Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van geneesmiddelgevoeligheid en geneesmiddelinteracties in Mycobacterium tuberculosis met behulp van Resazurin Microtiter en Checkerboard-assay

924 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67672

⸱

24 oktober 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de resazurine-microtitertest (REMA) en de dambordvariant te visualiseren en te standaardiseren voor het evalueren van de gevoeligheids- en interactieprofielen voor geneesmiddelen van Mycobacterium tuberculosis. Deze methode geeft in vitro inzichten voor het optimaliseren van geneesmiddelcombinaties voor gebruik in behandelingsregimes en het bestrijden van multiresistente tuberculose.

Samenvatting

De opkomst van multiresistente tuberculose (MDR-TB) vereist snelle en nauwkeurige methoden voor het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen (DST) om een effectieve behandeling te begeleiden. Deze studie introduceert een methodologie die de resazurine-microtitertest (REMA) en de dambordtest combineert om de minimale remmende concentratie (MIC) te bepalen en geneesmiddelinteracties van antituberculosegeneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren. De REMA, aangepast aan een formaat met 96 putjes, maakt gebruik van de vermindering van resazurinekleurstof door metabolisch actieve M. tuberculosis als een visuele indicator van de gevoeligheid voor geneesmiddelen. Variërende concentraties van anti-tbc-geneesmiddelen worden getest tegen M. tuberculosis-isolaten en kleurveranderingen worden waargenomen om de MIC te bepalen. Vervolgens wordt een dambordtest gebruikt om mogelijke synergetische, additieve of antagonistische effecten tussen geneesmiddelcombinaties te beoordelen. Deze eenvoudige en goedkope methode levert binnen zeven dagen resultaten op en biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van traditionele DST-methoden. Deze methode biedt waardevolle inzichten in de DST van M. tuberculosis-isolaten en vergemakkelijkt de identificatie van veelbelovende geneesmiddelcombinaties voor betere behandelingsresultaten tegen MDR-TBC.

Inleiding

Tuberculose (tbc), veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis, blijft een formidabele wereldwijde gezondheidsuitdaging, verergerd door de opkomst van resistente stammen. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) waren er in 2023 naar schatting 10,6 miljoen nieuwe gevallen van tuberculose en 1,3 miljoen sterfgevallen, wat de dringende behoefte aan effectievere diagnostische en therapeutische strategieën benadrukt1. Multiresistente tuberculose (MDR-tbc) en extensief resistente tuberculose (XDR-tbc) vormen grote uitdagingen voor ziektebestrijding vanwege de complexiteit, toxiciteit en langere duur van de huidige behandelingsregimes 2,3.

De recente introductie van nieuwe anti-tbc-middelen, zoals bedaquiline en delamanid, gericht op unieke biochemische routes in M. tuberculosis, betekent een doorbraak in de behandeling van tbc 4,5. Deze geneesmiddelen zijn voornamelijk goedgekeurd voor gebruik in gevallen van fluorchinolon- en rifampicine-resistente tuberculose als onderdeel van door de WHO goedgekeurde langere en kortere MDR-tbc-regimes 6,7. Het bepalen van optimale geneesmiddelcombinaties en doseringsregimes, vooral wanneer deze middelen worden gebruikt in combinatie met gevestigde therapieën, blijft echter een cruciaal onderzoeksgebied 8,9. De huidige methoden voor het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen (DST) zijn weliswaar betrouwbaar, maar vaak tijdrovend, arbeidsintensief en onpraktisch voor het evalueren van complexe geneesmiddelencombinaties in een klinische of onderzoeksomgeving10. Dit onderstreept de behoefte aan eenvoudige, schaalbare fenotypische assays die zowel de werkzaamheid van geneesmiddelen als de interactieprofielen in M. tuberculosis kunnen evalueren.

Onder dergelijke fenotypische benaderingen is de resazurine-microtitertest (REMA) naar voren gekomen als een algemeen aanvaarde en conventionele methode voor het beoordelen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen. De test is gebaseerd op de reductie van de blauwe resazurinekleurstof tot roze resorufin door metabolisch actieve bacteriën, die dienen als een visuele indicator van de levensvatbaarheid van cellen. Hoewel gepopulariseerd door Palomino et al. in 200211, gaat het principe van het gebruik van resazurine om bacteriegroei te beoordelen terug tot het werk van Pital et al.12. In de afgelopen twee decennia is de REMA-methode uitgebreid gevalideerd en opgenomen in de standaardprocedures voor mycobacterieel onderzoek en diagnostische tests 13,14,15.

Als aanvulling op de REMA breidt de dambordtest, zoals geïntroduceerd door Caleffi-Ferracioli et al., het nut van REMA uit door studies naar interactie tussen twee geneesmiddelen in een microdilutieformaat mogelijk te maken met behulp van dezelfde op resazurine gebaseerde uitlezing16. Hoewel deze methode in principe veelbelovend is, blijft het in de eerste plaats een onderzoeksinstrument dat nuttig is voor het screenen van potentiële synergetische of antagonistische geneesmiddelcombinaties tijdens vroege preklinische evaluatie in plaats van een routinematige diagnostische test.

Dit manuscript presenteert REMA of zijn dambordvariant niet als nieuwe methoden. Het doel van deze studie is eerder om een visuele weergave te geven van een bruikbare en gevalideerde methodologie voor MIC-bepaling en het testen van geneesmiddelinteracties, die in eerdere studies is beschreven en met succes is toegepast. We bieden een stapsgewijs protocol met gedetailleerde richtlijnen voor de voorbereiding van inoculum, het titreren van geneesmiddelen, de lay-out van de plaat, de interpretatie van de MIC en de analyse van dambordinteracties. Dit manuscript heeft tot doel een breder, consistenter gebruik van REMA- en dambordtesten te ondersteunen bij de ontwikkeling van tbc-geneesmiddelen en experimentele farmacologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Chemicaliën en materialen die in de voorbeeldexperimenten worden gebruikt, zijn beschikbaar in het bestand Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van 7H9-S media

  1. Weeg voor 100 ml 7H9-S-media 0,47 g 7H9-poeder en 0,1 g casiton af en los vervolgens op in 90 ml gedestilleerd water; Roer tot het volledig is opgelost.
  2. Steriliseer de bouillon in een kolf van 250 ml met behulp van een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten.
  3. Eenmaal geautoclaveerd en afgekoeld, voeg 10 ml Oleic Albumine Dextrose Catalase (OADC) supplement en 0,5 ml glycerol toe.
  4. Incubeer een nacht bij 37 °C om de steriliteit te controleren.
    OPMERKING: De steriliteit van het bereide 7H9-S-medium wordt gecontroleerd door het een nacht bij 37 °C te incuberen. Het medium zou de volgende dag helder moeten blijven en er mag geen troebelheid worden waargenomen.
  5. Bewaar de 7H9-S medium bij 4 °C, uit de buurt van direct licht.

2. M.tuberculose Inoculum preparaat

  1. Preparaat van inoculum van M.tuberculosecultuur geteeld in Lowenstein Jensen (LJ) vast medium
    1. Verzamel met behulp van een steriele inoculatielus een volledige lus van M. tuberculosis-cultuur van een vers gekweekt (21-28 dagen oud) LJ-medium.
      OPMERKING: Schraap voorzichtig niet te diep in het medium, dit kan oudere kolonies verstoren.
    2. Doe de verzamelde bacteriën in een steriele bijou-fles met steriele glasparels en 2,5 ml 7H9-S-bouillon. Zorg ervoor dat de glasparels helpen bij het mechanisch verstoren van klonten tijdens het vortexen.
      OPMERKING: Verse culturen tussen 21-28 dagen zijn essentieel om betrouwbare gevoeligheidstestresultaten te garanderen. Vermijd het gebruik van oudere culturen, omdat deze tot inconsistente resultaten kunnen leiden.
    3. Zet de bijou-fles en de vortex krachtig vast gedurende minimaal 1 minuut. Zorg voor continu mengen om bacteriële klonten te breken, wat resulteert in een relatief troebele suspensie. Het doel is een homogene verdeling van bacteriën binnen het medium.
    4. Doe de kweeksuspensie in een verse bijoufles en laat deze 15 minuten ongestoord staan. Door deze stap kunnen de grotere bacterieklonten zich op de bodem nestelen.
    5. Gebruik de McFarland 1.0-standaard als referentie, controleer de troebelheid van de kweeksuspensie en pas aan met 7H9-S-bouillon totdat de gewenste troebelheid is bereikt.
      OPMERKING: Een McFarland-standaard, meestal 1.0, wordt gebruikt als referentie voor troebelheid gelijk aan ongeveer 1.97 × 106 CFU/ml17. De norm wordt bereid door 0,1 ml 1% bariumchloride en 9,9 1 ml 1% zwavelzuur te combineren, wat resulteert in een fijn neerslag van bariumsulfaat, dat voor de troebelheid zorgt. De bacteriële suspensie wordt visueel vergeleken met de McFarland Standard door beide buizen tegen een witte achtergrond met zwarte lijnen te houden. De troebelheid van de bacteriële suspensie is aangepast aan de standaard.
  2. Preparaat van inoculum van M.tuberculosecultuur gekweekt in 7H9 vloeibaar medium
    1. Breng met behulp van een steriele pipet 2,5 ml M. tuberculosiscultuur (2-3 weken oud) over in een vers bijou-flesje met glasparels.
    2. Draai het mengsel gedurende ten minste 1 minuut om een homogene suspensie te garanderen. De vortex-actie helpt om eventuele klonten te breken.
    3. Doe de 2,5 ml kweeksuspensie in een verse bijou-fles en laat deze 15 minuten staan om de klontjes op de bodem te laten bezinken.
    4. Vergelijk de troebelheid met de McFarland 1.0 Standard en pas aan met 7H9-S bouillon om de vereiste concentratie te bereiken.
  3. Verdunning van het entmateriaal
    1. Bereid een verdunning van 1:10 voor: Om het entmateriaal te verdunnen, voegt u 1 ml van de bacteriële suspensie toe aan 9 ml 7H9-S-bouillon in een steriele container (dit geeft ongeveer 1,97 × 105 CFU/ml).

3. Bereiding van antibiotica en opslag

  1. Bereiding van bouillon en werkoplossingen: Bereid de medicijnen die in het voorbeeldexperiment zijn gebruikt, samen met hun bereidingsmethoden voor bouillon en werkoplossing, zoals samengevat in tabel 1.
    1. Isoniazide (INH of I): Om een 1 mg/ml stockoplossing van isoniazide te bereiden, lost u 2 mg isoniazidepoeder op in 2,0 ml gedestilleerd water. Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
    2. Moxifloxacine (MOX of M): Om een 1 mg/ml stockoplossing van Moxifloxacine te bereiden, lost u 2 mg moxifloxacinepoeder op in 2,0 ml gedestilleerd water. Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
    3. Bedaquiline (BDQ of J): Bedaquiline is slecht oplosbaar in water. Om een stockoplossing van 1 mg/ml te bereiden, lost u 2 mg bedaquilinepoeder op in 2,0 ml DMSO. Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
    4. Delamanid (DEL of D): Net als bedaquiline heeft delamanid een slechte oplosbaarheid in water. Om een stockoplossing van 1 mg/ml te bereiden, lost u 2 mg delamanidpoeder op in 2,0 ml DMSO. Steriliseer de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm.
  2. Opslag: Aliquoot 100 μL van elke medicijnvoorraadoplossing in steriele cryovials en bewaar ze bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden. Eenmaal ontdooid, gooi je de resterende oplossing weg. Niet opnieuw invriezen.

4. Bereiding van Resazurin-oplossing en opslag

  1. Los resazurine op tot een eindconcentratie van 0,01% of 0,02% in gedestilleerd water. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm voor sterilisatie.
  2. Bewaar de gesteriliseerde resazurine-oplossing maximaal 1-2 weken bij 4 °C, beschermd tegen licht om degradatie te voorkomen.

5. Voorbereiding van de REMA-plaat

NOTITIE: Raadpleeg afbeelding 1 voor een visuele handleiding voor de opstelling van de REMA-microtiterplaat met 96 putjes. De plaat met 96 putjes biedt voldoende ruimte om medicijntesten in tweevoud uit te voeren voor elk medicijn in zes tweevoudige verdunningen.

  1. Voeg 7H9-S-bouillon toe: Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL 7H9-S-bouillon toe aan de kolommen 2-11, rijen BG. Zorg ervoor dat de verdeling gelijkmatig is over alle putten.
  2. Geneesmiddeloplossingen toevoegen: Voeg 100 μL van de werkende INH-oplossing toe aan putjes B2 en B6. Voeg op dezelfde manier de MOX-, DEL- en BDQ-werkoplossingen toe aan hun respectievelijke putten (B3 en B7, B4 en B8, B5 en B9).
  3. Verdun de geneesmiddelconcentraties: Voer met behulp van een meerkanaalspipet tweevoudige seriële verdunningen uit van de rijen B tot G (kolommen 2-9), waarbij u ervoor zorgt dat de laatste 100 μl na het mengen in rij G wordt weggegooid.
  4. Groeicontroleputjes: Voeg 100 μL 7H9-S-bouillon toe aan putjes B10 en C10 voor de groeicontrole.
  5. Negatieve en steriliteitscontroles: Voeg 200 μL 7H9-S-bouillon toe aan putjes B11 en C11 om te dienen als negatieve en steriliteitscontroles.
  6. Verdamping voorkomen: Voeg 200 μL steriel gedestilleerd water toe aan alle buitenste putjes om verdamping tijdens incubatie te minimaliseren.
  7. Inoculeerplaten: Inoculeer elk putje met 100 μl van de 1:10 verdunde kweeksuspensie, met uitzondering van het negatieve controleputje. Zorg voor een uniforme inoculatie in alle putjes.
  8. Afdichten en incuberen: Sluit de platen af in plastic zakken om de steriliteit te behouden en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 °C.

6. REMA titratietest dambord

OPMERKING: Raadpleeg Figuur 2A, B voor een visuele handleiding over het REMA-sjabloon voor dambordtitratietest voor geneesmiddelcombinaties (bijv. BDQ en DEL).

  1. Verdun geneesmiddelen verticaal en horizontaal: Verdun het eerste geneesmiddel (BDQ) verticaal (rijen B-H) en het tweede geneesmiddel (DEL) horizontaal (kolommen 2-8) om verschillende combinaties van twee geneesmiddelen te genereren.
    OPMERKING: Bereid de serieel verdunde werkoplossing in een steriele injectieflacon (van 4 μg/ml - 0,06 μg/ml) voor een geneesmiddel dat horizontaal wordt verdund.
  2. BDQ-werkoplossing voor verticale verdunning toevoegen: Voeg 100 μL van de werkende BDQ-oplossing toe aan putje B2 en B8.
  3. 7H9-S-bouillon toevoegen: Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 50 μL 7H9-S-bouillon toe aan de kolommen C2-H8. Zorg ervoor dat de verdeling gelijkmatig is over alle putten.
  4. Verdun de geneesmiddelconcentraties: Voer met behulp van een meerkanaalspipet tweevoudige verdunningen uit de rijen B-H (kolommen 2-8) uit, waarbij u ervoor zorgt dat de laatste 50 μl na het mengen in rij H wordt weggegooid.
  5. Voeg DEL-werkoplossing toe voor horizontale verdunning: Voeg serieel verdunde werkoplossingen van de geneesmiddelen van 4 μg/ml tot 0,06 μg/ml toe aan de overeenkomstige putjes.
  6. Groeicontroleputjes: Voeg 100 μL 7H9-S-bouillon toe aan putjes B9 en C9 voor de groeicontrole.
  7. Negatieve en steriliteitscontroles: Voeg 200 μL 7H9-S-bouillon toe aan putjes B10 en C10 om te dienen als negatieve en steriliteitscontroles.
  8. Inoculeerplaten: Inoculeer elk putje met 100 μl van de 1:10 verdunde kweeksuspensie, met uitzondering van het negatieve controleputje. Zorg voor een uniforme inoculatie in alle putjes.
  9. Afdichten en incuberen: Sluit de platen af in plastic zakken om de steriliteit te behouden en incubeer gedurende 7 dagen bij 37 °C.

7. Incubatie en interpretatie van de resultaten

  1. Resazurinekleuring: Voeg na 7 dagen incubatie 30 μL resazurine (0,01%-0,02%) toe aan elk putje. Sluit de plaat af en incubeer deze een nacht voor kleurontwikkeling.
  2. Interpreteer kleurverandering.
    1. Onderzoek de putten visueel onder constant wit licht of daglichtgebalanceerde verlichting.
      OPMERKING: De groeicontrole (geen geneesmiddel) moet blauw naar roze worden, wat wijst op een actief bacterieel metabolisme. Een blauwe kleur duidt op volledige remming van de groei. Roze staat voor actieve groei, terwijl paars (een gemengde tint) staat voor gedeeltelijke remming.
    2. Vergelijk de intensiteit van de kleur met zowel de negatieve controle (alleen media) als de positieve controle (bacteriegroei zonder medicijn) voor een nauwkeurige interpretatie. Om de vooringenomenheid van de waarnemer te minimaliseren, gebruikt u dubbele onafhankelijke metingen of plaatfotografie.
      OPMERKING: Het visuele oordeel kan variëren afhankelijk van de omgevingslichtomstandigheden, dus consistente verlichting is essentieel.
  3. Minimale remmende concentratie (MIC)
    1. Definieer MIC als de laagste concentratie van het geneesmiddel waarbij de put volledig blauw blijft, wat wijst op ≥99% remming van de metabole activiteit. Overweeg putten met een paarse of roze kleur, wat wijst op gedeeltelijke of volledige groei.
      OPMERKING: De MIC-bepaling door REMA benadert de principes van de klassieke verhoudingsmethode, waarbij de MIC wordt beschouwd als de laagste concentratie die ≥99% van het inoculum remt ten opzichte van de geneesmiddelvrije controle. Hoewel REMA geen CFU-tellingen gebruikt, vertegenwoordigt het visuele eindpunt een fenotypische correlatie van deze op verhoudingen gebaseerde drempel. Deze interpretatie komt overeen met eerder vastgestelde colorimetrische protocollen11,14.

8. Berekening van de fractionele remmende concentratie (FIC) Index

OPMERKING: De fractionele remmende concentratie (FIC)-index helpt bij het bepalen van de interactie tussen twee geneesmiddelen (synergie, antagonisme of onverschilligheid). Het wordt berekend op basis van de MIC-waarden die zijn verkregen uit de dambordtest.

  1. Identificeer de MIC voor elk geneesmiddel afzonderlijk: Bepaal aan de hand van de REMA-test de MIC voor elk geneesmiddel bij afzonderlijk gebruik.
  2. Identificeer de MIC voor elk geneesmiddel in combinatie: Identificeer aan de hand van de dambordtitratietest de MIC van elk geneesmiddel bij gebruik in combinatie met het tweede geneesmiddel.
  3. Bereken de FIC voor elk medicijn.
    OPMERKING: Raadpleeg Tabel 2 voor de formules die worden gebruikt om de FIC- en FIC-index te berekenen. Tabel 3 toont de geconsolideerde MIC op basis van de REMA-test. Representatieve MIC- en FIC-indexwaarden worden weergegeven in tabel 4.
    1. Interpreteer de FIC-index als volgt:
      FIC ≤ 0,5: Geef synergie aan - de medicijnen werken samen om de groei effectiever te remmen dan elk medicijn afzonderlijk.
      FIC > 0,5 tot < 4,0: Geef additiviteit aan - het gecombineerde effect is gelijk aan de som van de afzonderlijke effecten.
      FIC ≥ 4.0: Geef antagonisme aan - de medicijnen interfereren met elkaars activiteit.
  4. Voorbeeld: Bereken de FIC-index voor BDQ en DEL in H37Rv
    1. Bepaal de MIC van BDQ voor H37Rv (bijv. 0,125 μg/ml). In combinatie met DEL registreert u de MIC van BDQ als 0,03 μg/ml.
    2. Bepaal de MIC van DEL voor H37Rv (bijv. 0,063 μg/ml). In combinatie met BDQ registreert u de MIC van DEL als 0,125 μg/ml.
    3. Bereken FIC voor BDQ:
      FIC (BDQ) = MIC van BDQ in combinatie/MIC van BDQ alleen = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. Bereken FIC voor DEL:FIC(DEL) = MIC van DEL in combinatie / MIC van DEL alleen = 0,125 / 0,063 = 1,98
    5. Voeg beide FIC's toe om de FIC-index te verkrijgen:FIC-index = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0,24 + 1,98 = 2,26
    6. Interpreteer het resultaat.
      OPMERKING: Een FIC-index van 2,26 valt binnen het additieve interactiebereik (>0,5 tot <4,0), wat aangeeft dat de combinatie van BDQ en DEL een additief effect heeft op de groeiremming van M. tuberculosis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bepaling van MIC van anti-TB geneesmiddelen door middel van REMA-assay
De activiteiten van Bedaquiline, Delamanid, Moxifloxacine en Isoniazide werden geëvalueerd met behulp van REMA tegen geneesmiddelgevoelig H37RV en geneesmiddelresistent klinisch isolaat van M. tuberculosis. Bedaquiline, Delamanid en Isoniazide werden gebruikt in het concentratiebereik van (1 μg/ml tot 0,03 μg/ml) en moxifloxacine lag in het bereik van (2 μg/ml tot 0,06 μg/ml). De bacteriël...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De wereldwijde dreiging van resistente tuberculose (DR-TBC) is een urgent probleem geworden 1,19. Dit heeft geleid tot een dringende behoefte aan de ontwikkeling van verbeterde, snelle methoden voor het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen (DST), met name voor tweedelijns en nieuwere anti-tbc-geneesmiddelen. Dergelijke methoden zijn essentieel om behandelingsstrategieën te verbeteren, anti-tbc-medicijnen effectief te be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
250 mL square bottle with capSchott Duran218203655Media preparation
7H9 brothBecton Dickinson271310Growth media for M. tuberculosis (Room temparature)
96-well plate with lidCorning359696-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Room temparature)
ART-Tips (1000 μL)TARSONS528106Hydrophobic polyethylene filters with  Polypropylene Racked Filter Tip-Sterile (Room temparature)
ART-Tips (200 μL)TARSONS528104Hydrophobic polyethylene filters with  Polypropylene Racked Filter Tip-Sterile (Room temparature)
Barium chloride dihydrateMerck217565McFarland Standard preparation (Room temparature)
Bedaquiline (BDQ)Jansen and JansenGift from Jansen and JansenAnti-TB drug (4 °C)
CasitoneBecton Dickinson225930Supplement for bacterial culture (Room temparature)
Delamanid (DEL)Otsuka PharmaceuticalsGift from Otsuka PharmaceuticalsAnti-TB drug (4 °C)
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich67-68-5Drug stock preparation (Room temparature)
Filter 0.2 μmMilliporeSLGVR33RS0.22  μm PVDF,disposable, sterile syringe filter (Room temparature)
GlycerolMerck356350Added to culture media (Room temparature)
Inoculating LoopSigma-AldrichI8263For culture suspension preparation (Room temparature)
Isoniazid (INH)Sigma-AldrichI3377-5GAnti-TB drug (4 °C)
LJ medium SlantBD Mycobactosel221414Growth media for M. tuberculosis (4 °C)
McCartney Bijou Narrow Mouth bottle, 14 mLSupertek12.124.0014For culture suspension preparation (Room temparature)
McCartney Bijou Narrow Mouth bottle, 7 mLSupertek12.124.0007For culture suspension preparation (Room temparature)
Micropipettes (1000 μL)GilsonF144059MFor precise liquid handling (Room temparature)
Micropipettes (200 μL)GilsonFA10005MFor precise liquid handling (Room temparature)
Moxifloxacin (MOX)Sigma-AldrichSML1581-50MGAnti-TB drug (4 °C)
Multichannel pipette(20–200 μL)VWR849070024For simultaneous pipetting across wells
OADCBecton Dickinson211886Supplement for bacterial culture (4 °C)
Pipette fillersMerckZ333980For precise liquid handling (Room temparature)
Resazurin sodium saltSigma-Aldrich62758-13-8Redox indicator for REMA assays (Room temparature)
Serological pipettes,10 mLCorningCLS4100Sterile, polystyrene disposable pipettes were used (Room temparature)
Solid-glass beads, diam. 6 mmSigma-AldrichZ265950For culture suspension preparation (Room temparature)
Sulfuric acid 95–97%Merck100731McFarland Standard preparation (Room temparature)
Syringes for filterDispo Van100032For use with syringe filters
Vortex MixerREMICM-101 PLUSFor culture suspension preparation
Zipper-top poly bagSigma-AldrichZ162949

Referenties

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/9789240083851 (2023).
  2. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug-resistant tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 74, 101574(2021).
  3. Alame Emane, A. K., Guo, X., Takiff, H. E., Liu, S. Highly transmitted M. tuberculosis strains are more likely to evolve MDR/XDR and cause outbreaks, but what makes them highly transmitted. Tuberculosis. 129, 102092(2021).
  4. Koul, A., et al. Delayed bactericidal response of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline involves remodelling of bacterial metabolism. Nat Commun. 5, 3369(2014).
  5. Matsumoto, M., et al. OPC-67683, a nitro-dihydro-imidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice. PLoS Med. 3 (11), e466(2006).
  6. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 4. treatment drug-resistant tuberculosis treatment. , World Health Organization. At https://www.who.int/publications/i/item/9789240063129 (2020).
  7. Conradie, F., et al. Treatment of highly drug-resistant pulmonary tuberculosis. N Engl J Med. 382 (10), 893-902 (2020).
  8. Lechartier, B., Hartkoorn, R. C., Cole, S. T. In vitro combination studies of benzothiazinone lead compound BTZ043 against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 56 (11), 5790-5793 (2012).
  9. Mallikaarjun, S., et al. Delamanid coadministered with antiretroviral drugs or anti-tuberculosis drugs shows no clinically relevant drug-drug interactions in healthy subjects. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5976-5985 (2016).
  10. Pai, M., Nicol, M. P., Boehme, C. C. Tuberculosis diagnostics: State of the art and future directions. Microbiol Spectr. 4 (5), (2016).
  11. Palomino, J. -C., et al. Resazurin microtiter assay plate: Simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  12. Pital, A., Pital, R. C., Leise, J. M. A rapid method for determining the drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Am Rev Tuberc. 78 (1), 111-116 (1958).
  13. Präbst, K., Engelhardt, H., Ringgeler, S., Hübner, H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 1601, 1-17 (2017).
  14. Schön, T., et al. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex isolates - the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination. Clin. Microbiol. Infect. 26 (11), 1488-1492 (2020).
  15. Singh, S., et al. Rapid identification and drug susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis: Standard operating procedure for non-commercial assays: Part 3: Colorimetric Redox Indicator Assay v1.3.12. J Lab Physicians. 4 (2), 120-126 (2012).
  16. Caleffi-Ferracioli, K. R., Maltempe, F. G., Siqueira, V. L. D., Cardoso, R. F. Fast detection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboard resazurin method. Tuberculosis. 93 (6), 660-663 (2013).
  17. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis growth: a correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-290 (2013).
  18. Chandramohan, Y., et al. In vitro interaction profiles of the new antitubercular drugs bedaquiline and delamanid with Moxifloxacin against clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Glob Antimicrob Resist. 19, 348-353 (2019).
  19. Hameed, H. A., et al. Characterization of genetic variants associated with rifampicin resistance level in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected in Guangzhou Chest Hospital, China. Infect Drug Resist. 15, 5655-5666 (2022).
  20. Lienhardt, C., et al. New drugs for the treatment of tuberculosis: Needs, challenges, promise, and prospects for the future. J Infect Dis. 205, S241-S249 (2012).
  21. Anoopkumar-Dukie, S., et al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells. Br J Radiol. 78 (934), 945-947 (2005).
  22. Baker, C. N., Thornsberry, C., Hawkinson, R. W. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J Clin Microbiol. 17 (3), 450-457 (1983).
  23. McFarland, J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J Am Med Assoc. XLIX (14), 1176(1907).
  24. Bellio, P., Fagnani, L., Nazzicone, L., Celenza, G. New and simplified method for drug combination studies by checkerboard assay. MethodsX. 8, 101543(2021).
  25. Martin, A., Camacho, M., Portaels, F., Palomino, J. C. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: Rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob Agents Chemother. 47 (11), 3616-3619 (2003).
  26. Zhao, L., et al. Evaluation of BACTEC MGIT 960 system for the second-line drugs susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in China. J Microbiol Methods. 91, 212-214 (2012).
  27. Said, H. M., et al. Comparison between the BACTEC MGIT 960 system and the agar proportion method for susceptibility testing of multidrug resistant tuberculosis strains in a high burden setting of South Africa. BMC Infect Dis. 12, 369(2012).
  28. Caviedes, L., Delgado, J., Gilman, R. H. Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40 (5), 1873-1874 (2002).
  29. Mouton, J. W., Vinks, A. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modelling of antibacterials in vitro and in vivo using bacterial growth and kill kinetics. Clin Pharmacokinet. 44 (2), 201-210 (2005).
  30. Sychev, A. V., Lavrova, A. I., Dogonadze, M. Z., Postnikov, E. B. Establishing compliance between spectral, colourimetric and photometric indicators in resazurin reduction test. Bioengineering. 10 (8), 962(2023).
  31. Postnikov, E. B., Sychev, A. V., Lavrova, A. I. Dose-response curve in REMA test: Determination from smartphone-based pictures. Analytica. 5 (4), 619-631 (2024).
  32. Mehlawat, N., Chakkumpulakkal Puthan Veettil, T., Sharpin, R., Wood, B. R., Alan, T. Ultrafast and ultrasensitive bacterial detection in biofluids: Leveraging resazurin as a visible and fluorescent spectroscopic marker. Anal Chem. 96 (45), 18002-18010 (2024).
  33. Grosset, J., Truffot-Pernot, C., Lacroix, C., Ji, B. Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifampin against tuberculosis infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 36 (3), 548-551 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Minimale Remmende ConcentratieMultiresistente TuberculoseGevoeligheidstesten voor GeneesmiddelenAntituberculosemiddelenSynergetische Geneesmiddeleffecten

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.