Dit protocol beschrijft het kweken, oogsten en concentreren van uitgescheiden eiwitten van Mycobacterium tuberculosis. Cultuurfiltraateiwitten (CFP's) worden gekwantificeerd, gescheiden in 20 fracties door iso-elektrische focussering en verder opgelost in 30 fracties met behulp van een preparatief SDS-PAGE en een elektroelutiesysteem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Scheiding en fractionering van kweekfiltraateiwitten (CFP's) van Mycobacterium tuberculosis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Uitgescheiden eiwitten van Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) spelen een cruciale rol bij de pathogenese van tuberculose, immuunmodulatie en ziekteprogressie. Inzicht in hun samenstelling en functie is essentieel voor het identificeren van nieuwe biomarkers die kunnen helpen bij de diagnose van tuberculose, de ontwikkeling van vaccins en therapeutische interventies. Deze studie richt zich op de systematische isolatie, fractionering en karakterisering van kweekfiltraateiwitten (CFP's) om uitgebreide immunologische en proteomische analyses mogelijk te maken. CFP's werden verkregen uit M. tuberculosis H37Rv-culturen die onder chemisch gedefinieerde omstandigheden werden gekweekt om een gecontroleerde eiwitexpressie te garanderen. Het cultuursupernatans werd gezuiverd door filtratie en geconcentreerd met behulp van een hol vezelsysteem om eiwitten boven de 10 kDa vast te houden. Fractionering werd bereikt door middel van iso-elektrische focussering in de vloeibare fase, waarbij eiwitten op basis van hun iso-elektrische punten in 20 verschillende fracties werden gescheiden. Een verdere resolutie werd uitgevoerd met behulp van preparatieve natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), gevolgd door elektro-elutie, wat 30 eiwitfracties opleverde. De gefractioneerde eiwitten die via deze aanpak worden verkregen, vormen een waardevolle bron voor immunologische profilering en op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyses. Door uitgescheiden eiwitten systematisch te isoleren en te karakteriseren, draagt deze studie bij aan de identificatie van tuberculose-specifieke eiwitbiomarkers, die de diagnostische nauwkeurigheid zouden kunnen verbeteren en ons begrip van de pathogenese van M. tuberculose zouden kunnen vergroten.
Inleiding
Uitgebreid onderzoek heeft de belangrijke rol van uitgescheiden eiwitten in de groei en immuuninteracties van Mycobacterium tuberculosis1 aangetoond. Het kweekfiltraat van M. tuberculosis bevat een complexe reeks eiwit- en niet-eiwitcomponenten, waardoor het een waardevolle bron is voor het begrijpen van de biologie en immunogene eigenschappen ervan. Vroege proteomische studies identificeerden bijna 450 eiwitten in het kweekfiltraat2, waarvan er vele een cruciale rol spelen bij het opwekken van immuunresponsen tegen tuberculose. Het identificeren van deze immunologisch relevante antigenen is essentieel voor de ontwikkeling van innovatieve diagnostiek en vaccins tegen tuberculose. De vooruitgang op dit gebied wordt echter bedreigd door de complexiteit van de immuunrespons op M . tuberculosis-infectie en de technische beperkingen van biochemische zuiveringsmethoden die worden gebruikt om mycobacteriële eiwitten te isoleren.
Er zijn verschillende scheidingstechnieken gebruikt om M. tuberculosis-eiwitten op te lossen, waardoor de detectie van kleine maar functioneel significante eiwitten wordt vergemakkelijkt en de reikwijdte van proteomische studies wordt uitgebreid. Een ideale scheidingsmethode lost complexe eiwitmengsels effectief op in een beperkt aantal afzonderlijke fracties. Twee veelgebruikte benaderingen voor het scheiden van mycobacteriële eiwitten zijn op chromatografie gebaseerde en op elektroforese gebaseerde methoden 1,2.
Chromatografische technieken, waaronder affiniteit, ionenuitwisseling en reversed-phase chromatografie, vormen al meer dan tien jaar de hoeksteen van eiwitfractionering. Deze methoden zijn op grote schaal gebruikt voor het scheiden van M. tuberculosis-eiwitten 3. Ze worden echter beperkt door factoren zoals lage eiwitopbrengsten en interferentie van niet-eiwitcomponenten, wat latere immunologische analyses kan bemoeilijken. Deze nadelen beperken het nut van chromatografie voor het identificeren van immunologisch relevante antigenen.
Om deze beperkingen aan te pakken, werd een tweedimensionale scheidingsmethode op basis van elektroforese toegepast. In de eerste dimensie worden eiwitten gescheiden op basis van hun iso-elektrische focussering (IEF) met behulp van een preparatief IEF-systeem, dat eiwitten scheidt op basis van hun iso-elektrische punten. In de tweede dimensie worden eiwitten verder opgelost op molecuulgewicht met behulp van preparatief SDS-PAGE, gevolgd door elutie met een vol-gel eluter instrument.
Deze tweedimensionale benadering biedt verschillende voordelen. Het vermindert de complexiteit van kweekfiltraateiwitten (CFP) aanzienlijk door ze te fractioneren in 600 verschillende fracties. Bovendien zijn de fracties geschikt voor directe immunologische analyse omdat het elutieproces geen componenten introduceert die interfereren met cellulaire immunologische assays 4,5,6.
Dit protocol beschrijft de bereiding en scheiding van kweekfiltraateiwitten voor immunologische analyse6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Groei van Mycobacterium tuberculosis en bereiding van kweekfiltraateiwitten (CFP's)
- Bereiding van het vloeibare medium van Sauton
- Combineer de volgende componenten in 950 ml gedestilleerd water: Glycerol, 30,0 ml; kaliumdiwaterstoforthofosfaat (KH2PO4), 0,5 g; Magnesiumsulfaat, 0,5 g; Citroenzuur, 2,0 g; Caseïne hydrolysaat, 0,5 g; ijzerammoniumsulfaat, 0,05 g; Natriumglutamaat, 4,0 g.
- Stel de pH in op 7,2 met 40% kaliumhydroxide (ongeveer 5 ml/l).
- Vul het volume aan tot 1 L en autoclaaf op 15 psi gedurende 20 min.
- Bereiding van mycobacteriële suspensie
- Breng kolonies van Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) gekweekt op Lowenstein-Jensen (LJ) hellingen over naar 2 ml vloeibaar medium van Sauton.
- Breek mycobacteriële klonten af door krachtig te schudden met glasparels onder steriele omstandigheden.
- Initiëren van mycobacteriële groei
- Breng de bacteriële suspensie over in een McCartney-fles met 10 ml vloeibaar medium van Sauton.
- Incubeer de fles gedurende 2 weken bij 37 °C.
- Opschaling van de cultuur
- Breng de gekweekte cultuur over naar 200 ml Sauton's medium in een fles van 1 L.
- Incubeer op een shaker bij 37 °C gedurende 4 weken.
- Breng de logfasecultuur over in een kolf van 4 l met 2 l Sauton's medium.
- Kweek de cultuur bij 37 °C onder stationaire omstandigheden gedurende nog eens 4 weken totdat er een oppervlaktevlies ontstaat.
- Oogsten van de cultuurfiltraateiwitten (CFP's)
- Oogst de cultuur door centrifugatie op 1.000-1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Filtreer het bovenstaande door een vacuümfiltersysteem van 0,45 μm.
- Concentreer het CFP-houdende filtraat met behulp van een tangentieel stromingsfiltersysteem met een grenswaarde van 10 kDa.
- Opslag van het geoogste GVB
- Schat het eiwitgehalte met behulp van de in de handel verkrijgbare BCA-testkit.
- Verdeel de eiwitten, voeg natriumazide toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,2% en bewaar bij -80 °C.
2. Preparatieve iso-elektrische focussering in vloeibare fase (IEF)
- Voorbereiding van het eiwitmonster
- Solubiliseer Mycobacterium tuberculosis CFP in 60 ml IEF-scheidingsbuffer met 8 M ureum, 1 mM dithiothreitol (DTT), 5% glycerol, 2% digitonine, 2% amfolyten (pH 3,0-10,0 en pH 4,0-6,0 in een verhouding van 1:4).
- Opzetten van het IEF-systeem
- Vul de anodekamer met 0,1 M fosforzuur en de kathodekamer met 0,1 M natriumhydroxide.
- Monteer de preparatieve IEF-cel volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- IEF uitvoeren
- Laad tot 350 mg eiwit op het IEF-systeem.
- Focus eiwitten op 4 °C met een koelend circulatiewatersysteem.
- Pas een constant vermogen van 12 W toe totdat de spanning stabiliseert op ongeveer 1400 V en ga dan nog 30 minuten door.
- Verzamelen en analyseren van de breuken
- Oogst IEF-fracties en bepaal hun pH.
- Analyseer elk aliquot met SDS-PAGE en visualiseer eiwitten met behulp van zilverkleuring.
3. Preparatieve SDS-PAGE en helelutie van de gel
- Proefmalen voor SDS-PAGE
- Meng IEF-fracties met in de handel verkrijgbare 6x SDS-PAGE-voorbeeldbuffer.
- Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten op 95 °C.
- Uitvoeren van preparatieve SDS-PAGE
- Laad tot 10 mg eiwit in een polyacrylamidegel van 16 cm × 20 cm met een stapelgel van 4% en een oplossende gel van 12,5%.
- Laat de elektroforese met een constante stroom van 50 mA draaien totdat het verffront zich op 2 cm van de bodem bevindt.
- Eiwitten uit de gel afluleren
- Breng de gel in evenwicht in elutiebuffer (60 mM Tris, 40 mM CAPS, pH 9,4) gedurende 10 min.
- Breng de gel over op het instrument van de helegel-eluter.
- Elute eiwitten door gedurende 1 uur een constante stroom van 250 mA toe te passen.
- Verzamelen en analyseren van de breuken
- Elueer de gescheiden eiwitten in 30 afzonderlijke fracties, elk met een volume van 2,5 ml.
- Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-eiwitschattingsmethode volgens de instructies van de fabrikant.
- Analyseer 10 μg eiwit uit elke fractie met SDS-PAGE en visualiseer met behulp van zilverkleuring.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 illustreert de complexiteit van de bereide cultuurfiltraateiwitten (CFP). Aanvankelijk werd 100 μg CFP onderworpen aan een 2D-SDS PAGE-analyse om de complexiteit ervan te beoordelen. Deze analyse onthulde de aanwezigheid van bijna 100 verschillende eiwitvlekken in het CFP (Figuur 1).
De 20 fracties die uit elke run werden verzameld, werden geanalyseerd door SDS-PAGE. Hiervan zijn drie represe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cultuurfiltraateiwitten (CFP's) van Mycobacterium tuberculosis vertegenwoordigen een complex mengsel van diverse eiwitcomponenten die in verschillende concentraties aanwezig zijn. Proteomische studies hebben tot 1,314 eiwitten geïdentificeerd binnen de CFP 4,5. Talrijke onderzoeken hebben de cruciale rol van CFP's bij het moduleren van immuunresponsen benadrukt. In het bijzonder spelen CFP's een onmisbare rol in zowel ce...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ÄKTA flux tangential flow filtration system | CYTIVA | 29038437 | |
| Ampholytes (pH 3.0 tot 10.0 ) | BIO-RAD | 1632094 | |
| Ampholytes (pH 4.0 tot 6.0 ) | BIO-RAD | 1631143 | |
| BCA-eiwitbepaling | MERCK | 71285-M | |
| CAPS | MERCK | C2632 | |
| Caseïnehydrolysaat | MERCK | 65072-00-6 | |
| Citroenzuur | MERCK | C0759 | |
| Digitonine | MERCK | 300410 | |
| DTT | MERCK | D9779 | |
| Ferric ammoniumsulfaat | HIMEDIA | GRM10944 | |
| Glycerol | MERCK | G5516 | |
| Glycerol | MERCK | 252859 | |
| Lowenstein-Jensen hellingen | HIMEDIA | SL001 | |
| Magnesiumsulfaat | MERCK | M7506 | |
| Millipore Stericup Quick Release Vacuum Filtration System | MERCK | S2HVU11RE | |
| Fosforzuur | MERCK | 695017 | |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat | MERCK | P0662 | |
| Kaliumhydroxide | MERCK | 484016 | |
| Preparatieve IEF Cell (Rotofor) | BIO-RAD | 170-2986 | |
| Natriumaziet | MERCK | S2002 | |
| Natriumglutamaat | MERCK | 49621 | |
| Natriumhydroxide | HIMEDIA | MB095 | |
| Tris | MERCK | 252859 | |
| Urea | MERCK | U5128 | |
| Whole Gel Eluter apparaat | BIO-RAD | 1651250 |
Referenties
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
- Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
- Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
- Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
- Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
- Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
- Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
- Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
