkt met GIMP en aangegeven met witte pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een op gel microdruppel gebaseerde methode wordt gedemonstreerd om kolonies met en zonder plasmide-gecodeerde genetische expressie van fluorescerende eiwitten, zoals sfGFP, effectief te identificeren en te kwantificeren. Kolonies die het plasmideproduct niet voldoende tot expressie brengen, worden geïdentificeerd met behulp van een fluorescerende DNA-kleuring (hier propidiumjodide) die alle kolonies kleurt en een andere emissiegolflengte heeft. Deze integratie van druppelmicrofluïdica, geleer- en fluorescentiemicroscopie, gebruikmakend van open-sourcetechnologie, maakt het mogelijk om een geavanceerde workflow uit te voeren in veel onderzoeksomgevingen^11,13. De succesvolle generatie van gel-microdruppels maakt geavanceerde moleculair-biologische single-cell workflows mogelijk, waaronder cellyse, single genoom amplificatie, metabole celinteractieschermen, media-uitwisseling en meer ^8,9. Deze voordelen worden in dit protocol gebruikt om microkolonies op een meer schaalbare manier te laten groeien, kleuren en analyseren dan in traditionele plaatgebaseerde assays.

Kritieke stappen

Het inkapselingsproces is een cruciaal en delicaat onderdeel van het protocol. Nauwkeurige controle van ingrediëntenconcentraties, stroomsnelheden en drukken is vereist om uniforme microgels binnen een specifiek groottebereik te genereren en het gemiddelde aantal cellen per druppel te beheersen. Bovendien voorkomt het handhaven van de concentratie en temperatuur van het cel-agarosemengsel klonteren of voortijdige geleering. De temperatuurregeling van de vloeibare agarosecelsuspensie in een pipetpunt is een bijzonder voordelige implementatie van ons open-source hardware microfluïdice-werkstation dat veel eenvoudigere en robuustere microgelgeneratie biedt in vergelijking met inspanningen om de temperatuur van spuitpompen en slangen te regelen. Aangezien cellen vóór inkapseling en teelt worden gemengd met het agarosegroeimedium, moeten de agarosemicrogels snel worden gegenereerd om grote veranderingen in de celconcentratie te voorkomen. Voor dit doel werd een druppelsplitsend microfluïdisch chipontwerp geïnspireerd, geïnspireerd door Abate et al. geoptimaliseerd¹⁸.

Wijzigingen en probleemoplossing

Er waren verschillende kalibraties en aanpassingen nodig om het oorspronkelijke protocol te verfijnen. De inkapseling van agarose is veel uitdagender dan gewone water-in-oliedruppels, waardoor het ontwerp van een systeem nodig is om de agarose in vloeibare toestand te houden en er tegelijkertijd voor te zorgen dat de waterige fasestroom een homogeen deeltjesgroottebereik bereikt. Veranderingen in de viscositeit van agarose als gevolg van geleering beïnvloeden de stroomsnelheid, wat leidt tot grotere deeltjesgroottes. De microscopie vereist een zorgvuldige selectie van filters en lichtbronnen om niet-overlappende excitatie- en emissiesignalen te garanderen voor een duidelijke differentiatie. Aanvankelijk werd DAPI gekozen voor het kleuren van bacteriën, maar het emissiesignaal overlapte met sfGFP, waardoor sfGFP werd gedetecteerd in het blauwe detectiekanaal. We zijn overgestapt op PI omdat de emissie goed gescheiden is van sfGFP bij lange golflengten (rood licht).

Hoewel het plasmideverlies werd gekwantificeerd met behulp van de voorgestelde methode, was het gebruikte sfGFP-plasmide onverwacht stabiel en vertoonde het nauwelijks gevallen van plasmideverlies in de eerste generatie cellen die zonder antibiotica werden gekweekt, zelfs onder stressomstandigheden zoals pH9-media en incubatie bij 40 °C. Deze observatie komt overeen met de bevindingen van andere onderzoeksgroepen ^1,19. De stabiliteit van het plasmide beperkte de demonstratie van de volledige kwantificeringsmogelijkheden van de methode voor initiële celcultuurgeneraties, maar het toonde wel aan dat de methode gevoelig genoeg is om zelfs kleine verschillen in plasmideretentie te detecteren. De waarneming van hoge plasmidestabiliteit in vroege generaties heeft een belangrijke implicatie voor microfluïdische schermen met druppeltjes die gebruik maken van een negatieve selectietest, zoals remming van doelbacteriën. Het betekent dat het plasmideverlies van selectiedoelen een lage bron is van vals-positieve selectieresultaten. Aangezien microfluïdische schermen met druppeltjes doorgaans andere schermen met een hoge doorvoer, zoals pipetteerrobotworkflows, met ordes van grootte in doorvoer overtreffen, moeten deze zeldzame gebeurtenissen worden beoordeeld en in aanmerking worden genomen.

Beperkingen

Ondanks de voordelen zijn er beperkingen aan de gepresenteerde methode. De fabricage van microfluïdische apparaten vereist expertise en nauwgezette aandacht voor detail, evenals een strakke experimentele controle van de stroomsnelheden om de efficiëntie van deterministische inkapseling te garanderen. Deze aspecten kunnen optimalisatie vereisen voor verschillende experimentele opstellingen. Hoewel deze methode gebaseerd is op fluorescentiemicroscopie voor signaaldetectie, waardoor toegang tot geschikte beeldvormingsapparatuur nodig is, kan deze apparatuur worden vervaardigd met behulp van open-source hardware, waardoor deze toegankelijker wordt. Bovendien kunnen microgels worden verwerkt in commerciële flowcytometrie met grote nozzles, waardoor de toegankelijkheid en experimentele doorvoer verder worden verbeterd. Voor deze cytometrische analyse kunnen ook druppelsorteerders worden gebruikt.

Bovendien, hoewel de methode is ontworpen om fluorescerende signalen van plasmiden, vlekken of andere markers te detecteren, is deze beperkt tot cellen die fluorescerend kunnen worden gelabeld, wat mogelijk niet van toepassing is op alle bacteriestammen of experimentele omstandigheden. De methode kan echter worden aangepast om andere soorten microscopieën op te nemen, zoals fasecontrast- of helderveldmicroscopie, waardoor fenotyperingstoepassingen mogelijk zijn die verder gaan dan fluorescentie. Bovendien kan het worden gecombineerd met spectroscopische technieken zoals FTIR- of Raman-spectroscopie, waardoor het zijn mogelijkheden uitbreidt om chemische samenstellingen en structurele informatie van de ingekapselde cellen te analyseren. Deze aanpassingen verbreden het toepassingsgebied ervan, waardoor het een veelzijdig hulpmiddel is voor diverse onderzoeksomgevingen.

Betekenis en toepassingen

Traditionele testen voor plasmideverlies¹⁹ maken geen goede kwantificering mogelijk van de verhouding van cellen die hun expressie hebben verloren, informatie die erg belangrijk kan zijn bij het ontwerpen van experimentele methoden en verschillende biologische toepassingen. Gewoonlijk worden kolonietypen opgesomd in agarplaattesten, waar goed gedefinieerde geïsoleerde kolonies kunnen worden verkregen, zoals aangetoond in figuur 4. Overlappende kolonies zijn echter een uitdaging om met vertrouwen te identificeren; In onze handen krijgen we niet altijd een optimale koloniedichtheid, en er zijn veel platen nodig om goede statistieken te verkrijgen van laagfrequent plasmideverlies. De voorgestelde methode biedt een robuustere benadering om fluorescerende signalen afkomstig van geïsoleerde kolonies met een groter aantal kolonies nauwkeurig te kwantificeren dan de analoge methoden van de agarplaat, omdat kolonies zich in microdruppels afzonderlijk ontwikkelen, kleiner zijn en gemakkelijk in beeldvormingskamers kunnen worden geladen, waardoor microscopie of op flowcytometrie gebaseerde kwantificering van grote kolonieaantallen mogelijk is. Dit kan de statistische weergave van de methode aanzienlijk verbeteren en integratie in andere gel-microdruppelworkflows mogelijk maken.

Het gebruik van open-source hardware ^11,20 stelt onderzoekers in staat om het ontwerp van het microfluïdische werkstation aan te passen en de stroom rat nauwkeurig aan te passen; Daarom ondersteunt de deeltjesgrootte verschillende celtypen en experimentele omstandigheden. Deze flexibiliteit strekt zich uit tot het mogelijk opnemen van andere microscopietypen, zoals fasecontrast of spectroscopie, waardoor de toepasbaarheid van de methode wordt verbreed. Het vermogen van de methode om de stabiliteit van het plasmide onder verschillende omstandigheden te evalueren, is cruciaal voor toepassingen die plasmideretentie vereisen zonder antibioticaselectie, onder bepaalde stressomstandigheden of verschillende kweekgeneraties. De veelzijdigheid en het aanpassingsvermogen van de gepresenteerde methode maken deze waardevol voor diverse onderzoekstoepassingen op het gebied van onder meer synthetische biologie, milieumonitoring en klinische diagnostiek².

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol	Sigma-Aldrich	370533-25G	Voor het breken van emulsies
70% ethanol			Voor celpermeabilisatie
Agar-Agar	Winkler	9002-18-0
Biopsy Punch			0,75 mm en 1,8 mm
Blue LED transilluminator	IO Rodeo
Culture tube			15 mL
Desiccator			Met vacuümpomp
Disposabele beker			Voor het mengen van PDMS
Disposabele vork			Voor het mengen van PDMS
E. coli TOP10 strain
FluoPi microscoop	https://github.com/wenzel-lab/FluoPi		Groen fluorescerend beeldvormingssysteem voor het analyseren van platen
Gefluoreerde olie	3M		Novec 7500
Glasplaatverwarmer	https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring		Voor het regelen van de temperatuur op 40 °C van microfluïdische chip
Glasplaten
Hotplate	Mechanic		Voor het verdampen van Aquapel
Beeldanalysesoftware	Fiji/ImageJ		2.14.0/1.54f
Incubator	Mundo Lab		MLAB Scientific / Voor het incuberen van platen en microgels
Isopropanol			Voor het reinigen van glasplaten
Kanamycine			100 ug/mL concentratie
L-vormige verspreider			Voor het verspreiden van bacteriën op agarplaten
Mastervorm			Chipontwerp op siliconen of glazen wafer
Microbuizen			2 mL
NaCl-oplossing			Natriumchloride 0,9% w/v
Open-source hardware strobe-verbeterde microscoopstandaard	https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform		Voor helderveldmicroscopie
Petrischaal	Citotest	2303-1090	90 x 15 mm
Pipettipverwarmer	https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring		Voor het regelen van de temperatuur op 40 °C van de pipettip
Plasmareiniger	Diener Electronic	117056	Voor het verbinden van PDMS met een glasplaat
Plasmid pCA_Odd1			Codeert voor sfGFP en kanamycine-resistentie
Polytetrafluorethyleen (PTFE) slang	Adtech Polymer Engineering Ltd
Voorgemengd Luria Bertoni-medium	US Biological Life Science	L1520
Propidiumjodide (PI)			Voor kleuring
Raspberry Pi-gebaseerd druk- en stroomregelsysteem	https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller		Voor het regelen van druk en stroomsnelheden
Silicone-elastomerbasis	Sylgard		PDMS kit - 184 Silicone Elastomer Kit
Silicone-elastomerhardingsmiddel	Sylgard		PDMS kit - 184 Silicone Elastomer Kit
Spectrofotometer			Voor het meten van absorptie
SQUID-microscoop	https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform		Multi-fluorescentie beeldvormingssysteem voor het analyseren van gekleurde cellen
Steriele lus			Voor het plukken van een kolonie en het uitstrekken van plateren
Oplosmiddel	Sphere Fluidics		Pico-Surf
Spuiten	NIPRO		Met filters en slangen
Temperatuurgeregelde shaker	Mundo Lab		DLAB HCM100-Pro
Pincet
Ultra-lage geleerde temperatuur agarose	Sigma-Aldrich	A2576-5G	Voor het genereren van hydrogelkralen
Waterafstotende oplossing (fluoroalkylsilaan)	Aquapel		Voor het behandelen van microkanalen van PDMS-apparaat