Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het maagdarmkanaal (GIT) dient zowel bij de vertering van voedsel en de opname van voedingsstoffen, maar ook als een beschermende barrière tegen ziekteverwekkers. Traditioneel is onderzoek op dit gebied gebaseerd op dierproeven, maar er is een groeiende vraag naar alternatieve methoden die voldoen aan de 3R-principes: vervangen, verminderen en verfijnen. Varkensorganoïden zijn naar voren gekomen als een veelbelovend hulpmiddel, dat een nauwkeurigere in vitro replicatie van de in vivo omstandigheden biedt dan traditionele celmodellen. Een grote uitdaging bij darmorganoïden is hun naar binnen gerichte apicale oppervlak en naar buiten gerichte basolaterale oppervlak. Deze beperking kan worden overwonnen door tweedimensionale (2D) organoïdelagen te creëren op transwell-inserts (hierna aangeduid als insert(s)), die toegang bieden tot beide oppervlakken. In deze studie hebben we met succes tweedimensionale culturen van varkensjejunum en colonorganoïden ontwikkeld. Het kweekproces omvat twee belangrijke fasen: eerst de vorming van een cellulaire monolaag, gevolgd door de differentiatie van de cellen met behulp van op maat gemaakte media. Cellulaire groei wordt gevolgd door transepitheliale elektrische weerstand te meten, die stabiliseert op dag 8 voor colonorganoïden en dag 16 voor jejunum-organoïden. Na een differentiatiefase van 2 dagen is het epitheel klaar voor analyse. Om actieve elektrogene transportprocessen, zoals chloridesecretie, te kwantificeren en te volgen, gebruiken we de Ussing-kamertechniek. Deze methode maakt real-time meting en gedetailleerde karakterisering van epitheliale transportprocessen mogelijk. Dit innovatieve in vitro model, gecombineerd met gevestigde technieken zoals de Ussing-kamer, biedt een robuust platform voor het fysiologisch karakteriseren van het maagdarmkanaal van varkens binnen het 3R-kader. Het opent ook mogelijkheden voor het onderzoeken van pathofysiologische mechanismen en het ontwikkelen van potentiële therapeutische strategieën.
Inleiding
Het maagdarmkanaal speelt een centrale rol bij de spijsvertering, de opname van voedingsstoffen en de uitscheiding van afvalstoffen via de ontlasting1. Bovendien functioneert het als een barrière tegen ziekteverwekkers, een rol die wordt ondersteund door een diverse cellulaire samenstelling, waaronder stamcellen, slijmproducerende slijmbekercellen, entero-endocriene cellen en absorberende enterocyten2. De intestinale homeostase kan worden verstoord door verschillende factoren, zoals bacteriële infecties3 of ontstekingsprocessen4, wat kan leiden tot ernstige gevolgen voor het organisme, zoals malabsorptie, diarree of zelfs de dood5. Het onderzoeken van dergelijke pathofysiologische scenario's wordt meestal gedaan met behulp van proefdieren of, in overeenstemming met het 3V-principe6, celculturen afkomstig van verschillende soorten. Nauwkeurige voorspelling en overdraagbaarheid van resultaten zijn cruciaal bij het gebruik van soortspecifieke modellen7. Ondanks deze behoefte is er een opmerkelijk gebrek aan van varkens afgeleide celculturen die de complexiteit en functionaliteit van het darmkanaal adequaat nabootsen.
Om deze uitdaging, die ook relevant is voor andere soorten, aan te gaan, zijn driedimensionale (3D) organoïden ontwikkeld in een poging de fysiologische complexiteit van het GIT8 na te bootsen. Aanvankelijk werden organoïden gemaakt van darmen van mensen en muizen; Tot op heden zijn ook varkensorganoïden van jonge en volwassen varkens met succes ontwikkeld en gekweekt 9,10. Sinds hun ontstaan zijn deze varkensorganoïden in verschillende onderzoeken gebruikt, voornamelijk gericht op darminfecties 11,12,13,14. Onderzoek gericht op het karakteriseren van fysiologische eigenschappen, zoals het transport van voedingsstoffen of secretoire processen, blijft beperkt15. Dit kan te wijten zijn aan de oriëntatie van darmorganoïden, waarbij het apicale oppervlak naar binnen is gericht en de basolaterale kant naar buiten, waardoor de toegankelijkheid tot het apicale oppervlak wordt beperkt. Deze beperking werd aangepakt door met succes varkensorganoïden te kweken in een tweedimensionaal formaat16, een methode die verder is gevorderd door het gebruik van bevroren weefsel om ze te genereren17.
De 2D-kweek van varkensorganoïden biedt toegang tot beide zijden van het epitheel, waardoor gevestigde methoden kunnen worden toegepast om transportprocessen over de epitheellaag te bestuderen. Een van die methoden is de Ussing-kamer18, die real-time observatie van elektrogene absorptie- en secretoire processen in het epitheel mogelijk maakt. Uitgebreid gebruik van dit systeem heeft geleid tot een uitgebreid begrip van de darmfunctie van varkens in vivo, dat de hele darmas bestrijkt. Dit omvat studies naar het transport van monosachariden of het transport van vetzuren met een korte keten of reacties op secundaire plantenmetabolieten zoals resveratrol die de darmtransportkenmerken beïnvloeden 19,20,21,22,23,24. De aanzienlijke hoeveelheid gegevens uit deze studies maakt directe vergelijkingen mogelijk tussen de goed gekarakteriseerde in vivo omstandigheden en de in vitro omgeving van varkensorganoïden, waardoor we meer inzicht krijgen in hun fysiologische relevantie.
In deze studie presenteren we een protocol voor het genereren en kweken van 2D-monolagen uit 3D-varkensorganoïden. Daarnaast beschrijven we de methodologische aanpak voor het kwantificeren van darmtransportprocessen met behulp van de Ussing-kamertechniek. Het protocol biedt instrumenten om absorptie- en secretoire kenmerken in vitro te bestuderen in jejunum- en colonorganoïden, waardoor een directe vergelijking met goed gekarakteriseerde in vivo aandoeningen mogelijk is. Toekomstige toepassingen van dit protocol kunnen bestaan uit het onderzoeken van de effecten van farmacologische of toxicologische stoffen, evenals het onderzoeken van interacties tussen het epitheel en ziekteverwekkers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voor dit protocol werden twee gezonde varkens (Bentheim Blacked Pied pig; 1 mannetje, 1 vrouwtje; 4,5 maanden oud; ongeveer 65 kg) geofferd door middel van penschiet en bloeden in gevangenschap. Volgens de Dierenbeschermingswet is dit (het slachten en afnemen van weefsels) niet geclassificeerd als een dierproef, maar moet dit worden gemeld aan de dierenwelzijnsfunctionaris (registratienr. TiHo-T-2023-15) van de Stichting Universiteit voor Diergeneeskunde Hannover.
1. Coating van inzetstukken
OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd met steriel materiaal onder een veiligheidskast. Alle stappen van het protocol worden op ijs uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
- Ontdooi het bevroren basaalmembraan op ijs gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht op het ijs bij 4 °C. Meng het basaalmembraan 1:40 (v/v) met ijskoude, steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een conische buis.
- Haal de steriele platen met inleggers uit de verpakking. Voeg 200 μL basaalmembraanmengsel toe aan het apicale compartiment van elk inzetstuk.
- Plaats het deksel van de putplaat terug en incubeer gedurende ten minste 1,5 uur bij 37 °C, 5% CO2 in een broedmachine.
- Zuig de oplossing voorzichtig op voordat u de cellen zaait. Zorg ervoor dat de punt het membraan niet raakt tijdens het afzuigen.
2. Genereren van 2D organoïde monolagen
OPMERKING: Organoïden van de dikke darm van varkens worden gegenereerd en gekweekt zoals beschreven voor organoïden van jejunale varkens25. Na het genereren van 3D-organoïden moeten deze minimaal 3-4 weken worden gekweekt tijdens wekelijkse passering om een consistente groei te garanderen. Het aantal cellen in elke koepel met 3D-organoïden, die in de volgende stappen worden opgelost, is voldoende om een enkel transmembraanfilter te bedekken. Vóór het genereren van de monolaag werden de 3D-organoïden onderworpen aan een optische kwaliteitscontrole om de eerdere groei en mogelijke contaminatie te controleren (Figuur 1).
Figuur 1: Representatieve 3D-organoïden. Driedimensionale (A) jejunum- en (B) colon-organoïden worden zorgvuldig onder de microscoop onderzocht voordat monolagen worden gegenereerd. Speciale aandacht wordt besteed aan het beoordelen van eerdere groeipatronen, structurele integriteit en de aanwezigheid van onzuiverheden of vervuiling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verwijder het organoïde medium (Tabel 1) uit de putjes met 3D crypte organoïden. Voeg 1 ml ijskoude PBS per putje toe en los het basaalmembraan voorzichtig op door op en neer te pipetteren met een p1000 tip.
- Verzamel alle opgeloste organoïden in een tube van 15 ml, voorgevuld met 10 ml ijskoude PBS. Centrifugeer de buis bij 250 x g, 10 minuten bij 4 °C. Aspiratie van het bovenlevende.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml warme (37 °C) 0,05 % (v/v) trypsine/EDTA (in dit stadium kunnen 2 buisjes worden samengevoegd). Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C in een waterbad en leg daarna direct op ijs om de reactie te stoppen.
- Resuspendeer 20x op ijs met p1000 tip, en nog eens 15x met p1000 tip + p200 tip bovenop. Voeg 10 ml ijskoude DMEM toe aangevuld met 10% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS).
- Centrifugebuis bij 1.000 x g, 10 min bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet in 1 ml monolaags medium (tabel 1).
- Bepaal het aantal levende cellen per ml met behulp van een Neubauer-kamer volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder de coatingoplossing op dit punt uit het apicale compartiment en vervang deze door 500 μL warm (37 °C) monolaagmedium. Voeg 3 ml monolayer medium toe aan het basolaterale compartiment.
- Bepaal de blankweerstand (TEER) van elke lege transwell-inzetstuk, zoals in detail beschreven in stap 3. De tijd waarin er geen medium in de apicale kamer aanwezig is, moet zo kort mogelijk zijn om uitdroging van de cellen te voorkomen.
- Verwijder het apicale monolaagmedium en voeg voor de jejunale 2D-cultuur 2 x 105 epitheelcellen toe en voor de 2D-coloncultuur 1,5 x 105 epitheelcellen in 500 μL monolaags medium in de apicale kamer van elke transwell.
- Vervang het medium en meet de TEER elke 2-3 dagen. Meet TEER voordat het medium wordt vervangen. Zuig het medium van het apicale en basale compartiment voorzichtig op en vervang het door 500 μl of 3 ml vers, warm (37 °C) medium.
- Voor jejunum-organoïden: op dag 16, na het zaaien, overschakelen van monolaagmedium naar differentiatiemedium (tabel 1). Voor organoïden van de dikke darm: vervang het medium op dag 7 naar het differentiatiemedium.
- Vervang het differentiatiemedium elke dag en voer tijdens elke mediumwissel een TEER-meting uit. Ga op dag 18 (voor organoïden van jejunale organoïden) of dag 9 (voor organoïden van de dikke darm) na het zaaien verder met functionele experimenten.
3. Meting van transepitheliale elektrische weerstand (TEER)
LET OP: Alle metingen worden uitgevoerd onder een veiligheidskast om besmetting te voorkomen. Voordat de cellen worden gezaaid, wordt elke lege gecoate transwell gemeten om individuele blancowaarden te krijgen. De volt-ohmmeter slaat waarden op op een geïntroduceerd USB-apparaat.
- Reinig de eetstokjeselektrode met 70% (v/v) ethanol en laat de elektrode volledig drogen. Haal ondertussen de plaat uit de broedmachine en plaats deze onder de kast.
- Breng de korte arm van de eetstokjeselektrode in het apicale compartiment van de inserts en de lange arm in het basolaterale compartiment van het insert. Vermijd het contact van de korte arm met de cellaag.
- Meet de transepitheliale elektrische weerstand van elke transwell. Laat de volt-ohmmeter in evenwicht komen om een stabiele meting te garanderen. Meet TEER-waarden door op de knop Opslaan te klikken.
- Ga verder met stap 3.2 en 3.3 met de resterende putjes. Na het bereiken van de laatste put opent de volt-ohmmeter een verzoek om de gegevens op een USB-apparaat op te slaan. Klik op Opslaan.
- Reinig de elektrode na elke plaat en aan het einde van de meting en laat deze volledig drogen voordat u deze opbergt.
- Trek de lege waarden die zijn bepaald voordat de cellen worden geplaatst af van de gemeten cellulaire waarden.
4. Elektrofysiologisch transportonderzoek met behulp van de Ussing-kamertechniek
OPMERKING: Bepaling van elektrofysiologische transportstudies wordt uitgevoerd met behulp van een Ussing-kamer die bestaat uit twee kamercompartimenten, die worden gescheiden door het epitheel. Deze kamer is verbonden met een spanningsklem door middel van Ag/AgCl-elektroden. Deze techniek maakt het mogelijk om actieve elektrogene transportprocessen van het epitheel te volgen door de veranderingen in de kortsluitstroom (Isc) geïnduceerd door de spanningsklem en de weefselweerstand (Rt) berekend door de wet van Ohm. Isc en Rt worden gedurende het hele experiment elke 6 s geregistreerd. Tijdens het experiment wordt het onderzochte weefsel belucht met carbiogeen en geïncubeerd met gemodificeerde Krebs-Henseleit-oplossingen om levensvatbare omstandigheden te garanderen. Indomethacine (10 μM) wordt toegevoegd aan bufferoplossingen om de synthese van prostaglandine te remmen26.
- Warm mucosale en serosale bufferoplossingen op tot 37 °C en belucht met carbogen. Monteer de afzonderlijke kamers met behulp van een leeg inzetstuk voor elke afzonderlijke kamer. Zorg ervoor dat de apicale zijden van de transwells allemaal in dezelfde richting wijzen.
- Vul alle kamers met 5 ml voorverwarmde mucosale bufferoplossing (tabel 2). Sluit alle elektroden van de spanningsklem aan op de afzonderlijke kamers volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat er geen gasbellen in de elektroden zitten om een correcte meting te garanderen.
- Kalibreer de Ussing chamber-software met deze voorwaarden door op de Rf/dpI-knop in de voltage-clamp-software te klikken. De weerstand van alle gebruikte lege inzetstukken moet gelijk zijn (~ 70 Ohm) en de stroom moet rond de 0 mV (± 5 mV) liggen. Als dit voor sommige kamers niet het geval is, controleer dan of de elektroden of luchtbellen correct in het systeem zijn geplaatst.
- Verwijder alle elektroden en gooi de gebruikte bufferoplossing weg. Open alle afzonderlijke kamers en verwijder de lege inzetstukken. Zorg ervoor dat de volgorde van de afzonderlijke kamers wordt aangehouden.
- Verplaats de putplaat met inzetstukken van de broedmachine naar de veiligheidskast. Zuig het basolaterale en apicale medium voorzichtig op.
- Was de cellen door 500 μl warme (37 °C) slijmvliesbuffer toe te voegen aan de apicale kamer en 3 ml serosale buffer aan de basolaterale kamer. Zuig de buffers op en herhaal 2x.
- Verwijder de inzetstukken van de plaat. Verwijder voorzichtig de steunen van de inzetstukken. Plaats de wisselplaten in de gebruikskamers en zorg ervoor dat de oriëntatie van de wisselplaten hetzelfde is als tijdens de kalibratiefase. Zet de afzonderlijke kamers in elkaar zoals weergegeven in afbeelding 2.
- Vul de kamers die naar de basolaterale zijde van de cellen zijn gericht met 5 ml serosale buffer (tabel 2) en de kamer die naar de apicale kamer is gericht met 5 ml slijmvliesbuffer.
- Sluit de elektroden en de beluchtingsbuizen aan op elke afzonderlijke kamer. Start de meting in de Ussing-software. Laat het evenwicht 15 minuten duren.
- Verander de voorwaarden van open circuit naar kortsluiting. Evenwicht gedurende 5 minuten tot 10 minuten. Voeg 10 μM forskolin toe aan de serosale kamer.
OPMERKING: De toevoeging van forskolin kan worden vervangen door andere middelen/stoffen, afhankelijk van de individuele darmsegmenten en onderzoeksvragen. - Voeg na 15 minuten meer middelen toe op dezelfde manier als forskolin of stop de meting. Verwijder beluchtingsbuisjes en elektroden uit afzonderlijke kamers. Giet de bufferoplossingen van beide kamers in een kom.
- Demonteer de kamers en gooi de inserts weg of gebruik ze voor vervolganalyse (bijv. immunohistochemie of expressieanalyse)
Figuur 2: Schematische opbouw van de Ussing-kamer. Te zien zijn beide kamers gescheiden door het membraan met de gegroeide 2D monolaag. Beide kamers zijn belucht met carbogen; Spanning en stroom worden bewaakt door twee elektroden per kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Analyse van de gegevens die door de opstelling van de Ussing-kamer worden gegenereerd
- Importeer de gegevens die door de spanningstangsoftware worden gegenereerd in een geschikte spreadsheet-editor.
- Om basale I,sc - en Rt-waarden te bepalen, berekent u het gemiddelde van 10 opeenvolgende gegevenspunten die 10 minuten na het initialiseren van de kortsluitingsomstandigheden zijn genomen. Elke individuele kamer dient als een technische replicaat, terwijl elke passage van organoïden dient als een biologische replicaat.
- Om de effecten van toegepaste middelen te beoordelen, berekent u het gemiddelde van 10 opeenvolgende gegevenspunten onmiddellijk vóór de toevoeging van het middel. Vergelijk dit gemiddelde met de maximale (of minimale) waarde die wordt waargenomen nadat het middel is aangebracht. De verkregen gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol vergemakkelijkt de betrouwbare generatie van 2D-monolagen bij varkens door 3D-organoïden die zijn afgeleid van het jejunum en de dikke darm van varkens te desaggregeren. Over een teeltperiode van 16 dagen voor jejunum organoïden en 9 dagen voor colon organoïden worden intacte monolagen gevormd. Deze monolagen kunnen vervolgens worden gebruikt om elektrogene en fysiologische transporteigenschappen te beoordelen met behulp van de Ussing-kamertechniek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een methode voor het omzetten van gevestigde 3D-organoïden van varkens in afzonderlijke cellen, die vervolgens op transwellmembranen worden gezaaid om een intacte monolaag te vormen. Deze configuratie geeft toegang tot de apicale zijde van de cellen, waardoor het gebruik van Ussing-kamers wordt vergemakkelijkt om absorptie- en secretoire processen te bewaken.
De eerste en cruciale stap in dit meerstappenproces is het precieze uiteenvall...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We danken het federale ministerie van Voedsel en Landbouw (BLE # 28N-2-071-00) voor financiering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 well plate | SARSTEDT AG & Co. KG | 8,33,922 | |
| A83-01 | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-10432 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| accujet S | Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany | 26351 | |
| Advanced DMEM/F12 Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 12634010 | Bewaar bij 4 °C |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 17504044 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| CaCl2.2 H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | C3306 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| D(+)-Glucose (wasserfrei) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.08337 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| DAPT | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-13027 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| D-Mannitol | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M4125 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | 154938 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| Electrode-Set (AgCl/PtIr/Std.) | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | #1316 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf SE, Hamburg, Gemany | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf SE, Hamburg, Gemany | 3123000047 | |
| EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm Meter | World precision instruments, Sarasota, USA | EVM-MT-03-01 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | F7524 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| Forskolin | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | F6886 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| gasprofi 1 SCS micro | WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany | 60,04,000 | |
| Gastrin 1 | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-P1097 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 35050061 | Bewaar bij 4 °C. |
| HCl | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | 1090571000 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | H0887 | Bewaar bij 4 °C |
| Herasafe 2025 Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51033316 | |
| Incubator ICO105 | Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany | 62,20,143 | |
| Indomethacin | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | I7378 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| KCl | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.04936 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| L-Glutamin | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | G7513 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| LWRN Supernatant | selfmade | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig. LWRN supplement wordt geproduceerd volgens Miyoshi et al. (2012) | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning Incorporated - Life Sciences | 354234 | Bewaar bij -20 °C. Zorgvuldig ontdooi op ijs wanneer nodig |
| Megafuge 1.OR | Heraeus Instruments, Osterode, Germany | 75003060 | |
| MgCl2.6 H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05833 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| Na2HPO4.2H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06580 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | A7250 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| NaCl | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06404 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| NaH2PO4.H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06346 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| NaHCO3 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06329 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| Neubauer improved chamber | Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhön, Germany | 40442712 | |
| Olympus IX70 iverted Microscope | Olympus Corporation, Hamburg, Germany | ||
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 15140122 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| PolymyxinB | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | P4932-1MU | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| Primovert microscope stand with binocular phototube | Zeiss | 415510-1101-000 | |
| rm EGF | Prepotech, New Jersey, USA | 315-09 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| SB202190 | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-10295 | Bewaar bij -20 °C. Ontdooi wanneer nodig |
| Snapwell 3801 | Corning Incorporated - Life Sciences | 3801 | |
| Trypsin/EDTA | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 25300054 | |
| Ussing Base System | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | #1317 | |
| Ussing Diffusion Chamber | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | SKU 1307 | |
| Voltage/Current Clamp VCC6 | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | SKU 13 |
Referenties
- Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. , Academic Press. 367-406 (1997).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Pham, T. A., Lawley, T. D. Emerging insights on intestinal dysbiosis during bacterial infections. Curr Opin Microbiol. 17 (100), 67-74 (2014).
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140 (6), 859-870 (2010).
- Ternhag, A., Torner, A., Svensson, A., Ekdahl, K., Giesecke, J. Short- and long-term effects of bacterial gastrointestinal infections. Emerg Infect Dis. 14 (1), 143-148 (2008).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen & Co. Limited. London. (1959).
- Zietek, T., Boomgaarden, W. A. D., Rath, E. Drug screening, oral bioavailability and regulatory aspects: A need for human organoids. Pharmaceutics. 13 (8), 1280(2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
- Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell Tissue Res. 365 (1), 123-134 (2016).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell Tissue Res. 375 (2), 409-424 (2019).
- Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. J Virol. 93 (5), e01682-e01718 (2019).
- Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
- Yin, L., et al. Aminopeptidase N expression, not interferon responses, determines the intestinal segmental tropism of porcine deltacoronavirus. J Virol. 94 (14), e00480-e00520 (2020).
- van der Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Front Cell Dev Biol. 8, 375(2020).
- van der Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Res. 28, 165-171 (2018).
- Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23 (2-3), 110-127 (1951).
- Dengler, F., Kraetzig, A., Gabel, G. Butyrate protects porcine colon epithelium from hypoxia-induced damage on a functional level. Nutrients. 13 (2), 305(2021).
- Guschlbauer, M., et al. Trans-resveratrol and epsilon-viniferin decrease glucose absorption in porcine jejunum and ileum in vitro. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165 (3), 313-318 (2013).
- Herrmann, J., Hermes, R., Breves, G. Transepithelial transport and intraepithelial metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) in the porcine proximal colon are influenced by SCFA concentration and luminal pH. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 158 (1), 169-176 (2011).
- Klinger, S., Breves, G. Resveratrol inhibits porcine intestinal glucose and alanine transport: Potential roles of Na(+)/K(+)-ATPase activity, protein kinase A, AMP-activated protein kinase and the association of selected nutrient transport proteins with detergent resistant membranes. Nutrients. 10 (3), 302(2018).
- Leonhard-Marek, S., Hempe, J., Schroeder, B., Breves, G. Electrophysiological characterization of chloride secretion across the jejunum and colon of pigs as affected by age and weaning. J Comp Physiol B. 179 (7), 883-896 (2009).
- Schroeder, B., et al. Preventive effects of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection. Dig Dis Sci. 51 (4), 724-731 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), e0256143(2021).
- Ferreira, S. H., Moncada, S., Vane, J. R. Indomethacin and aspirin abolish prostaglandin release from the spleen. Nat New Biol. 231 (25), 237-239 (1971).
- Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in bovine organoid technology using small and large intestinal monolayer interfaces. J Vis Exp. (208), e67010(2024).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS One. 16 (10), e0257824(2021).
- Beduneau, A., et al. A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure. Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).
- Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine. J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).
- Pearce, S., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
- Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies. Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).
- Moeser, A. J., et al. Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).
- Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).
- Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).
- Herrmann, J., et al. Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).
- Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. Intestinal absorption in health and disease--sugars. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).
- Crane, R. K. Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues. Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).
- Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon. Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
