Methodenartikel

In situ Isolatie en kweek van weerbarstige bodembacteriën met behulp van een isolatiechip (iChip)

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67692

⸱

6 augustus 2025

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het ontwerp en het gebruik van een isolatiechip (iChip) voor in situ kweek van recalcitrante bodemmicroben in hun natuurlijke omgeving. Het beschrijft ook de in situ kweek van antimicrobieel producerende bodembacteriën. Het protocol kan worden aangepast om bacteriën te herstellen uit diverse niches met andere gewenste eigenschappen.

Samenvatting

Ecosystemen herbergen miljoenen microben uit de omgeving, waarvan sommige in staat zijn om biotechnologisch relevante producten te produceren, zoals enzymen, vitamines, aminozuren, organische zuren, antiparasitaire middelen en antimicrobiële middelen. De meeste van deze omgevingsbacteriën worden als "niet-kweekbaar" beschouwd omdat de kweekmethoden in het laboratorium niet voldoen aan hun voedings-/milieuvereisten. Omdat ze in de natuur naast elkaar bestaan, kunnen ze bovendien ook afhankelijk zijn van een voedingsstof/metaboliet die door een ander lid van de microbiële gemeenschap wordt geproduceerd. Het brengen van de "niet-gecultiveerde" microbiële diversiteit in de cultuur zal een kans bieden om het enorme scala aan bioactieve producten die ze kunnen coderen te verkennen. Dit artikel beschrijft de implementatie van de iChip-technologie, een meerkanaals diffusiekamer die is ontwikkeld voor een high-throughput, in situ kweek van de "niet-kweekbare" bacteriën. Gezien de wereldwijde dreiging van antimicrobiële resistentie, biedt het artikel bijvoorbeeld een gedetailleerd protocol voor in-situ kweek en herstel van isolaten uit de microbiële 'donkere materie' die in staat is om antimicrobiële middelen te produceren. Dit protocol beschrijft de betrokken stappen, van de stap voor het verzamelen van grondmonsters tot het terugwinnen van isolaten, en belicht de plausibele factoren die van invloed kunnen zijn op het succes van isolatie. Het gebruik van deze technologie vergemakkelijkt niet alleen de isolatie van anders "niet-kweekbare" bacteriën voor de ontdekking van antibiotica, maar stelt onderzoekers ook in staat om zich te verdiepen in de complexe bodemecologie, die vervolgens kan worden aangeboord voor een groot aantal andere toepassingen.

Inleiding

Rijke opslagplaatsen van voorheen onontgonnen microben bestaan in natuurlijke omgevingen zoals bodem, waterlichamen en extreme omgevingen. Het is echter een uitdaging om deze enorme biodiversiteit aan microben aan te boren, omdat de meeste van hen niet gemakkelijk kunnen worden gekweekt met behulp van traditionele laboratoriummedia en -methoden. De anomalie van het grote aantal platen beschrijft dit fenomeen en benadrukt de discordante aantallen micro-organismen die visueel kunnen worden waargenomen versus die waarvan wordt waargenomen dat ze groeien in kweekmedia1. Het omzeilen van deze barrière en het mogelijk maken van toegang tot de niet-kweekbare diversiteit van microben en hun producten zou mogelijk kunnen voorzien in verschillende biotechnologische behoeften.

De ontwikkeling van antimicrobiële resistentie is bijvoorbeeld een bedreiging geworden voor de wereldwijde volksgezondheid. Grote farmaceutische bedrijven zijn terughoudend geweest om de ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen na te streven, waardoor de snelheid van ontdekking afneemt in vergelijking met de snelheid van opkomst van resistentie tegen bestaande antibiotica 2,3. Er is dus een kritieke behoefte aan de ontdekking van nieuwe antimicrobiële stoffen4. Omdat microbiële gemeenschappen gelijktijdig ofin competitie 5 samen zijn geëvolueerd, hebben ze het potentieel ontwikkeld om nieuwe chemische verbindingen te produceren die hun overlevingskansen vergroten. De enorme diversiteit aan microben in de omgeving en hun producten is nog niet volledig onderzocht, aangezien traditionele methoden op basis van laboratoriumcultuur vaak leiden tot de isolatie van vergelijkbare, bekende microben. Dit komt omdat conventionele kweekmedia en -methoden bevooroordeeld zijn in de richting van het kweken van voor de mens relevante microben en er niet in slagen natuurlijke omgevingen na te bootsen. Het ontwerpen van kweekmedia om microben in de omgeving te kweken is een uitdaging, omdat de groei van sommige soorten verschillende voedingsstoffen kan vereisen, vaak geproduceerd door andere microben in de buurt, en specifieke omgevingsomstandigheden.

Om dit probleem aan te pakken en om microben in situ te kweken, werden eerst diffusiekamers ontwikkeld6. De diffusiekamer is een roestvrijstalen O-ring. De ruimte in de ring wordt gevuld met agar die is gezaaid met een geschikte monsterverdunning. De boven- en onderkant van de ring worden vervolgens afgedicht met membranen van polycarbonaat, die de diffusie van van de bodem afgeleide voedingsstoffen en metabolieten mogelijk maken en tegelijkertijd de infiltratie van andere microben in de kamer voorkomen6. Na het zaaien wordt de plaat in de omgeving geplaatst waaruit het monster wordt verzameld om cultuur in situ mogelijk te maken. De diffusiekamer was zeer efficiënt en resulteerde in de kweek van tal van voorheen niet-kweekbare microben. Het O-ringontwerp met agar werd echter omslachtig en had een lage doorvoer, waardoor er een probleemruimte overbleef voor verdere innovaties6. Kort daarna werd een isolatiechip (iChip) ontworpen, die in staat was om in situ te kweken en tegelijkertijd high-throughput herstel van zuivere culturen te herstellen7. Dit ontwerp is conceptueel hetzelfde als een diffusiekamer, maar bestaat uit meerdere kanalen waarbij elk kanaal fungeert als een onafhankelijke diffusiekamer, waardoor mogelijk herstel van een enkele microkolonie uit elke kamer mogelijk is8. De heruitvinding van het ontwerp van de diffusiekamer verbeterde de doorvoer van de technologie aanzienlijk en maakte de isolatie en cultivering mogelijk van een grotere biodiversiteit van taxa uit bodem, zeewater9, warmwaterbronnen10, enz. Teixobactine, een recent beschreven antibioticum, werd ontdekt met behulp van de hierboven beschreven technologie11. Het vertoonde een nieuw mechanisme van antimicrobiële werking en bleek dodelijk te zijn tegen ziekteverwekkers die invasieve infecties veroorzaken, wat aantoont dat high-throughput isolatie van microben van microbiële "donkere materie" efficiënt kan worden gestroomlijnd voor de ontdekking van biotechnologisch relevante natuurlijke producten met behulp van deze technologie12.

Dit artikel dient als een procedurele gids voor de effectieve implementatie van deze high-throughput-technologie voor in situ teelt en herstel van antimicrobieel producerende recalcitrante bacteriën uit microbiële "donkere materie" in de bodem. Het protocol schetst het ontwerp van een isolatiechip, het verzamelen van monsters, monstervoorbereiding, zaaien, incubatie en herstel. Hoewel het gepresenteerde protocol in situ kweek van microben uit de bodem aantoont, kan hetzelfde gemakkelijk worden aangepast voor in situ kweek van microben uit elke omgeving. De high-throughput-mogelijkheden van deze technologie zouden de kans kunnen vergroten om nieuwe microben te ontdekken en hun biosynthetisch potentieel te benutten voor verschillende biotechnologische toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ontwerp en 3D-printen

  1. Kies het ontwerp en de grootte op basis van het type monster, het volume per diffusiekamer, de afmetingen van het te gebruiken membraan en de vereiste doorvoer (aantal diffusiekamers).
    OPMERKING: De dikte van de middelste plaat en de diameter van elk kanaal bepalen het volume van elke cilindrische diffusiekamer. De grootte is afhankelijk van het aantal afzonderlijke diffusiekamers dat moet worden ondergebracht, en de afmetingen van het membraan zijn rechtstreeks afhankelijk van het aantal diffusiekamers dat wordt afgedekt (Figuur 1).
  2. Gebruik de optie voor het invoegen van vormen in elk presentatiesoftwareprogramma om cirkels met de benodigde afmetingen in te voegen om als iChip te dienen. Voeg kleinere cirkels toe om de kanalen weer te geven. Schik de kleinere cirkels in het gewenste patroon om een voorlopig ontwerp voor te bereiden voor de boven-/onderkant en de middelste plaat. Selecteer het ontwerp en gebruik het rechtsklikmenu om het voorontwerp als afbeelding op te slaan.
  3. Gebruik het voorontwerp als sjabloon om een 2-dimensionaal (2D) ontwerp te maken met behulp van CAD-software (Computer-Aided Design).
    1. Voeg vanuit het schetsmenu vooraf gedefinieerde vormen in, voornamelijk cirkels, om het basisontwerp voor de platen en de reeks kanalen te maken.
    2. Gebruik de dimensieoptie om de werkelijke afmetingen van de platen en kanalen in te stellen. Klik op OK om het ontwerp af te ronden en gebruik vervolgens de extrudeerfunctie om het 2D-ontwerp om te zetten naar een 3D-model van de gewenste dikte.
    3. Gebruik ten slotte het bestandsmenu Opslaan om een kopie van het 3D-model op te slaan in de stereolithografie (STL) bestandsindeling, compatibel voor 3D-printen.
  4. Kies het materiaal om te printen op basis van de gewenste toepassing, rekening houdend met factoren zoals de voorkeursmethode van sterilisatie en de plaats van planten. Kies bijvoorbeeld voor een temperatuurbestendig materiaal als er autoclaaf wordt gebruikt voor sterilisatie of als ze worden geplant op een plek waar de temperatuur hoog is.
    OPMERKING: 3D-printen voor dit experiment werd uitgevoerd met behulp van een keramiekachtig materiaal dat bestand is tegen hoge temperaturen tot 268 °C en daarom autoclaveerbaar was.
  5. Kies een geschikte 3D-printmethode, afhankelijk van de afmetingen (detail en resolutie) en het gebruikte materiaal.
    OPMERKING: 3D-printen met behulp van stereolithografie, een additieve productiemethode, kan ingewikkelde structuren creëren door een thermohardende hars uit te harden met een ultraviolette (UV) laser. Stereolithografie kan met verschillende materialen worden gebruikt en maakt uitstekende oppervlakteafwerkingen en een hoge detailresolutie mogelijk.

2. Verzameling van bodemmonsters

  1. Download en installeer een mobiele applicatie voor geocodering waarmee sites van 3 m x 3 m over de hele wereld kunnen worden geïdentificeerd door een uniek adres van 3 woorden voor de site op te geven vanuit elke mobiele applicatiewinkel. Identificeer een locatie voor het verzamelen van bodemmonsters. Open vervolgens de mobiele applicatie voor geocodering om de interessante site en het unieke adres van drie woorden te identificeren.
  2. Noteer het unieke adres van drie woorden, de datum, het tijdstip, de diepte waarop het monster moet worden genomen, de weersomstandigheden, het planten- en dierenleven in de buurt, de blootstelling van de locatie en de temperatuur van de locatie (oppervlak en ondergrond op de gewenste diepte).
    OPMERKING: Grond kan pathogene bacteriën bevatten. Gebruik daarom de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjassen, enz.) en volg de protocollen die geschikt zijn voor bioveiligheidsniveau 2. Minimaliseer contact om besmetting en blootstelling van het monster te voorkomen. Desinfecteer het werkoppervlak voor en na het hanteren van grondmonsters.
  3. Ontsmet de schop door deze te besproeien met 70% ethanol en schoon te vegen. Ontsmet de polystyreendoos, waarin de grond moet worden opgevangen, door deze te besproeien met 70% ethanol en schoon te vegen. Laat de resterende ethanol volledig uitdrogen voordat u verder gaat.
    OPMERKING: Hoewel dit protocol een polystyreendoos gebruikt om het monster te verzamelen en incubatie uit te voeren, kunnen desgewenst ook alternatieven zoals glazen en metalen containers worden gebruikt.
  4. Verwijder al het plantaardig materiaal, bladafval en/of stenen van het oppervlak om de bovengrond bloot te leggen. Ontsmet de schop opnieuw zoals voorheen, verwijder de bovengrond en beoordeel de grond op een diepte van 3-6 inch onder de ondergrond. Gebruik een liniaal om de diepte vanaf het oppervlak te meten. Verzamel met behulp van de met het oppervlak gesteriliseerde schop 4-5 kg aarde van de gewenste diepte in de polystyreendoos.
  5. Sluit de doos af met een deksel. Als er meer dan één monster moet worden verzameld, ontsmet dan de schop tussen twee bemonsteringslocaties om kruisbesmetting te voorkomen. Zodra alle monsters zijn verzameld, transporteert u de monsters onmiddellijk terug naar het laboratorium.

3. Monstervoorbereiding voor het zaaien

  1. Weeg van het verzamelde grondmonster 1 g grond vrij van puin, stenen en bladafval af in een steriele centrifugebuis van 50 ml met 10 ml steriele zoutoplossing.
    OPMERKING: Bewaar een deel van het grondmonster als glycerolvoorraad 13,14 bij -80 °C om de inheemse microbiële populatie te behouden voor toekomstige behoeften.
  2. Meng de grond met de zoutoplossing door ongeveer 10 s te vortexen om een bodemsuspensie te creëren. Laat de centrifugebuis 5 minuten ongestoord staan om de grote gronddeeltjes in de buis te laten bezinken. Breng vervolgens de bovenstaande grondsuspensie voorzichtig over in een nieuwe reageerbuis met het label "S".
  3. Gebruik de grondsuspensie als onverdund monster en voer seriële verdunning uit door 1 ml van het monster over te brengen in 9 ml steriele zoutoplossing in een verse buis. Bereid verdunningen voor van 10-1 tot 10-5.
    OPMERKING: Het aantal platen van de verdunde grondsuspensies op niet-selectieve media kan enig inzicht geven in de dichtheid van bacteriën in het monster, die kan worden gebruikt om de juiste verdunning voor het zaaien te kiezen. Houd er echter rekening mee dat dit slechts een schatting is van de kweekbare bacteriën die in het monster aanwezig zijn.

4. Zaaien en monteren

  1. Ontsmet in een bioveiligheidskast de bovenplaat, bodemplaat en middenplaat door ze gedurende 10 minuten in 70% ethanol te weken. Spoel de overtollige ethanol af door de borden te wassen met steriel gedeïoniseerd water en laat ze aan de lucht drogen in een steriel petrischaaltje.
  2. Plaats de middelste plaat in een steriel petrischaaltje, klaar om te zaaien. Smelt vervolgens het SMS-agarmedium in een magnetron, laat het afkoelen en breng 22.5 ml SMS-agar bij 45 °C over in een centrifugebuis van 50 ml.
  3. Voeg hieraan 2,5 ml van een geschikte verdunning van het grondmonster toe en meng goed door zachte inversie, waarbij het binnendringen van luchtbellen wordt vermeden.
    OPMERKING: Kies een geschikte verdunning om te zaaien. Om een uiteindelijke zaaidichtheid te bereiken zoals in de 10-4-verdunning, kiest u de 10-3-suspensie, aangezien het monster verder 10-voudig wordt verdund in het medium dat voor het zaaien wordt gebruikt.
    1. Kies de zaaiverdunning om 1 cel per kamer te immobiliseren, die zich vervolgens in situ kan ontwikkelen tot een kolonie.
      OPMERKING: Gedestilleerd water kan ook worden gebruikt in plaats van SMS-medium om het bodemmilieu na te bootsen en om de groei van micro-organismen mogelijk te maken die alleen onder dergelijke omstandigheden groeien. Optioneel kunnen antischimmelmiddelen zoals cycloheximide ook aan het zaaimedium worden toegevoegd om schimmelgroei te voorkomen.
  4. Giet langzaam 3-4 ml van het gezaaide SMS-agarmedium over de middelste plaat en bedek het hele oppervlak. Laat het SMS-agarmedium vervolgens ongeveer 5-10 minuten opstijven. Controleer of het SMS-agarmedium is ingesteld. Schraap vervolgens met een steriel scheermesje de overtollige SMS-agar van het oppervlak van de plaat en laat de agarpluggen in de afzonderlijke diffusiekamers achter.
  5. Nadat u het beschermvel van een van de 0,03 μm polycarbonaat membraanfilters hebt verwijderd, plaatst u het voorzichtig met een steriele tang aan de binnenkant van de bovenplaat. Plaats vervolgens met een steriele tang nog een polycarbonaat membraanfilter van 0,03 μm op de blootgestelde zijde van de gezaaide middenplaat.
  6. Plaats de boven- en onderplaten, klem de middelste plaat en de polycarbonaatmembranen vast en zorg ervoor dat de schroefgaten in alle platen zijn uitgelijnd om de montage te voltooien (Figuur 1B). Draai de moeren en bouten vast om het geheel vast te zetten.
    OPMERKING: Het is een goede gewoonte om een controle-iChip te monteren met alleen steriele SMS-agar, zonder te zaaien, parallel en deze samen met de gezaaide iChip in de grond te planten om de afdichting te verifiëren. Dit zou het mogelijke binnendringen van microben uit de omgeving uitsluiten en als een negatieve controle fungeren.

5. In situ teelt en herstel

  1. Creëer met een steriele schop een holte die groter is dan de grootte van de iChip in de grond die in de polystyreendoos wordt verzameld. Plant het geheel verticaal in de holte en vul stevig met aarde, zorg ervoor dat alle oppervlakken volledig bedekt zijn. Houd dan rekening met in situ kweek voor de gewenste duur van 2-4 weken. Gebruik tijdens de incubatie steriel gedestilleerd water om de grond regelmatig te bevochtigen om te voorkomen dat de gezaaide SMS-agarpluggen in de diffusiekamers uitdrogen.
    OPMERKING: Door het geheel in een verticale positie te plaatsen, wordt voorkomen dat er continu water door de diffusiekamers sijpelt tijdens regelmatige bodembevochtiging, zoals kan gebeuren als het horizontaal wordt geplant.
  2. Maak na de gewenste incubatie de grond rond de geplante iChip voorzichtig los om deze te herstellen. Was het vervolgens met steriele zoutoplossing om aanhangende gronddeeltjes te verwijderen en breng het over naar een bioveiligheidskast voor verdere verwerking.
  3. Draai de moeren en bouten van het geheel los. Haal het vervolgens voorzichtig uit elkaar. Verwijder met een steriele tang de polycarbonaatmembranen en breng de middelste plaat over in de voorbereide petrischaal.
  4. Gebruik steriele houten applicators om de afzonderlijke agarpluggen in elke diffusiekamer te herstellen. Inoculeer de agarpluggen in de juiste media zoals SMS-agar of 0.1x tryptische sojabouillon-agar om laboratoriumteelt te proberen.
    OPMERKING: Gecultiveerde isolaten kunnen vervolgens worden gescreend op antimicrobiële productie door middel van routinemethoden zoals agar-overlay15.
  5. U kunt ook de teruggevonden agarpluggen die in situ gekweekte, recalcitrante bodembacteriën bevatten, kleuren en afbeelden om de groei van microkolonies onder in situ-omstandigheden te bevestigen.
    OPMERKING: Om de detectiegevoeligheid te verbeteren, kan de geplette agarprop ook worden gekleurd met fluorescerende kleurstoffen die bacteriën kunnen kleuren, gevolgd door fluorescentiemicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De iChip die in dit protocol wordt gebruikt, is ontworpen, 3D-geprint en geassembleerd zoals weergegeven in afbeelding 1. Het overzicht van het beschreven protocol is weergegeven in figuur 2. Het grondmonster dat voor het experiment werd gebruikt, werd verzameld op de IIT Jodhpur-campus in Rajasthan, India. Het unieke adres van de locatie in drie woorden was 'communicate.supervising.recurrence'. De gekozen locatie was een semi-a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De talrijke unieke habitats op aarde herbergen verschillende microbiële gemeenschappen die een enorme diversiteit vertegenwoordigen. Dit blijft onontgonnen vanwege beperkingen in het bieden van de juiste groeiomstandigheden die nodig zijn voor hun teelt. Sommige bacteriën zijn voor hun overleving afhankelijk van de metabolieten die door anderen worden vrijgegeven en kunnen daarom niet zelfstandig overleven in laboratoriumomstandigheden. Bovendien spelen bacteriën ook een cruciale rol bij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs onthullen geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

AV werd ondersteund door het Prime Minister's Research Fellowship (PMRF) -programma, Govt. van India. V.V. werd ondersteund door het Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship (INSPIRE) programma van het Department of Science & Technology, Govt. of India. Het bezoek van I.B. werd gedeeltelijk gefinancierd door een Fulbright APE-fellowship van USIEF. De auteurs danken het Department of Bioscience & Bioengineering en het Indian Institute of Technology Jodhpur voor de logistieke ondersteuning en het leveren van infrastructuur voor dit werk. Technische assistentie van Dr. Sudarshna Negi, mevrouw Aastha Kapoor, de heer Tamal Dey, de heer Bharat Pareek, de heer Ajeet Singh en andere leden van het Microbial Physiology Laboratory, IIT Jodhpur wordt dankbaar erkend.

ADSB-2024 Cohort van deelnemers

Het cohort van deelnemers aan de korte cursus over Antibiotic Discovery in Soil Bacteria (ADSB) 2024, georganiseerd bij het Department of Bioscience & Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur (namen alfabetisch gerangschikt):

Abinash Kumar Jena, Banishree Jali, Bharat Gurnani, Bharat Pareek, Dipro Mukherjee, Garima Kanwar Shekhawat, GT Vishnu, Jayita Sarkar, Krishna Saharan, Kriti Singhal, Lekh Raj, Mitta Bindusree, Phulen Sarma, Priyanka Kumari, Rachana Dinesh, Satyendra Singh en Swathi Sujith

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D PrinterProtolabs, USA1631-8333D printing service provider
Agarose Himedia, IndiaMB002Media component
Casamino AcidsSisco, India68806Media component
Casein Digest ASES, IndiaC5890Media component
Polycarbonate membraneSterlitech, USAPCT00347100Consumable
Potato StarchHimedia, IndiaGM403Media component
PowerPointMicrosoft, USAN/AGebruikt voor het maken van voorlopig ontwerp van iChip-componenten
PTC CreoPTC, USAN/AGebruikt voor 3D computerondersteund modelleren van iChip-componenten
Tryptic Soy BrothHimedia, IndiaM011Laboratoriummedium
What3WordsWhat3Words, UKN/AGebruikt voor het vastleggen van coördinaten van de bemonsteringslocatie

Referenties

  1. Ekkers, D. M., Cretoiu, M. S., Kielak, A. M., Van Elsas, J. D. The great screen anomaly-a new frontier in product discovery through functional metagenomics. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 1005-1020 (2012).
  2. da Cunha, B. R., Fonseca, L. P., Calado, C. R. C. Antibiotic discovery: Where have we come from, where do we go. Antibiotics. 8 (2), 8020045(2019).
  3. Rafiq, M., et al. Challenges and approaches of culturing the unculturable archaea. Biology. 12 (12), 1499(2023).
  4. Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nat Rev Chem. 5 (10), 726-749 (2021).
  5. Liu, X., Wang, M., Nie, Y., Wu, X. L. Isolation chip increases culturable bacterial diversity and reduces cultivation bias. Curr Microbiol. 78 (5), 2025-2032 (2021).
  6. Bollmann, A., Lewis, K., Epstein, S. S. Incubation of environmental samples in a diffusion chamber increases the diversity of recovered isolates. Appl Environ Microbiol. 73 (20), 6386-6390 (2007).
  7. Nichols, D., et al. Use of iChip for high-throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2445-2450 (2010).
  8. Polrot, A., Kirby, J. R., Olorunniji, F. J., Birkett, J. W., Sharples, G. P. iChip increases the success of cultivation of TBT-resistant and TBT-degrading bacteria from estuarine sediment. World J Microbiol Biotechnol. 38 (10), (2022).
  9. Jung, D., Liu, L., He, S. Application of in situ cultivation in marine microbial resource mining. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 148-161 (2021).
  10. Zhao, J., Shakir, Y., Deng, Y., Zhang, Y. Use of modified iChip for the cultivation of thermo-tolerant microorganisms from the hot spring. BMC Microbiol. 23 (1), (2023).
  11. Piddock, L. J. V. Teixobactin, the first of a new class of antibiotics discovered by ichip technology. J Antimicrob Chemother. 70 (10), 2679-2680 (2015).
  12. Lodhi, A. F., Zhang, Y., Adil, M., Deng, Y. Antibiotic discovery: combining isolation chip (iChip) technology and co-culture technique. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (17), 7333-7341 (2018).
  13. Sessitsch, A., Gyamfi, S., Stralis-Pavese, N., Weilharter, A., Pfeifer, U. RNA isolation from soil for bacterial community and functional analysis: evaluation of different extraction and soil conservation protocols. J Microbiol Methods. 51 (2), 171-179 (2002).
  14. Enright, D. J., Quaal, R., Verabeehu, A., Nguyen, A., Maddox, J., Glassman, S. I. Evaluating Best Practices for Isolating Pyrophilous Bacteria and Fungi from Burned Soil. bioRxiv. , (2024).
  15. Nkanga, E. J., Hagedorn, C. Detection of antibiotic-producing Streptomyces inhabiting forest soils. Antimicrob Agents Chemother. 14, 51-59 (1978).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In situ cultiveringisolatie van bodembacteri nrecalcitrante bacteri nmilieumicrobenontdekking van antimicrobi le middelenhigh throughput cultiveringdiffusiekamerverzamelen van bodemmonstersmicrobi le donkere materie

Gerelateerde artikelen