Scheiding en fractionering van celwand- en celmembraaneiwitten van Mycobacterium tuberculosis voor stroomafwaartse eiwitanalyse

Samenvatting

Dit protocol scheidt onoplosbare celwand- en membraaneiwitten in eenvoudige fracties (1-5 eiwitten) met behulp van preparatieve iso-elektrische focussering (IEF) op basis van iso-elektrisch punt, gevolgd door scheiding op molecuulgewicht. De resulterende fracties kunnen direct worden gebruikt voor immunologische en proteomische analyse zonder verdere zuivering.

Samenvatting

Mycobacterium-celwand- en membraaneiwitten, die een centrale rol spelen bij de pathogenese van tuberculose, werden met succes gescheiden met behulp van preparatieve iso-elektrische focussering (IEF) en preparatieve natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). Gevolgd door gel-elutie, het overwinnen van beperkingen in conventionele methoden voor de scheiding van hydrofobe eiwitten. In deze procedure werden M. tuberculosis-kolonies overgebracht van Lowenstein-Jensen-hellingen naar 2 ml 7H9-bouillon, gedispergeerd met glasparels en gedurende 2 weken bij 37 °C geïncubeerd. Vervolgens werd de cultuur opgeschaald tot 200 ml en gedurende 4 weken in een shaker gekweekt. Het werd verder opgeschaald naar 1 L met 500 ml 7H9 bouillon en nog eens 4 weken gekweekt. Gekweekte mycobacteriën werden gepelleteerd door centrifugatie bij 1741 × g gedurende 30 minuten. Voor elke pellet van 2 g werd 1 ml breekbuffer toegevoegd en werd het monster gesonificeerd. Het lysaat werd gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 3436 × g om ongebroken cellen te verwijderen, en het bovenstaande werd geconcentreerd. Dit supernatans (lysaat van hele cellen) werd gedurende 30 minuten bij 13751 × g gecentrifugeerd om celwandeiwitten te pelleteren. Het resterende supernatans werd gedurende 4 uur ultra-gecentrifugeerd bij 100.000 × g om het celmembraan en het cytosol te scheiden. De geïsoleerde celwand en membraaneiwitten werden bij 4 °C op een vloeibaar preparatief IEF-systeem geladen en bij 12 W gescheiden totdat de spanning stabiliseerde op 1400 V, wat 20 fracties scheidt. Deze IEF-fracties werden verder gescheiden door preparatief SDS-PAGE, en eiwitten werden geëlueerd met behulp van een hele geleluter bij 250 mA, wat resulteerde in 30 fracties. Door middel van dit protocol waren we in staat om nieuwe M. tuberculosis-celwanden en membraanspecifieke biomarkers te identificeren, en het toont ook potentieel voor het karakteriseren van vergelijkbare eiwitten in andere pathogenen.

Inleiding

Immunologische studies hebben aangetoond dat naast oplosbare eiwitten, die gemakkelijk te zuiveren zijn, de menselijke immuunrespons op ziekteverwekkers zoals M. tuberculosis ook gericht is op hydrofoob eiwit dat aanwezig is in de celwand¹ en celmembraaneiwitten² van Mycobacterium tuberculosis. Deze celwand- en membraaneiwitten spelen een cruciale rol bij de immunologische controle tegen veel ziekteverwekkers, waaronder tuberculose. Sommige van deze eiwitten worden gerapporteerd als immunodominante antigenen die de T- en B-celrespons opzetten. Daarentegen worden andere eiwitten geïdentificeerd als moleculaire handtekeningen van pathogenen waarvan wordt erkend dat ze een aangeboren immuunrespons initiëren, zoals pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) door immuuncellen, waardoor een immuunrespons wordt geïnitieerd. Mycobacteriële lipoproteïnen zoals LprG, LpqH, LprA en PhoS1 worden bijvoorbeeld herkend door Toll-like receptor 2³.

De hydrofobe aard van celwand- en membraaneiwitten brengt aanzienlijke technische uitdagingen met zich mee op het gebied van hun oplosbaarheid en scheiding. Studies hebben aangetoond dat membraaneiwitten ongeveer 20% tot 30% van de coderende regio's van alle organismen uitmaken, inclusief mycobacteriën ^4,5. Vanwege hun intrinsieke aard en technische uitdagingen zijn celwand- en membraaneiwitten moeilijker op te lossen en te isoleren in vergelijking met oplosbare eiwitten. Als gevolg hiervan is slechts 2% van de membraaneiwitstructuren gerapporteerd⁶. Verschillende factoren dragen bij aan de moeilijkheid om deze eiwitten te isoleren. De belangrijkste uitdaging is hun lage abundantie in de cel, wat de isolatie van individuele eiwitten voor verdere karakterisering bemoeilijkt⁷. Bovendien hebben deze eiwitten de neiging om samen te klonteren, wat hun oplosbaarheid verder bemoeilijkt. Dit probleem kan worden aangepakt door wasmiddelen toe te voegen om te helpen bij de oplosbaarheid. Sommige eiwitten kunnen echter nog steeds aggregaten vormen, zelfs in de aanwezigheid van wasmiddelen, in welk geval chaotropische middelen en reductiemiddelen kunnen worden gebruikt om de oplosbaarheid te verbeteren.

Het gebruik van reinigingsmiddelen voor oplosbaarheid kan de daaropvolgende scheidingsmethoden verstoren. Geladen wasmiddelen kunnen bijvoorbeeld niet worden gebruikt met ionenuitwisselingschromatografie en alle wasmiddelen kunnen hydrofobe interactiechromatografie verstoren⁸. Daarom is het van cruciaal belang om een wasmiddel te kiezen dat compatibel is met de gekozen scheidingsmethode. Een andere belangrijke stap in de isolatie van celwand- en membraaneiwitten is het verwijderen van detergenten die worden gebruikt voor oplosbaarheid, omdat deze de daaropvolgende functionele analyses van de eiwitten kunnen verstoren.

We hebben een robuuste methodologie ontwikkeld die veel van de uitdagingen overwint die gepaard gaan met de analyse van membraaneiwitten, met name de hydrofobe eiwitten uit de celwand en het celmembraan. Een belangrijke uitdaging bij het bestuderen van deze eiwitten is hun oplosbaarheid, omdat ze door hun hydrofobe aard moeilijk te extraheren en te analyseren zijn. De hier beschreven methodologie maakt gebruik van een speciaal geformuleerde iso-elektrische focussering (IEF) buffer, die celwand- en celmembraaneiwitten efficiënt oplost. Deze oplosbaarheidsstap is van cruciaal belang omdat het de daaropvolgende analyse van deze hydrofobe eiwitten mogelijk maakt.

Een bijkomend voordeel van deze methode is het vermogen om de complexiteit van het eiwitmengsel te verminderen. Door gebruik te maken van twee complementaire scheidingstechnieken - gebaseerd op het iso-elektrische punt (pI) en het molecuulgewicht van eiwitten - scheidt deze methodologie celwand- en celmembraaneiwitten efficiënt in vereenvoudigde fracties. Elke fractie bevat doorgaans slechts één tot drie eiwitten, waardoor de resolutie aanzienlijk wordt verbeterd en de stroomafwaartse karakterisering wordt vergemakkelijkt.

Deze methodologie, ontwikkeld met behulp van Mycobacterium tuberculosis celwand en celmembraaneiwitten als modelsysteem, pakt effectief de uitdagingen aan die gepaard gaan met het isoleren en analyseren van hydrofobe eiwitten. Het biedt een betrouwbare benadering voor de isolatie, scheiding en karakterisering van deze complexe eiwitfracties, waardoor het beter mogelijk wordt om ze in detail te bestuderen.

Protocol

Dit onderzoek voldoet aan de relevante richtlijnen van de overheid en is goedgekeurd door de Institutioneel Wetenschappelijke Adviescommissie en de Ethische Commissie. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de onderzoekspopulatie voordat de monsters werden getrokken.

1. Kweek van M. tuberculose

1. Breng ongeveer 10 M. tuberculose-kolonies over van Lowenstein-Jensen-hellingen naar 2 ml 7H9 bouillonmedium (suspendeer 2,35 g Middlebrook 7H9 Broth Base in 400 ml gedestilleerd water, 50 ml oliezuuralbumine dextrose catalase [OADC]-supplement, 0,5 g Tween 80 en vul aan tot 500 ml)
   OPMERKING: M. tuberculosis is een ziekteverwekker van risicogroep 3; het moet worden behandeld in een biologische veiligheidskast (BSC) in de BSL3-faciliteit. Er moeten geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden gebruikt.
2. Verspreid de cellen met behulp van glasparels onder steriele omstandigheden in een flessenschudder bij 15 tpm gedurende 1 minuut.
3. Breng de bacteriële suspensie over op 10 ml 7H9 bouillonmedium in een McCartney-fles en incubeer gedurende 2 weken bij 37 °C in een shaker-incubator bij 30 tpm.
4. Schaal de logfasecultuur op naar 200 ml 7H9 bouillonmedium en kweek gedurende 4 weken in een shakercultuur bij 30 toeren.
5. Schaal verder de cultuur op in een kolf van 1 liter met 500 ml 7H9 bouillonmedium en kweek als een shakercultuur bij 30 tpm gedurende 4 weken bij 37 °C.
6. Oogst de mycobacteriën door 30 minuten te centrifugeren bij 1741 g .

2. Preparaat van lysaateiwitten van hele cellen

1. Onderwerp de geïsoleerde bacteriële pellet aan sonicatie volgens een standaardprotocol.
2. Bereid de breekbuffer voor met de volgende samenstelling: 20 mM Tris met 8,5% (8,5 g per 100 ml) NaCl.
3. Pas de uiteindelijke pH aan op 7,4 met geconcentreerde HCl.
4. Voeg vers bereide proteaseremmers toe aan de breekbuffer met de volgende concentraties (details van toe te voegen proteaseremmers staan vermeld in aanvullende tabel 1)
5. Behandel M. tuberculosis-bacillen (100 ml verpakt en gewogen) voor elke 2 g bacteriële celpellet, voeg 1 ml breekbuffer toe met lysozym (1 mg/5 ml celsuspensie) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C onder voorzichtig roeren.
6. Suspendeer de bacillen in tweemaal het volume van de breekbuffer.
7. Voeg 0,04% (wt/vol) natriumazide en 0,05% Tween 80 toe aan de buffer.
8. Verstoor de bacteriële cellen in de brekende buffer met behulp van een sonicator met een cyclus van 9 s aan en 9 s uit gedurende 30 minuten bij een amplitude van 40%, waarbij de suspensie op ijs blijft om eiwitdenaturatie te voorkomen.
9. Centrifugeer het bereide lysaat bij 3438 g gedurende 15 minuten bij 4 °C om ongebroken cellen te verwijderen.
10. Concentreer het bovenstaande met behulp van centrifugaalconcentrators (3 kDa cutoff - 5 ml).
11. Bepaal de eiwitconcentratie in het bovenstaande met behulp van de bicinchoninezuur (BCA) eiwitkwantificeringstest met standaard BSA-eiwit.
    OPMERKING: Laad bij SDS-PAGE-analyse 50 μg eiwit voor analyse.

3. Isolatie van celwand- en celmembraaneiwitten door ultracentrifugatie

1. Isoleer celwand, celmembraan en cytosolische eiwitten van het hele cellysaat volgens het protocol van Raja et ^al.9. zoals hieronder beschreven.
2. Centrifugeer het hele cellysaat bij 13751 × g bij 4 °C gedurende 30 minuten en scheid de celwandeiwitten als een pellet.
3. Onderwerp het supernatans gedurende 4 uur aan ultracentrifugatie bij 100.000 g × g bij 4 °C met behulp van een ultracentrifuge, waarbij de celmembraaneiwitten als een pellet worden gescheiden en de cytosolische eiwitten in het supernatant blijven.
4. Schat de eiwitconcentraties in de celwand en de celmembraanfracties met behulp van de BCA-eiwittest.
   OPMERKING: Laad bij SDS-PAGE-analyse 50 μg eiwit voor analyse. Gescheiden celwand en celmembraan worden opgeslagen in een vriezer van -80 °C tot verdere analyse.

4. Preparatieve iso-elektrische focussering in vloeibare fase (Rotofor [IEF-apparaat])

1. Solubiliseren van de celwand en celmembraaneiwitten geïsoleerd door ultracentrifugatie in een IEEF-buffer die 8 M ureum, 1 mM DTT, 5% glycerol, 2% digitonine bevat.
2. Voeg 2% amforlyten toe (pH 3,0 tot 10,0 en pH 4,0 tot 6,0 in een verhouding van 1:4)
3. Fractioneer de opgeloste eiwitten met behulp van een vloeibaar IEF-systeem dat op 4 °C wordt gehouden met een koelwaterbad.
4. Voer de IEF-scheiding uit volgens de instructies van de fabrikant en pas een constant vermogen van 12 W toe totdat de spanning stabiliseert (tussen 1300 V en 1600 V).
5. Ga door met de IEF-run gedurende nog eens 30 minuten na stabilisatie van de spanning, met een totale looptijd van ongeveer 5-6 uur.
6. Verzamel de afzonderlijke IEF-fracties met behulp van een vacuümpomp en bepaal hun pH-waarden.
7. Onderwerp de gescheiden fracties (50 μg) aan SDS-PAGE en visualiseer de eiwitten met behulp van Coomassie Brilliant Blue (CBB) of zilverkleuring. Bewaar de afgescheiden IEF-fracties in een vriezer van -80 °C tot verdere analyse.

5. Preparatieve SDS-PAGE en hele gel-elutie

1. Meng de IEF-gescheiden celwand- en celmembraanfracties met 6x SDS-PAGE-monsterbuffer en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C vóór SDS-PAGE-analyse.
2. Scheid de eiwitfracties in de tweede dimensie met behulp van polyacrylamidegels van 16 cm en 20 cm, bestaande uit een 12,5% oplossende gel en een stapelgel van 4%.
3. Gebruik een enkel monstervak van 13 cm lang om het monster te laden.
4. Voer elektroforese uit met een constante stroom van 50 mA/gel totdat het verffront de bodem van de gel bereikt.
5. Breng de gel in evenwicht in elutiebuffer (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propaansulfonzuur [CAPS]) gedurende 10 minuten na de elektroforese.
6. Breng de gel over naar een volledig geleluterapparaat zoals beschreven door de fabrikant van het instrument.
7. Elueer de eiwitten uit de gel door de eluter gedurende 1 uur met een constante stroom van 250 mA te laten draaien.
8. Verzamel ongeveer 30 eiwitfracties, elk met een volume van 3 ml, uit elke gel met behulp van een vacuümpomp.
9. Kwantificeer de eiwitconcentratie in de geëlueerde fracties met behulp van de BCA-eiwittest.
10. Onderwerp 10 μg van de geëlueerde fracties aan SDS-PAGE-analyse en visualiseer door Coomassie briljant blauw (CBB) kleuring.
    OPMERKING: Gescheiden hele gelgeëlueerde fracties werden opgeslagen in de vriezer van -80 °C tot verdere analyse.

Resultaten

Isolatie van celwand- en celmembraaneiwitten door ultracentrifugatie met hoge snelheid
Celwand- en membraaneiwitten werden geïsoleerd uit lysaten van hele cellen via ultracentrifugatie zoals beschreven in het protocol. SDS-PAGE-analyse van de gescheiden subcellulaire fracties - celwand, celmembraan en cytosol-eiwitprofielen van M. tuberculosis wordt weergegeven in figuur 1.

Scheiding van celwan...

Discussie

De hydrofobe aard van celwand- en membraaneiwitten biedt aanzienlijke experimentele uitdagingen bij hun oplosbaarheid en scheiding. In het bovengenoemde protocol hebben we een nieuwe tweedimensionale scheidingsmethode op basis van elektroforese beschreven om deze hydrofobe eiwitten effectief te isoleren. In dit protocol hebben we in eerste instantie de membraan- en celwandeiwitten gescheiden op basis van hun iso-elektrische punten met behulp van het vloeibare IEF-systeem. Om het oplosbaa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7H9 broth	Himedia	M198
40% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	BIO-RAD	1631113
BCA protein assay	MERCK	BCA1
Bio-Lyte 5/7 Ampholyte	BIO-RAD	1631152
centrifugal concentrators 3 kDa	MERCK	Z629456
Digitonin.	MERCK	D141
Dnase	MERCK	11284932001
DTT	MERCK	D9779
EDTA	MERCK	E9884
EGTA	MERCK	E3889
Glycerol	MERCK	G5516
Leupeptin	MERCK	E18
Pepstatin A	MERCK	P5318
PMSF	MERCK	78830
Rnase	MERCK	10109134001
Rotofor	BIO-RAD	170-2986	iso-elektrisch focusapparatuur (IEF)
Sonicator	Vibra-Cell, Sonics	VC 750
TLCK	MERCK	T7254
TPCK	MERCK	4376
ureum	MERCK	U5378
Whole Gel Eluter apparaat	BIO-RAD	1651250