Het huidige protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor het analyseren van de ademhalingsmechanica van een ex vivo muizenmodel met behulp van de geforceerde oscillatietechniek (FOT).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van de longfunctie in een ex vivo muizenmodel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Respiratoire mechanica is een belangrijk studiegebied bij het definiëren en behandelen van longpathologieën door de functionele longcapaciteit te beoordelen. Longmechanica kan worden geëvalueerd door middel van verschillende longmanoeuvres waarbij verschillende oscillerende golfvormen betrokken zijn. Wanneer deze manoeuvres op de longen worden toegepast, meten ze meerdere variabelen, zoals druk, volume en stroming, op basis van de reactie op de golfvormen. Deze signalen worden vervolgens berekend en geanalyseerd om parameters zoals hysterisiviteit, weerstand, compliantie, weefseldemping en weefselelastantie te bepalen, waardoor een gedetailleerde beoordeling van de algehele longfunctie wordt verkregen. De analyse van respiratoire mechanica is vooral belangrijk bij het evalueren van donorlongen voor longtransplantatie. Het huidige protocol is het eerste in zijn soort en biedt een uitgebreide en reproduceerbare stapsgewijze methode voor het beoordelen van ademhalingsmechanica met behulp van een ex vivo muizenmodel. Het bevat details over het geselecteerde diermodel, longherstel, opslag en conservering, en experimenten met behulp van een op geforceerde oscillatietechniek gebaseerd systeem. Daarnaast schetst het gegevensanalyse, klinische significantie en de toepassingen van de geforceerde oscillatietechniek bij het bestuderen van een ex vivo model.
Inleiding
Longtransplantatie is de enige duurzame behandeling voor longziekten in het eindstadium. Wereldwijd krijgen jaarlijks ongeveer 4.600 mensen een longtransplantatie, maar bijna 600 patiënten sterven op de wachtlijst als gevolg van het tekort aan geschikte donorlongen 1,2. In een poging om de pool van beschikbare longen te vergroten, worden donortoewijzingssystemen voortdurend aangepast, wat ertoe heeft geleid dat chirurgen grotere afstanden hebben afgelegd om donororganen veilig te stellen3. De grotere afstanden verlengen steevast de koude ischemische tijd, waardoor er behoefte is aan aanvullende methoden voor het behoud van organen.
De huidige standaard voor de conservering van donororganen van longtransplantatie is koude statische conservering bij 4 °C, waarbij de conserveringstijd wordt beperkt tot 6-8 uur - een kleine levensvatbaarheid voor transplantatie4. Met langere reisafstanden en de daaruit voortvloeiende langere ischemische tijden is de beoordeling van de longfunctie voorafgaand aan transplantatie echter van cruciaal belang4. Met het evoluerende beleid voor longtransplantatie is er nieuw onderzoek gedaan om in deze behoefte te voorzien. Onlangs hebben studies gesuggereerd dat koude statische conservering bij 10 °C een meer optimale opslagtemperatuur is voor longconservering met als gevolg verbetering van de longfunctie, weerstand tegen letsel en vergelijkbare percentages van primaire transplantaatdisfunctie bij implantatie 4,5,6,7,8. Bovendien heeft onderzoek gericht op ex vivo longperfusie (EVLP) een significante verbetering aangetoond in het gebruik en de transplantaties van donorlongen zonder schade voor de ontvangers9. Hoewel het gebruik van EVLP voor het uitbreiden van de donorpool voor longtransplantatie en het verlengen van de conserveringstijd goed gedocumenteerd is, is deze technologie duur, tijdrovend en vereist het gespecialiseerde training om10 uit te voeren. Als zodanig is er behoefte aan aanvullende methoden om de ex vivo longfunctie te bestuderen die alomvattend, goedkoop en reproduceerbaar zijn.
Traditionele metingen van longmechanica, zoals compliantie-, weerstands-, elastantie- en druk-volumecurves, kunnen betrouwbaar worden bepaald met behulp van lichaamsplethysmografie of met beademingstechnieken met behulp van een model met één compartiment. Meer gedetailleerde mechanica kan worden verkregen met behulp van het geforceerde oscillatiemodel om te passen in het constante fasemodel, dat luchtwegmechanica kan verdelen in centrale en perifere compartimenten (Newtoniaanse weerstand, weefseldemping/elastantie, hysteresiviteit)11. Hoewel de toepassing van deze technieken reproduceerbaar en alomvattend is, was een beperking tot nu toe de vereiste om dergelijke maatregelen in een in-vivomodel uit te voeren, vermoedelijk omdat de verbloede long structuur verliest bij de alveolaire ingangsring12. Deze studie maakte gebruik van een in de handel verkrijgbare geforceerde oscillatietechniek gebaseerde ventilator voor kleine knaagdieren met als doel een ex vivo model te ontwikkelen om de longmechanica voor longtransplantatietoepassingen beter te karakteriseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie is goedgekeurd door de Commissie voor dieronderzoek in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Er werden C57Bl/6 wildtype muizen gebruikt, 6-8 weken oud en met een gewicht tussen 18-28 g. Details van de reagentia en apparatuur zijn te vinden in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding
- Gebruik een operatiemicroscoop met een vergroting tot 20x voor alle chirurgische ingrepen.
- Reinig en steriliseer alle chirurgische instrumenten voordat u met de procedure begint. Autoclaaf instrumenten of gebruik een geschikte sterilisatieoplossing om aseptische omstandigheden te handhaven.
2. Extractie van donorlongen
- Voer alle handelingen uit onder steriele omstandigheden.
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd in een speciale operatieruimte en onder steriele omstandigheden. - Plaats de muis in een anesthesie-inductiekamer en induceer anesthesie met 5% isofluraan in zuurstof en handhaaf de anesthesie met 3.5% isofluraan in zuurstof gedurende de hele procedure (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Registreer het gewicht van de muis voorafgaand aan de eerste incisie.
- Zet de muis vast op de operatietafel en zorg voor de juiste diepte van de verdoving door druk uit te oefenen op een teen. Als de muis zich terugtrekt van de pijn, verhoog dan de anesthesie indien nodig.
- Verwijder de longen van de donor volgens de standaardprocedure13.
OPMERKING: De longen en het hart werden en block geëxtraheerd om de longen ex vivo te perfuseren, en een deel van de luchtpijp werd verwijderd voor latere intubatie.
3. Opslag en conservering van de longen
- Zodra de longen van de donor zijn verwijderd, intubeert u de luchtpijp met een intraveneuze angiokatheter van 18 G door de katheter voorzichtig naar voren te brengen en ervoor te zorgen dat deze de luchtpijp niet doorboort.
- Zet de luchtpijp vast over de canule met behulp van een 3-0 zijden hechtdraad, waardoor een goede afdichting ontstaat. Beweeg de 18 G intraveneuze angiokatheter naar voren totdat deze zich in het rechterventrikeluitstroomkanaal (RVOT) bevindt, net voorbij de longklep.
- Noteer de tijd dat de longen uit het lichaam zijn verwijderd.
- Bewaar de longen een nacht bij 4 °C of 10 °C in een conische buis van 50 ml met de in de handel verkrijgbare conserveringsoplossing.
4. Installatie en kalibratie
- Begin met het inschakelen van het systeem en/of de software.
- Start het programma, klik op de knop Een nieuwe studie maken en volg de aanwijzingen op het scherm om het protocol te definiëren en proefpersonen toe te wijzen.
- Klik op Experimenteersessie en log in met de eerste en laatste initialen van de gebruiker.
- Begin met het labelen van onderwerpen volgens een consistente naamgevingsconventie.
- Voer het geslacht, de geboortedatum en het gewicht van elke proefpersoon in.
- Selecteer en wijs onderwerpen toe aan de meetlocatie en bevestig gewichten.
- Ga door met het instellen en kalibreren van de software door de aanwijzingen op het scherm te volgen.
OPMERKING: Tijdens de kalibratie van de slang werd hetzelfde type canule dat werd gebruikt bij de intubatie van de donorlongen bevestigd aan de Y-slang van het systeem om consistentie te garanderen. - Herhaal de kalibratie als de kalibratiewaarden buiten het geaccepteerde bereik vallen.
- Annuleer prompts om met beademing te beginnen totdat u klaar bent. Experimentele sessies met ventilatie en gegevensregistratie kunnen later worden gestart.
5. Longventilatie en data-acquisitie
- Verwijder de longen uit de conische buis van 50 ml. Spoel het rechterventrikeluitstroomkanaal (RVOT) met behulp van de eerder geplaatste 18 G intraveneuze angiokatheter met extra conserveringsoplossing in een dosis van 60 ml/kg om de longcapillairen te spoelen.
OPMERKING: Er moet grote zorg worden besteed aan het voorkomen van uitdroging van donorlongen, aangezien dit een bekende confounder is bij het bestuderen van longmechanica. - Bevestig de donorlongen aan de ventilatormachine en begin met het experiment.
- Klik op Start Ventilation en als u klaar bent, drukt u op Start Recording om de experimentele sessie te starten.
OPMERKING: Het beademingsapparaat dat voor dit onderzoek werd gebruikt, zou een ademhalingsfrequentie hebben van 150 ademhalingen/min, een ademvolume van 10 ml/kg en een PEEP van 3. - Voer elke taak uit door te dubbelklikken op de taak voor beoordelingen van longmechanica in de takenlijst aan de rechterkant van de pagina.
- Voer de Deep Inflation-taak uit die zich in de takenlijst bevindt om er verder voor te zorgen dat atelectatische regio's worden gerekruteerd en longvolumes zijn gestandaardiseerd. Zie de sectie Resultaten voor meer informatie.
- Ga verder met de volgorde van taken.
OPMERKING: De longfunctie kan worden beoordeeld aan de hand van meerdere taken die de mechanische eigenschappen evalueren. Deep Inflation standaardiseert het longvolume, terwijl Prime-8 de longmechanica stabiliseert. PV-P en PV-V meten statische en dynamische compliantie, luchtwegweerstand en geleiding. Snapshot 150 biedt een snelle beoordeling van weerstand, compliantie en duurzaamheid, terwijl QuickPrime de luchtweg- en weefselweerstand evalueert, samen met de visco-elasticiteit van de longen. Deze taken zorgen samen voor een uitgebreide analyse van de longfunctie. In dit artikel worden de gegevens voor de taken die zijn uitgevoerd in Deep Inflation, Snapshot 150 en QuickPrime (met behulp van in de handel verkrijgbare apparatuur) verstrekt als representatieve resultaten. Longvolumes werden gestandaardiseerd tussen verstoringen met behulp van de Deep Inflation-taak om verstorende variabelen bij het interpreteren van de gegevens te minimaliseren. - Voer de gekozen reeks taken in drievoud uit.
- Klik op Opname stoppen en vervolgens op Ventilatie stoppen.
- Exporteer gegevens afzonderlijk of ga verder naar het volgende onderwerp en herhaal stap 5.1-5.9.
OPMERKING: Voor gegevens die zijn afgeleid van de Snapshot 150- en QuickPrime-verstoringen is een COD van >0,95 vereist voor een betrouwbare analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een grafische weergave van het experimentele ontwerp is voorzien voor het muismodel (Figuur 1). De longen werden opgeblazen met behulp van een in de handel verkrijgbaar beademingssysteem voor kleine knaagdieren op basis van geforceerde oscillatietechniek om de ademhalingsmechanica van het donorweefsel onder verschillende omstandigheden te beoordelen (Figuur 2). Bij het vergelijken van de resultaten tussen de groepen geconserveer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Belang en mogelijke toepassingen
Ademhalingsmechanica wordt routinematig gebruikt in verschillende toepassingen om longpathologie en longbeschadiging te bestuderen. De studie van ademhalingsmechanica is vele malen beschreven voor de progressie van ziekten zoals ARDS en in gevallen van geassisteerde beademing, maar is veel minder beschreven in de literatuur als het gaat om orgaantransplantatie 15,16,17,18,19.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die ten onrechte kunnen worden opgevat als een belangenconflict.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Sophie Paczensy bedanken voor het gebruik van het beademingssysteem en Colin Welsh voor zijn hulp. Figuur 1 is gemaakt met behulp van biorender.com. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het South Carolina Clinical and Translational Institute (NIH/National Center for Advancing Translational Sciences) onder toekenningsnummer UL1-TR001450.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 18 G angio-catheter | B. Braun | 4251687-02 | Straight hub |
| 24 G angio-catheter | B. Braun | 4251601-02 | Straight hub |
| 3 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| 3-0 silk suture | Medex | ETH-A304H | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher | 339652 | |
| 70% EtOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Harvard Apparatus | 75-2030 | Luchtdichte inductiekamer voor ratten |
| Anesthesia machine | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobiel anesthesiesysteem met passieve opvang |
| Anesthesia mask | Harvard Apparatus | 59-8255 | Anesthesiemasker voor ratten |
| Blunt micro forceps | World Precision Instruments | 501217 | Dressing forceps, 12,5 cm, recht, gekarteld |
| C57Bl/6 muizen | Charles River | Strain Code 027 | Wild type, 6-8 weken, 18-28g |
| Digitale weegschaal | Fisher Scientific | S72422 | |
| FlexiVent systeem | Scireq | NC2926059 | ventilator voor kleine knaagdieren op basis van gedwongen oscillatietechniek |
| Insulinespuit, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Isofluraan, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Operatiemicroscoop of chirurgische loep | AmScope | SM-3BZ-80S | 3,5x - 90x Stereomicroscoop |
| Perfadex-oplossing | Xvivo | 19811, 19850 | |
| Petrischalen | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Steriele katoenen watten | Puritan | 25-806 1WC | |
| Steriele gaasjes | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Chirurgische schaar | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum schaar |
Referenties
- Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
- Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
- Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
- Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
- Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
- Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
- Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
- Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
- Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
- Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
- Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
- Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
- Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
- Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
- Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
- Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
- Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
- Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
