Verbeterde methodologie voor vloeistofafgifte aan de muizenlong: intubatie met behulp van een consumentenotoscoop

Samenvatting

Dit protocol laat zien hoe het optimaal positioneren van een muis en het transoraal inbrengen van een op camera's gebaseerde otoscoop visualisatie van de glottis, snelle intubatie met minimaal weefseltrauma en consistente vloeistofafgifte aan de longen mogelijk maakt.

Samenvatting

Consistente toediening van vloeistoffen, inclusief mogelijke therapieën, aan de longen is van cruciaal belang voor het modelleren van longziekten en preklinische therapeutische ontwikkeling. De huidige methoden die bij muizen worden gebruikt - zoals orofaryngeale aspiratie door de tongtrekmethode - kunnen echter resulteren in variabele afgifte. Hier beschrijven we het gebruik van een betaalbare, aan een mobiele telefoon gekoppelde, verlichte otoscoop om de glottis te visualiseren en directe inoculatie in de luchtwegen mogelijk te maken. We beschrijven een geoptimaliseerde ensceneringstechniek met voldoende belichting en positioneringshulpmiddelen. Er wordt ook beschreven hoe intubatie betrouwbaar kan worden uitgevoerd met behulp van een flexibele katheter van 20 G met of zonder glasvezellicht. Deze techniek vermindert de variantie in intrapulmonale toediening aanzienlijk en verhoogt het volume van de toegediende vloeistof die de longen bereikt. Vanwege de verminderde variantie kunnen kleinere diercohorten worden gebruikt bij het gebruik van deze methode in plaats van orofaryngeale instillatie door de tongtrekmethode. Wat volgt is een methode voor effectieve, snelle en consistente intubatie van muizen en toediening aan de longen, inclusief robuuste bevestiging van de plaatsing van de endotracheale tube. Met deze verbeterde methodologie zijn consistente, veilige intubatie en repliceerbare, efficiënte toediening aan de longen binnen handbereik.

Inleiding

Wereldwijd zijn aandoeningen van de luchtwegen doodsoorzaak nummer één bij kinderen jonger dan 5 jaar en zijn ze een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij volwassenen¹. In 2021 was SARS-CoV2-infectie de derde belangrijkste doodsoorzaak in de VS². Muismodellen worden vaak gebruikt om longziekten te bestuderen, waaronder astma, longontsteking, chronische opdringerige longziekte en longfibrose. Bijna al deze modellen vereisen de afgifte van vloeibare middelen aan de longen. Dit kan worden gedaan door directe canulatie van de luchtpijp (meestal onder directe visualisatie met behulp van een chirurgische cut-down-techniek), intranasale toediening of orofaryngeale aspiratie door de gevestigde tongtrekmethode ^3,4,5. Deze technieken hebben echter allemaal nadelen. Vorming van littekenweefsel na de chirurgische cut-down-techniek maakt het ongeschikt voor onderzoeken die herhaalde toediening van middelen aan de longen vereisen, en de laatste twee technieken kunnen leiden tot variabele longafgifte. Bovendien kan bij gebruik van de tongtrekmethode weefseltrauma aan de tong worden uitgesproken en is de toedieningsefficiëntie afhankelijk van de onderzoeker die de procedure uitvoert, zie figuur 1.

Figuur 1: Geleide intubatie en IT-instillatie resulteren in een betere afgifte aan de longen en minder variabiliteit in vergelijking met tongtrek. (A) Drie verschillende onderzoekers leverden 50 μL verdunde Oost-Indische inkt af door tongtrek, de gevestigde methode voor orofaryngeale (OP) toediening. Twee onderzoekers leverden ook inkt aan de long met behulp van intubatie zoals beschreven. (B) De longen werden 1-4 uur na de bevalling verwijderd en gefotografeerd onder een vergroting van 2x. Foto's werden beoordeeld op het gekleurde gebied, met behulp van ImageJ. (n=6 (intubatie) of 9 (OP-toediening), resultaten van 2 of 3 onafhankelijke replicaten door 2 -3 verschillende onderzoekers, p<0,0001 Welch's T-test) (C) De variabiliteit in longtoediening werd ook berekend als een procentuele afwijking van het gemiddelde. De toediening van de OP was veel variabeler. (p = 0.0317, Welsh's T-Test, GraphPad Prism 10.2.3 alle statistieken en grafieken) (C57BL/6J Mannelijke en vrouwelijke muizen werden gebruikt, ze waren ~ 10 weken oud.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De anatomie van muizen maakt intubatie moeilijk en tijdrovend. De mond is klein en het buccale weefsel kan het zicht van een onderzoeker op de rima glottidis⁶ belemmeren. Verder zijn de stemplooien erg klein en kan het een uitdaging zijn om ze te bekijken omdat ze dicht bij de basis van de tong liggen. Ten slotte is het moeilijk om de juiste plaatsing van de endotracheale tube te bevestigen, omdat het kleine ademvolume er vaak niet in slaagt een spiegel te beslaan⁷. Deze moeilijkheden hebben een reeks innovatieve technieken aangemoedigd om muizen te intuberen. Deze verbeterde methoden omvatten het gebruik van een neonatale laryngoscoop en draad om een katheter in de luchtpijp te brengen ^8,9, het gebruik van een glasvezellichtbron om de katheter te geleiden en te verstijven^10,11, en het gebruik van een live videofeed⁶. Meer recentelijk heeft het gebruik van een klinische otoscoop geholpen bij orotracheale intubatie¹². Anderen hebben transilluminatie gebruikt om de glottis- en intubermuizen te visualiseren ^7,13,14. Er zijn echter veel nadelen aan deze methoden. Het gebruik van ontharingsmiddelen in de nek van de muis en de nabijheid van dieren tot een hete lichtbron maken transilluminatie een minder dan ideale aanpak. Het gebruik van de naald in de katheter of het inbrengen van scherpe instrumenten in de mond betekent dat sommige methoden om de katheter te verstijven dieren in gevaar brengen. Ten slotte heeft het maken van een incisie over de luchtpijp om de plaatsing te bevestigen aanzienlijke nadelen, waaronder de noodzaak van steriliteit en de opbouw van littekenweefsel. Tot nu toe is intratracheale instillatie door intubatie te moeilijk gebleken voor wijdverbreide toepassing¹⁵ en de vooruitgang in methodologische ontwikkeling is door veel laboratoria in silo's en ongebruikt gebleven¹⁵. Verdere studies hebben zich gericht op de keuze van anesthetica tijdens de bevalling, waarbij werd vastgesteld dat ketamine voordelen kan hebben ten opzichte van isofluraan⁵. Isofluraan, dat geen gereguleerde stof is en snel slijt na voltooiing van de procedure, bood echter aantrekkelijke voordelen, dus hebben we deze vorm van anesthesie gebruikt terwijl we andere aspecten van deze methodologie optimaliseerden^16,17.

De methode die we beschrijven overwint de visualisatie-uitdagingen die anderen hebben geprobeerd aan te pakken, beperkt de risico's voor proefdieren, verkort de tijd die nodig is om kleine hoeveelheden intratracheaal via een endotracheale tube te druppelen, vergroot het vloeistofvolume dat de long bereikt en biedt een verbeterde methode voor bevestiging van het plaatsen van de endotracheale tube. Met behulp van een ophangstandaard, magnetische helpende handen (krokodillenklemmen op flexibele armen die aan een basis zijn bevestigd) en helderdere verlichting kan een individuele onderzoeker een efficiënte intratracheale toediening uitvoeren. Visualisatie wordt gemakkelijker gemaakt met behulp van een 'thuis' otoscoop met WIFI-connectiviteit. Dit apparaat is goedkoper dan commerciële intubatie-instrumenten. Bovendien maakt de WIFI-connectiviteit een gelijktijdige videofeed mogelijk op een draagbaar apparaat (zoals een mobiele telefoon), waardoor het geschikt is voor training. Intubatie kan gebruik maken van een glasvezellichtbron die door een flexibele (PTFE) katheter van 20 g x 1" wordt geleid (naald verwijderd) of de katheter zonder het licht. De diepte wordt op twee manieren geregeld: de toevoeging van een intubatieveiligheidswig (een conische beschermkap op de katheter) en diepteobservatie in de videofeed. De plaatsing van de endotracheale tube wordt bevestigd met behulp van de "bubbelmethode" om het ademvolume duidelijker te visualiseren dan de traditionele spiegelmistmethode¹⁸. Dit is minder stressvol voor het dier dan te vertrouwen op tracheale obstructie om de ademhalingsurgentie¹⁰ aan te passen om de plaatsing te bevestigen. Het gecombineerde gebruik van een verlengslang gekoppeld aan de katheter om succesvolle intubatie te bevestigen (hierna de bubbelmethode genoemd), vereenvoudigd van Watanabe et. al⁷, en een video-otoscoop voor consumenten in een enkele procedure maakt intubatie tot een praktische methode voor therapeutische toediening aan de longen en een duidelijke verbetering van de tongtrekmethode (zie figuur 1). Als u op zoek bent naar een betrouwbare, consistente en betaalbare methode voor niet-chirurgische vloeistofafgifte in de longen van muizen, vooral zonder het gebruik van gereguleerde stoffen (zoals ketamine) of dure apparatuur, kan de volgende methode ideaal zijn.

Protocol

Het is absoluut noodzakelijk dat deze procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC), vermeld in het protocol, en dat veterinair personeel wordt geraadpleegd voordat verder wordt gegaan. De IACUC van onze instelling keurde het protocol goed voordat het experiment werd gestart en beoordeelde de video-inhoud voordat deze werd ingediend. Ondersteuning en training werden ontvangen via het Tulane Department of Comparative Medicine om de hoogste standaard van zorg voor al onze proefdieren te garanderen.

1. Instellen

OPMERKING: Zie afbeelding 2 voor de opstelling.

Figuur 2: Het station dat wordt gebruikt voor geleide intubatie is voorbereid zoals afgebeeld. Van links: pipetten voor toediening, bellenbuis voor bevestiging van de juiste plaatsing van de endotracheale buis, pincet, spatel, pediatrisch neusspeculum (besproken maar niet nodig voor deze procedure), helpende handen, vergrootglas, muizenstandaard met neuskegel, glasvezelsonde, anesthesie-inductiekamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Reinig de veiligheidswig die bij de intubatiekit is geleverd met een isopropanol-preppad. Schuif de schone veiligheidswig (groen in de video) op de 20 G flexibele canule en gooi de meegeleverde naald veilig weg.
   OPMERKING: De gebruikte intubatiekit voor knaagdieren (materiaaltabel) bevat intubatieveiligheidswiggen. Dit zijn kleine, conische hulzen die over een flexibele katheter van 20 G x 1 inch passen. Ze voorkomen dat de katheter de carina beschadigt.
2. Verzamel de andere benodigde hulpmiddelen, waaronder een mobiele telefoon, een in de handel verkrijgbare otoscoop, een muisstandaard met een neuskegel, een fijn gekartelde gebogen tang, de voorbereide endotracheale tube (vanaf 1.1) en het glasvezellicht als u het gebruikt. Reinig deze allemaal met isopropanol prep pads voor gebruik.
3. Neem ongeveer 20 cm flexibele slang mee. Buig het in een U-vorm, voeg aan het ene uiteinde een Luer-lock-verbinding toe en zet het vast met een kabelbinder. Voeg 200-300 μL steriel gefilterd water of Oost-Indische inkt toe aan de buis. Hierna wordt deze assemblage een "bubbelbuis" genoemd.
4. Maak een hechtlus door ~13 cm van maat 0 gevlochten zijden hechtdraad in een cirkel te binden. Plaats deze lus aan de bovenkant van de standaard en zorg ervoor dat beide zijden van de hechtdraad goed vastzitten en dat de standaard schoon is. Plaats de muisstandaard op de voet van de metalen loeplamp. Plaats de helpende handen rond de plek waar de mond van de muis zal zijn.
   OPMERKING: Veel leveranciers maken verwisselbare stands (zie Materiaaltabel), en er kan er een goedkoop in het lab worden gemaakt ^4,7,14. Maat 0 gevlochten zijden hechtdraad werd gebruikt om het dier op te hangen. Het gebruik van andere materialen voor hetzelfde doel is echter beschreven ^4,13.
5. Plaats een muis in de anesthesie-inductiekamer. Gebruik een constant debiet O₂ van 0,8 l/min en 2% isofluraan. Verdoof het dier voldoende (zie toelichting) zodat het niet wakker wordt tijdens het plaatsen van de neuskegel. Onderdruk de ademhalingsfrequentie van de muis niet significant. Regelmatige ademhalingen helpen bij de waardering van de stemplooien.
   OPMERKING: De ademhalingsfrequentie van de muis moet normaal zijn. Dit criterium wordt gebruikt om de juiste diepte van de anesthesie vast te stellen. Dit kan per dier verschillen en kan meer dan 200 ademhalingen per minuut bedragen. Als zodanig is het niet praktisch of nodig om ademhalingen te tellen of een teenknijp te gebruiken.
   LET OP: Deze procedure kan indien nodig worden afgebroken. Dieren mogen echter niet langer in de inductiekamer blijven dan strikt noodzakelijk is.
6. Sluit de otoscoop aan op een mobiele telefoon en zorg ervoor dat de videofeed stabiel is.
   LET OP: Om de blootstelling van de onderzoekers aan isofluraan tijdens deze procedure te minimaliseren, gebruikt u een chemisch ademhalingsapparaat als u meerdere intubaties uitvoert of traint in deze methode. U kunt de procedure ook uitvoeren in een zuurkast.

2. Dieren ensceneren

1. Zodra het eerste dier slaapt, haalt u het uit de inductiekamer, klot het af en plaatst u zijn boventanden op de lengte van de hechtdraad. Oefen lichte spanning uit op het dier om de positie van de hechtdraad te behouden terwijl u de muis weer op de standaard legt.
   LET OP: Gemiddeld worden dieren in totaal 2 minuten verdoofd inclusief inductie. Dit vermindert het risico voor het dier aanzienlijk, maakt oogheelkundige smering overbodig en voorkomt speekselophoping. Werk eraan om dieren zo min mogelijk verdoofd te houden.
2. Pas de hoek van de hals iets naar achteren aan (plaats de hals in kleine extensie, 5°-15°). Duw de neuskegel voorzichtig over de neusgaten. Duw de kegel niet stevig naar beneden, omdat dit de hechting kan verstoren en de muis kan ophangen.
3. Pak de tong zo dicht mogelijk bij de onderlip stevig vast met behulp van een grote, fijn gekartelde gebogen tang. Trek het naar beneden en weg van de boventanden naar één kant van de ondertanden.
   LET OP: Langdurige tractie, overmatige spanning of het verbrijzelen van de tong kunnen de gezondheid van de dieren in gevaar brengen. Controleer de tong op tekenen van trauma (blauwe plekken, bloedingen, zwellingen of uitdroging) en breek de procedure af en waarschuw het veterinair personeel indien waargenomen.
4. Als u helpende handen gebruikt, ondersteun dan de tang in deze positie. Afhankelijk van de ervaring en gezichtsscherpte van de onderzoeker, kan een verlicht vergrootglas helpen om het dier op de juiste manier te positioneren.
5. Voer de glasvezellamp (indien gebruikt) door de flexibele katheter met de intubatieveiligheidswig (groen in de video) op zijn plaats.
   NOTITIE: Bevestig de glasvezelkabel niet te strak aan de lichtbron. Te hard duwen maakt het moeilijk om het licht te verwijderen terwijl de endotracheale tube op zijn plaats blijft.

3. Visuele waarneming van de stembanden en intubatie

1. Met de otoscoop in de niet-dominante hand, drukt u deze lichtjes op de tong. Richt vervolgens de camera en de lichtbron in een hoek om de stembanden bij de basis van de tong zichtbaar te maken.
   OPMERKING: Kleine variaties in anatomie en weefselkleur kunnen het oriënteren bemoeilijken. Gebruik de beweging die gepaard gaat met ademen om structurele identificatie te bevestigen.
2. Met het glasvezellampje aan (indien gebruikt), voedt u de canule langs de bovenkant van de otoscoop, waarbij u licht contact maakt met de basis van de tong of het lipgedeelte van de otoscoop ter referentie. Schuif het in de mond van de muis tussen het zachte pallet en de lip van de otoscoop.
   NOTITIE: Als het glasvezellampje niet wordt gebruikt, kan de in stap 4 beschreven "bubbelbuis" in dit stadium aan de katheter worden bevestigd. Heldere, gerichte verlichting in de mond van de muis is nodig voor deze aanpassing van de procedure.
3. Pas de naderingshoek aan zodat de katheter erg ondiep is. Onmiddellijk na het inbrengen van de katheter (minder dan 1 mm voorbij de stemplooien), tilt u de punt van de katheter op, zodat deze bijna evenwijdig is aan het werkblad. Dit voorkomt dat de epiglottis de katheter dorsaal in de slokdarm dwingt. Vooral tijdens de training, wanneer men problemen ondervindt, of in het begin van de ervaring, is het gebruik van de videofeed van onschatbare waarde bij het plaatsen van de endotracheale tube tussen de stemplooien.
   OPMERKING: Speekselproductie belemmert het zicht op de stemplooien niet tijdens het voltooien van deze procedure. Het gebruik van een katoenen applicator met speerpunt om belemmerend speeksel te verwijderen, is echter in eerdere publicaties beschreven bij het intuberen van ratten¹⁹. Deze methode kan nuttig zijn als speeksel een probleem wordt.
   1. Als er weerstand wordt ondervonden, verwijder dan onmiddellijk de katheter en laat de ademhaling weer normaal worden. Als er een bloeding wordt waargenomen, raadpleeg dan het veterinair personeel.
      OPMERKING: Er mag bijna geen weerstand zijn bij het optillen van de katheter.

4. Bevestiging van de plaatsing van de endotracheale tube

1. Controleer visueel of de endotracheale tube zich op de juiste plaats bevindt met behulp van de otoscoop. Zorg verder voor de juiste plaatsing van de buis door er rekening mee te houden dat de luchtpijp tijdens het plaatsen minder weerstand biedt dan de slokdarm. Merk op dat de endotracheale tube zich in de juiste positie ~5 mm voorbij de stemplooien bevindt. Zoek naar licht van de glasvezelbron dat door de nekhuid schijnt om nogmaals te valideren dat de plaatsing correct is.
   OPMERKING: De intubatieveiligheidswig moet voorkomen dat de endotracheale tube te ver wordt ingebracht. De veiligheidswig voorkomt trauma aan de carina; Het hoeft echter geen vooruitgang in de weg te staan. Het moet worden gebruikt als een veiligheidsvoorziening en de optimale diepte is vaak ondieper dan toegestaan door de wig.
2. Verwijder vervolgens, terwijl u de endotracheale tube op zijn plaats houdt, de glasvezellamp. Zorg voor de juiste plaatsing van de katheter met behulp van de "bubbelmethode" (hieronder beschreven) in plaats van het beslaan van de spiegel.
3. Haal de bellenbuis op die in stap 1.3 is voorbereid. Bereid het voor op de procedure en hergebruik het voor alle dieren.
   LET OP: De 200-300 μL water of inkt in de bellenbuis mag nooit worden aangezogen. Om dit te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de vloeistof zich ver van het Luer-slot bevindt.
4. Terwijl de endotracheale tube op zijn plaats zit, zet u de bellentube op zijn plaats met behulp van de Luer-vergrendeling. Het teugvolume zou onmiddellijk duidelijk moeten zijn. Zo niet, dan is de endotracheale tube misplaatst. Verwijder het snel en laat de normale ademhalingsfrequentie van de muis terugkeren.
   LET OP: Als u de katheter verkeerd in de slokdarm plaatst, wordt de luchtpijp samengedrukt, waardoor onvoldoende ademhaling wordt voorkomen. Misplaatsing gaat vaak gepaard met moeizame ademhaling (inclusief een aanzienlijke bijdrage van de intercostale spieren) en/of een dramatisch verminderde ademhalingsfrequentie. Bovendien kan het canuleren van de slokdarm leiden tot een spierspasme waardoor de daaropvolgende intubatie wordt bemoeilijkt; Om deze reden adviseren wij het gebruik van meerdere dieren tijdens de training.

5. Intratracheale toediening

LET OP: Net als de tongtrekmethode voor orofaryngeale toediening, bestaat het risico dat het dier verdrinkt bij toediening via intubatie. Bij adolescente en volwassen muizen is 50 μL over het algemeen een veilige hoeveelheid vloeistof om af te geven en is het voldoende om zich door de longen te verspreiden.

1. Als u een spuit gebruikt voor toediening: Maak de bellenslang en de Luer-vergrendeling los van de katheter, bevestig een geladen Luer-slipspuit en druk op de zuiger om het gewenste volume af te geven (maximaal 50 μl).
2. Als u een pipet gebruikt voor toediening: Pipetteer het gewenste volume (maximaal 50 μl) rechtstreeks in de katheter en laat de muis de oplossing inhaleren.
   OPMERKING: Overweeg tijdens het trainen een indicator te gebruiken, zoals verdunde, gefilterde Oost-Indische inkt of methyleenblauw.
3. Om een diffuse afgifte aan de longen te garanderen, spoelt u de toegediende vloeistof in de longen met maximaal 500 μL lucht²⁰. Dit kan worden gedaan met behulp van een voorgeladen 0,5 ml Luer lock-spuit of een P1000-pipettor die is uitgerust met een filtertip, die beide betrouwbaar zijn gebleken. Indien gewenst kunnen meerdere keren depressieën van de pipettor worden uitgevoerd zonder het risico te lopen dat de geleverde vloeistof negatief wordt aangezogen.
   LET OP: Als u het dier met deze methode inoculeert, overweeg dan om de inoculumconcentratie te verlagen vanwege een verhoogde toedieningsefficiëntie ten opzichte van orofaryngeale aspiratie of intranasale toediening.
   OPMERKING: Gebruik van meer dan het ademvolume (~200 μL) kan nodig zijn bij het spoelen van het inoculum met lucht. Het gebruik van 500 μL brengt echter geen risico op barotrauma met zich mee, aangezien het slechts ongeveer de helft van de vitale capaciteit is²¹. Volwassen muizen hebben een inspiratoire reservecapaciteit van ongeveer ~800 μL, dus zelfs als de muis vlak voor het spoelen heeft geïnspireerd, treedt barotrauma niet op²¹. Overweeg of lagere luchtspoelvolumes geschikt zijn voor uw behoeften voor de verdeling van het entmateriaal (100-200 μL is voorgesteld).

6. Beoordeling van de oplevering

OPMERKING: Dit wordt alleen gedaan als men de procedure traint of oefent.

1. Euthanaseer het dier op humane wijze volgens het goedgekeurde IACUC-protocol. CO₂ -verstikking als primaire methode voor euthanasie en cervicale dislocatie als bevestigende methode voor euthanasie werden hier gebruikt.
2. Open de borstwand en verwijder de longen. Doe dit door het buikvlies te openen, vanaf de caudale zijde toegang te krijgen tot het middenrif en het met een kleine schaar te doorboren waar het hart te zien is. Hierdoor zullen de longen zich terugtrekken en meer ruimte geven om de borstholte te openen door de ribben door te snijden.
   OPMERKING: Als perfusie nodig is om het bloed in de longen te verminderen, voer dan in dit stadium de procedure uit via de rechterventrikel van het hart.
3. Spoel de longen kort met 1 ml steriel PBS na verwijdering. Leg ze plat op een wit oppervlak (zoals een chirurgische spons) om het maximale oppervlak bloot te leggen met behoud van de relatieve lobpositionering.
4. Fotografeer de longen ex vivo (we gebruikten een mobiele telefoon), open de afbeeldingen in ImageJ en kwantificeer de gekleurde en niet-bevlekte gebieden door de omtrek van het kleurstoffront te volgen. Kwantificeer het gekleurde gebied met behulp van een onafhankelijke geblindeerde onderzoeker om vooringenomenheid te voorkomen.
   OPMERKING: Bij gebruik van luminescentie en de IVIS, zoals weergegeven in afbeelding 3, moet in vivo live-beeldvorming worden uitgevoerd in plaats van stap 6.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 1 en figuur 3, resulteerde intrapulmonale inoculatie met behulp van de traditionele tongtrekmethode (orofaryngeale toediening) in fragmentarische inconsistente inktverdeling en een grotere variabiliteit tussen onderzoekers. Daarentegen leidde IT-instillatie na intubatie tot een consistentere afgifte aan zowel de rechter- als de linkerlongen en was deze minder variabel (Figuur 1C en Figuur 3D). In de longen van dieren die inkt krijgen door orofaryngeale aspiratie met behulp van tongtrek, is de inkt subtiel en alleen aanwezig in de buurt van de grote luchtwegen van dieren (Figuur 1A). Toen daarentegen geleide intubatie werd gebruikt om inkt af te geven, verspreidde deze zich veel verder in het weefsel en markeerde het een veel groter deel van de longen. Toen het longoppervlak dat met inkt was gekleurd werd vergeleken tussen methoden, bleek de intubatiemethode veel beter te zijn dan tongtrekken (Figuur 1B). De variabiliteit in de hoeveelheid inktafgifte was ook drastisch lager in de intubatieconditie (Figuur 1C). De toegenomen kleuring van het longgebied en de lagere variabiliteit in de hoeveelheid vloeistof die de longen bereikt, suggereerden sterk dat IT-afgifte superieur is aan tongtrek.

Zoals te zien is in video 1, hebben traditionele endoscopen (zoals eerder gepubliceerd) een te lange brandpuntsafstand om de stemplooien te waarderen en de plaatsing van de endotracheale tube te begeleiden ^6,19. Daarentegen hadden videobeelden gemaakt met een consumentenotoscoop (Figuur S1 en tijdstempels: 6:34 en 7:05 in de video) een veel betere resolutie, wat leidde tot een betere visualisatie van de glottis.

Deze intubatiemethode omvat meerdere verificaties van de plaatsing van de buis in de luchtpijp. Het ademvolume van de muis was duidelijk zichtbaar bij het gebruik van de bellenmethode (Figuur S2 en tijdstempel: 8:25) en fungeert als een laatste garantie dat alle afgeleverde vloeistof de longen zal binnendringen.

Om de variantie van de twee toedieningsmethoden verder te beoordelen, hebben we de transgenexpressie in longweefsel beoordeeld nadat muizen waren geïnoculeerd met 1 x 10¹¹ vg AAV6.2-Luciferase met behulp van de twee verschillende methoden (orofaryngeale instillatie door de tongtrekmethode of intratracheale toediening na geleide intubatie). Zeven dagen na toediening van de vector werden luminescentiemetingen uitgevoerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) (Figuur 3A). Vervolgens berekenden we de gemiddelde straling over beide longen. 10 minuten voorafgaand aan de beeldvorming (blootstelling van 30 s) werden ze (subcutaan) geïnjecteerd met 200 μl luciferine (15 mg/ml). Zoals te zien is in figuur 3B, hadden dieren die de vector kregen door orofaryngeale instillatie een lichtgevend signaal dat wijd verspreid was in zowel de borstkas als het neusgebied. Daarentegen vertoonden dieren die de vector kregen via intratracheale toediening met behulp van geleide intubatie geconcentreerde luminescentie in de longen. De gemiddelde straling bij geïntubeerde dieren was aanzienlijk groter in vergelijking met orofaryngeale toediening, wat wijst op een verbeterde efficiëntie van de vectorafgifte aan de longen en verminderde variabiliteit in toediening, berekend aan de hand van het verschil met het gemiddelde (Figuur 3C en Figuur 3D).

De positieve resultaten van de intubatiemethode waren reproduceerbare instillatie tot 50 μl in de longen van de muis (uitgevoerd in figuur 1 en figuur 3), met diffuse verdeling door de long (zoals blijkt uit figuur 1) en niet in andere gebieden (zoals de bovenste luchtwegen/neus zoals te zien in figuur 3).

Eventuele schade aan het dier, onnodige stress, verminderd vloeistofvolume dat de longen bereikt, slechte verdeling van het entmateriaal in de longen of langdurige trainingsbehoeften zouden een negatief resultaat zijn geweest, maar hebben zich niet voorgedaan.

Video 1: Een traditioneel endoscopisch beeld van de orofarynx van de muis en de stemplooien is onscherp en moeilijk effectief te gebruiken. De brandpuntsafstand van 3 cm van deze endoscoop betekent dat de stemplooien en oriëntatie moeilijk te waarderen zijn. Tong linksonder. Klik hier om deze video te downloaden.

Figuur 3: Intubatie levert een grotere afgifte aan de longen op met minder variabiliteit ten opzichte van de O.P.-aspiratie. (A) 6-10 weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen werden gedoseerd met 1x10¹¹ vg AAV6.2-Luciferase (Penn Vector Core) en vervolgens 7 dagen later beoordeeld met in vivo bioluminescente beeldvorming (IVIS). 10 minuten voorafgaand aan de beeldvorming (blootstelling van 30 s) werden ze (subcutaan) geïnjecteerd met 200 μL luciferine (GoldBio, 15 mg/ml). (Gemaakt met biorender.com) (B) Representatieve IVIS-beelden van muizen die AAV6.2-Luciferase krijgen door OP-aspiratie (tongtrek, links) of IT-toediening (intubatie, rechts). Interessegebieden zijn even groot en de gemiddelde uitstraling binnen het gebied wordt in de afbeelding weergegeven. (C) Kwantificering van het luciferase-signaal in OP-aspiratie (n=7) versus intubatie (n=5) muizen. p<0,0001 door ongepaarde Welsh's t-test met na log-transformatie van ruwe luciferase gegevens. (D) Afwijking van het gemiddelde als percentage van de gemiddelde gemiddelde straling. (p=0.0381, Welsh's T-toets) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur S1: Voorbeeldbeelden van de consumentenotoscoop die wordt gebruikt in het beschreven protocol voor geleide intubatie (links) en een endoscoop met vergelijkbare kosten en beschikbaarheid (rechts) worden getoond. Let op de duidelijke verschillen in focus tussen de afbeeldingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Afbeelding S2: Een voorbeeldafbeelding van de bellenbuis in gebruik. Door het teugvolume beweegt de druppel in de bellenbuis snel enkele centimeters. De druppel beweegt heel weinig als de buis zich in de slokdarm bevindt. De ademhalingsfrequentie en het ademvolume kunnen met deze methode worden geschat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Afbeelding S3: Een basisverlichtingsassemblage die de aanschaf van een dure glasvezelverlichtingsset overbodig maakt. Een naald van 20 g werd door een conische glasvezelkabel van 50 ml geduwd, werd goedkoop (en in bulk) gekocht en met een scheermesje op lengte (~1 m) gesneden en op zijn plaats geplakt. Het op zijn plaats houden van de katheter was niet nodig vanwege de goede pasvorm op de glasvezelkabel. Het bevestigen van het conische deksel over de zaklamp van een mobiele telefoon resulteert in voldoende lichttransductie om intubatie uit te voeren in een verduisterde kamer. Deze assemblage verlaagt de kosten die een laboratorium met deze techniek maakt, nog verder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Intubatie en intratracheale instillatie zijn de beste methoden voor vloeistofafgifte aan de longen, maar de overvloedige uitdagingen van de anatomie van muizen hebben een wijdverbreide acceptatie in longonderzoekslaboratoria verhinderd¹⁵. Hoewel het zorgt voor een efficiënte toediening van een inoculum aan de long, is een mogelijk nadeel van IT-toediening door deze en andere intubatietechnieken het omzeilen van de bovenste luchtwegen. Intranasale toediening is een beproefde methode die de bovenste luchtwegen niet omzeilt. Hoewel intranasale toediening vaak wordt gebruikt in longvirologische laboratoria en in sommige gevallen effectiever kan zijn²², weerspiegelt het niet de natuurlijke blootstellingsroute²³ voor sommige opgezogen middelen, resulteert het in meer variabele hoeveelheden inoculum in de long²⁴ en is het minder effectief bij gebruik van isofluraan als verdovingsmiddel⁵. Als zodanig is er uitgebreid werk verricht aan aërosolisatieapparaten en het vergelijken ervan met andere longtoedieningstechnieken²⁵, maar deze methoden brengen aërosolgerelateerde gevaren met zich mee en zijn meestal duur. Al deze moeilijkheden hebben geleid tot orofaryngeale instillatie door tongtrek²⁶, de voorkeursmethode voor pulmonale vloeistoftoediening in veel laboratoria. Zoals we hebben aangetoond, is deze methode veel variabeler dan intratracheale instillatie na intubatie. Bovendien kan de toediening door de tongtrekmethode niet worden beoordeeld tijdens de toediening en kan er onnodig trauma aan de muizentong worden veroorzaakt vanwege de spanning die nodig is om slikken te voorkomen. De tong wordt ook vastgehouden in de geleide intubatie- en IT-instillatietechniek. Omdat de videofeed echter glottis laat zien, hoeft een onderzoeker die onze methode gebruikt de larynxpositionering niet te forceren door aanzienlijke spanning op de tong te zetten. Deze verminderde tractie veroorzaakt minder weefseltrauma. Ondanks de aanzienlijke voordelen van intubatie en IT-instillatie, hebben uitdagingen het gebruik ervan in sommige laboratoria in de weg gestaan. Bijvoorbeeld: compressie van de luchtpijp door foutieve canulatie van de slokdarm kan de ademhaling belemmeren en de mortaliteit verhogen; het te diep inbrengen van de endotracheale tube kan leiden tot schade aan de carina of hoofdstam bronchiën; En ten slotte duurt het lang voordat muizenintubatie volgens traditionele methoden plaatsvindt, waardoor het onpraktisch is voor de meeste onderzoekers die op zoek zijn naar betrouwbare intrapulmonale toediening. Onze methode pakt de moeilijkheden aan die gepaard gaan met intubatie bij muizen en overwint zelfs de anatomische barrières voor het intuberen van muizen.

Er zijn verschillende methoden voorgesteld om de anatomische uitdagingen van muizenintubatie te overwinnen door visuele hulpmiddelen te implementeren. Zo is het gebruik van een traditionele endoscoop voorgesteld⁶. De lange brandpuntsdiepte van het instrument is echter slecht geschikt om te worden gebruikt voor intubatie bij muizen (Figuur S1). Dit is ook duidelijk in video 1, waar de stemplooien te zien zijn, maar wazig zijn. Klinische otoscopen zijn ook gebruikt voor directe laryngoscopie¹². De kosten van klinische otoscopen en het ontbreken van een videofeed maken ze echter ontoegankelijk voor de meeste laboratoria en niet geschikt voor training. Het gebruik van een algemeen verkrijgbare otoscoop voor consumenten heeft de bruikbaarheid van geleide intubatie aanzienlijk verbeterd. De kortere brandpuntsafstand, kleinere behuizing en verlengde spatellip zorgen voor een duidelijkere videofeed, betere wendbaarheid en positionering, en de otoscooplip kan worden gebruikt om druk uit te oefenen op de basis van de tong, wat de toegang tot de rima glottidis verbetert. Naast deze visuele hulpmiddelen is transilluminatie ook gebruikt om de glottis- en intubermuizen met succes te visualiseren ^7,13,14. Op transilluminatie gebaseerde benaderingen kunnen echter ontharingsmiddelen vereisen op het gebied dat de nek van de muis bedekt, de nabijheid van een hete lichtbron, het gebruik van de naald in de katheter, het inbrengen van scherpe instrumenten in de mond van de muis en/of het maken van een kleine incisie over de luchtpijp om plaatsing te bevestigen. De hier beschreven methode vermijdt deze risico's en bouwt voort op de beste aspecten van deze gepubliceerde methoden. Naast het overwinnen van anatomische barrières voor intubatie, is er in onze methode rekening gehouden met kostenoverwegingen.

Samen maken het gebruik van helpende handen, een muisstandaard, de otoscoop en een glasvezellamp intubatie gemakkelijker te leren en veel sneller uit te voeren, tegen lagere kosten voor laboratoria. De kosten van de in de handel verkrijgbare intubatiestandaard kunnen worden vermeden door een handgemaakte te gebruiken²⁷. De kosten van de glasvezellichtassemblage kunnen worden bekostigd door de glasvezelkabel afzonderlijk aan te schaffen (tegen veel lagere kosten, ~ $ 9 versus $ 218 - kent wetenschappelijk - op het moment van schrijven). Om de glasvezellichtbron compleet te maken, kan een conisch deksel van 50 ml met een gaatje erin en tape worden gebruikt om licht van een zaklamp van een mobiele telefoon op te vangen (zie afbeelding S3 en materiaaltabel). Das et. al beschrijf een soortgelijk apparaat¹¹. Voor sommige laboratoria kunnen de lagere kosten van deze oplossing onze methode tot een veel toegankelijkere procedure maken. Afgezien van de kosten, heeft de moeilijkheid om de plaatsing van de endotracheale tube te bevestigen de intubatie van muizen ontmoedigend gemaakt.

Om te bevestigen dat de endotracheale tube op de juiste manier is gepositioneerd, vertrouwden onderzoekers in het verleden op spiegelbeslaan door een tandspiegel boven de endotracheale tube¹⁸ te houden. Het geringe teugvolume en de variaties in kamertemperatuur voorkomen echter vaak dat de spiegel beslaat en leiden tot beoordelingsfouten. In het geval van muizenintubatie vormt dit een ernstig risico op letsel. Anderen hebben hun toevlucht genomen tot het opwekken van ademnood door de endotracheale tube¹⁰ te blokkeren. Dit veroorzaakt veel stress bij het dier en geeft minder informatie dan de 'bubbelmethode'. Verder kan het inbrengen van longtherapieën en lucht in de maag als gevolg van onvoldoende bevestiging van de plaatsing van de endotracheale tube ongemak veroorzaken en de effectiviteit van het toegediende middel belemmeren. Het gebruik van de "bubble-methode" zorgt voor een snellere, betrouwbaardere visuele bevestiging van de plaatsing van de endotracheale tube en is een lichte verbetering ten opzichte van een vergelijkbare methode die eerder is beschreven²⁸. De "bubbelmethode" stelt een onderzoeker ook in staat om de ademhalingsfrequentie en het ademvolume van het dier ruwweg te schatten.

Positionering van dieren en visualisatie van de stemplooien zijn de sleutel tot deze techniek. We ontdekten dat pediatrische neusspeculeren te groot en te omslachtig waren om de mond open te houden en de wangen uit de weg te houden tijdens intubatie, maar ze waren erg nuttig tijdens de training omdat ze een onderzoeker in staat stelden de plaatsing van de otoscoop te demonstreren. Het begeleiden van een stagiair om de relevante anatomie te herkennen is moeilijk, en een beter zicht in de mond van de muis was van cruciaal belang, wat aanzienlijk werd geholpen door het gebruik van de commerciële otoscoop. Enscenering met behulp van een verlicht vergrootglas en helpende handen zijn een integraal onderdeel van het helpen van onervaren operators bij intubatie, hoewel ze misschien niet zo cruciaal zijn voor ervaren operators.

Tijdens het trainen in deze methode kan het nodig zijn om problemen op te lossen. Als de endotracheale tube herhaaldelijk de slokdarm binnendringt, kan de glottis verkrampt zijn, kan het zachte gehemelte ontstoken zijn en kan de juiste plaatsing moeilijker zijn. Laat het dier in dit geval enkele minuten herstellen voordat u opnieuw probeert te intuberen. Het aantal nieuwe pogingen moet worden gespecificeerd in het IACUC-protocol en moet altijd worden nageleefd. Als u moeite heeft met het zien van de stemplooien, kan de ademhalingsfrequentie worden onderdrukt door te veel anesthesie, of kan de muispositionering ongepast zijn (meestal het hoofd te ver naar achteren gekanteld). Verplaats in dit geval het dier en laat het herstellen van de anesthesie voordat u het opnieuw probeert. De bellenbuis moet het ademvolume van het dier duidelijk aantonen. Als de bel slechts een klein beetje beweegt, kan hijgen als gevolg van druk op de luchtpijp door een verkeerd geplaatste endotracheale tube deze beweging veroorzaken. Raadpleeg in dit geval Timestamp: 8:25 en Figuur S3 om te zien hoe gemakkelijk het ademvolume duidelijk is bij gebruik van de "bubble-tube" op een correct geplaatste endotracheale tube. Als uw endotracheale tube verkeerd is geplaatst, verwijder deze dan onmiddellijk en laat het dier herstellen voordat u de procedure opnieuw probeert.

Hoewel intubatie en intratracheale instillatie veel beter zijn dan andere methoden, zijn ze technisch te moeilijk geweest om op grote schaal te worden toegepast. De hier beschreven methoden maken intratracheale instillatie en muizenintubatie toegankelijk en praktisch. Hoewel toekomstige toepassingen van deze techniek sterk afhankelijk zijn van wat er aan de longen wordt toegediend en in welke context ze worden toegediend, maakt een gemakkelijke en betrouwbare methode de weg vrij voor veel vooruitgang in de longbiologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fiber Optic LightiFiber Optic Lighting Kit, Mouse	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	Een component van de vezeloptische assemblage, compatibel met andere lampen en de onderstaande vervangende vezeloptische kabel
Alternatieve vezeloptische assemblage	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	een alternatief, niet besproken (maar we zien geen reden waarom het niet zou werken)
Alternatieve vezeloptische assemblage	Harvard apparatus	72-9075	een alternatief, niet besproken (maar we zien geen reden waarom het niet zou werken)
Alternatieve vezeloptische assemblage	Handgemaakt door lab	N/A	Instructies gevonden hier met behulp van een rubberen stop: DOI 10.3791/50318
Alternatieve vezeloptische assemblage	Handgemaakt door lab	N/A (materialen hieronder vermeld)	Gemaakt van een 50mL conische dop, tape en 0.75mm vezeloptische vezel
Intubatiestandaard, Muis	Kent Scientific	ETI-MSE-01	Instelbare standaard voor intubatie, veel zelfgemaakte versies beschikbaar, tip racks en houten platforms gebruikt, sommige alternatieven vermeld veel geschikte alternatieven beschikbaar.
Alternatieve intubatiestandaards	Braintree Scientifuc	RIS 100	een alternatief, niet besproken (maar we zien geen reden waarom het niet zou werken)
Alternatieve intubatiestandaards	Natsume Seisakusho	KN-1014	een alternatief, niet besproken (maar we zien geen reden waarom het niet zou werken)
Alternatieve intubatiestandaards	Vetland	000A3467	een alternatief, niet besproken (maar we zien geen reden waarom het niet zou werken)
Alternatieve intubatiestandaards	Handgemaakt door lab	N/A	Gemaakt van een 3 ringbinder hier: DOI 10.3791/60844 (meerdere alternatieve methoden gepubliceerd)
Niet-absorbeerbare gevlochten zijde hechtdraad, Grootte 0	Fine Science Tools	18020-00	langer dan 1 inch zal de carina beschadigen
Safelet IV Catheter 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	Of soortgelijk
RS-5358 Micro Dissecting Forceps	Fisher	RS-5358	Of soortgelijk, inclusief helpende handen
Loupe met Licht en Standaard, EOOKU Flexibele Magnetische Helpende Hand, 5X&10X 12V 108pcs LED Beads Loupe, 3 Modi Instelbare Draaibare Halsen & Zware Basisplaat	Amazon	https://www.amazon.com/Loupe- EOOKU-Flexibel-Instelbaar-Hals- /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9&dib=eyJ2IjoiMSJ9. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSMgW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew .TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA&dib_tag= se&keywords=loupe+met +licht+EOOKU+3+in+1&qid=1709661 709&sprefix=loupe+met+licht+ eooku+3+in+1%2Caps%2C98&sr=8-5	Of soortgelijk, elke gebogen fijn gekartelde tang zal werken
Oorwas Verwijdering - Oorwas Verwijderingsgereedschap met 8 Stks Oor Set - Oorreiniger met Camera - Oorwas Verwijderingsset met Licht - Oorcamera met 6 Oorlepel - Oorreiniger voor iOS & Android (Zwart)	Amazon	https://www.amazon.com/Oor-Wax- Verwijdering-Verwijderingsgereedschap-Android%EF% BC%88Zwart%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta&content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04&pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04&pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2&pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9&pd_rd_i=B09KZ8TS7L&psc=1	of soortgelijk, verschillende merken beschikbaar
AZIMOM PMMA Plastic End Glow Vezeloptiek Kabel 0.75mm(0.02in) 100m(328ft)/Roll voor Star Sky Plafond Alle Soorten Led Licht Motor Driver Bron	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastic-Snijbaar-Plafond-1pcs0-00 98in328ft/dp/B07WC9JV5N/ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7N