Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

Samenvatting

Deze methode beschrijft de exploitatie van het endogene signaal in een ARL13B-CENTRIN-2 transgeen muismodel om primaire cilia in situ in beeld te brengen, in drie dimensies over grote delen van gemineraliseerd weefsel, van weefselverzameling tot analyse van de organisatie van cilia's. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere soorten weefsels.

Samenvatting

Het primaire cilium is een niet-beweeglijk, solitair organel dat door de meeste celtypen wordt samengesteld. Het is essentieel voor de ontwikkeling en homeostase van het skelet en voor het coördineren van celreacties op biochemische en mechanische signalen uit hun omgeving. Vanwege de grootte op micrometerschaal is het primaire cilium moeilijk in situ af te beelden om in weefsels te karakteriseren, op een manier met hoge doorvoer en zonder optische vervormingen. Een goed begrip van de organisatie in zijn 3D-omgeving in vivo zal de sleutel zijn tot het begrijpen van de rol van ciliaire wezens in fysiologie en ziekte. De ARL13B-CENTRIN-2-muislijn presenteert een mCherry-tag op het ciliaire axoneem-eiwit ARL13B en een groen fluorescerend eiwit (GFP)-tag op het centriol-eiwit CENTRIN-2, gelokaliseerd aan de basis van het cilium. Deze muislijn maakt beeldvorming van het primaire cilium mogelijk zonder dat kleuring nodig is, waardoor het aantal stappen bij het verzamelen van afbeeldingen wordt verminderd en problemen met signaal-naar-ruis worden omzeild. Deze publicatie beschrijft een stap-voor-stap protocol om primaire trilharen in musculoskeletale weefsels in beeld te brengen met behoud van het fluorescerende signaal. Het beschrijft ook een universeel toepasbare pijplijn voor beeldanalyse, waardoor onbevooroordeelde kwantificering van cilia-kenmerken, zoals lengte en 3D-oriëntatie, mogelijk is.

Inleiding

Het primaire cilium is een essentieel organel in de ontwikkeling en homeostase van vele weefsels en organen, waaronder het skelet. Tijdens de postnatale groei reguleert het de mineralisatie van kraakbeen tijdens de endochondrale ossificatie¹. Bij mensen veroorzaken genetische mutaties die van invloed zijn op trilhaar-gerelateerde eiwitten een reeks ziekten en ontwikkelingsstoornissen, bekend als ciliopathieën. Een goed begrip van de organisatie van primaire trilharen in weefsels is belangrijk om te begrijpen hoe ze cellulair gedrag op orgaanniveau reguleren. Het is aangetoond dat de incidentie, lengte en oriëntatie van primaire trilharen binnen en tussen weefsels variëren, wat wijst op een rol voor weefselorganisatie voor hun functie ^2,3,4. De groeischijf, de laag kraakbeen aan het einde van lange botten waar de meeste postnatale botgroei plaatsvindt vanaf het vroege leven en tot en met de adolescentie, is een sterk georganiseerd weefsel met chondrocytcellen die in kolommen zijn gerangschikt. In de groeischijf doorlopen chondrocyten stadia van differentiatie, van rust tot proliferatie tot hypertrofisch.

Deze cellulaire organisatie gaat verloren in sommige ciliopathieën, wat suggereert dat primaire cilia een rol kunnen spelen bij het coördineren van deze cellulaire organisatie en/of op zijn minst geassocieerd kunnen zijn met cellulaire polarisatie. Bovendien lijkt de oriëntatie van de primaire trilharen een rol te spelen in hun mechanosensorische functie, waarbij verschillen worden waargenomen tussen dragende en niet-dragende gebieden in gewrichtskraakbeen⁴. Onze eigen recente studies hebben differentiële rollen geïmpliceerd binnen verschillende regio's van gewrichtskraakbeen en de groeischijf ^5,6. Eerdere studies die primaire trilharen in de groeischijf in beeld hebben gebracht, zijn beperkt tot 2D, dat informatie verliest met betrekking tot de organisatie van trilharen in weefsel, of zijn beperkt tot een klein aantal cellen in 3D, wat de schaal en kracht van de analyse vermindert ^7,8.

Een van de uitdagingen voor het in beeld brengen van het primaire cilium zijn de grootte op micrometerschaal en de niet-specificiteit van immunohistochemische antilichamen. Het gebruik van een native fluorescerend signaal zorgt voor een sterke lokalisatie en specificiteit. Natuurlijke fluorescerende signalen kunnen echter een uitdaging zijn om in beeld te brengen in gemineraliseerde weefsels, omdat het lange ontkalkingsproces om weefsels in paraffine in te bedden kan leiden tot signaalverlies. Het cryosectieren van monsters die in de oorspronkelijke staat zijn ingevroren, voorkomt dit verlies door het inbeddings- en sectieproces te versnellen.

Om primaire cilia in situ in beeld te brengen, werd een dubbele transgene muizenlijn gegenereerd door Bangs et al., die ADP-ribosylatiefactor-achtig eiwit (ARL13B) gefuseerd met mCherry en CENTRIN-2 gefuseerd met GFP⁹ tot expressie brengt. ARL13B is een klein GTPase gelokaliseerd in het primaire ciliummembraan, en CENTRIN-2 is een centriolair eiwit gelokaliseerd in de twee centrosomen aan de basis van het cilium^10,11. Met deze muislijn kunnen fluorescerend gelabelde primaire trilharen dus in beeld worden gebracht zonder dat er immunohistochemie nodig is.

Het hier beschreven protocol maakt gebruik van deze transgene lijn om primaire cilia in 3D in beeld te brengen in postnatale groeischijven van muizen met confocale microscopie, waarvoor alleen extra 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-kleuring nodig is. Honderden primaire trilharen in honderden cellen kunnen gezamenlijk worden afgebeeld en geanalyseerd in een weefselcontext. Een pijplijn voor beeldanalyse meet vervolgens de incidentie, lengte en oriëntatie van primaire trilharen in de verschillende regio's van de groeischijf. De pijplijn is ook in staat om deze kenmerken voor centriolen te kwantificeren. Een overzicht van de stappen in het protocol is weergegeven in figuur 1.

Protocol

Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische kaders van de Universiteit van Oxford en onder een projectlicentie zoals verleend door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken. Dit protocol werd uitgevoerd op muizen in de leeftijd van 2 tot 10 weken, maar zou werken in het kraakbeen van muizen na deze leeftijd.

1. Weefselafname

1. Euthanaseer muizen door een doos met de muizen te vullen met kooldioxide tot 80% van het volume en de concentratie gedurende 5 minuten te behouden. Voer cervicale dislocatie uit.
2. Ontleed het weefsel van belang.
   OPMERKING: Hieronder vindt u een protocol voor het ontleden van de knieën van het achterbeen, inclusief de scheenbeen- en dijbeengroeischijven en het gewrichtskraakbeen.
   1. Snijd in de huid bij de voet en snijd tot aan de bovenkant van de dij. Verwijder de huid van de incisielijn met een tang.
   2. Knip het spier- en vetweefsel van de benen.
   3. Om het been van het lichaam los te maken, snijdt u netjes door het dijbeen aan de bovenkant van de heup. Snijd de voet aan de onderkant van het scheenbeen.
   4. Verwijder eventueel overtollig spier- en vetweefsel dat op het been is achtergebleven.

2. Weefselfixatie en inbedding

OPMERKING: Zorg er tijdens het protocol voor dat het weefsel in het donker blijft om verlies van fluorescerend signaal te voorkomen.

1. Fixeer de tissue in 10% formaline bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
2. Breng de tissues 's nachts over op 2,5% formaline bij 4 °C.
3. Breng de weefsels over naar 30% sucrose in gedestilleerd water (dH₂O) en draai voorzichtig een nacht of gedurende 3 dagen bij 4 °C op kamertemperatuur. Vul de buisjes tot aan de bovenkant om volledige onderdompeling van het weefsel tijdens de rotatie te garanderen. Na deze incubatie zal het weefsel naar de bodem van de buis zinken.
4. Plaats een kleine hoeveelheid droogijs in een aparte doos en plaats de cryomold erop. Trek een lijn van super cryoembedding medium (SCEM) en plaats het ledemaat erlangs, met de knieschijf naar beneden gericht en het scheenbeen en dijbeen uit elkaar openen zodat het been zo plat mogelijk is. Houd op zijn plaats met een tang totdat de SCEM begint te stollen en het ledemaat niet meer beweegt als het niet wordt vastgehouden.
5. Bedek volledig met SCEM en vul de vorm tot aan de bovenkant. Plaats het monster in de droogijskist en houd het monster plat om beweging van het weefsel te voorkomen, totdat de SCEM volledig stolt.
6. Breng over naar -20 °C.

3. Secties

1. Haal het blok uit de mal en knip het af tot een maat die op de klauwplaat van een cryostaat past. Bevestig het blok aan de klauwplaat door SCEM op de klauwplaat aan te brengen en het blok erop te plaatsen.
2. Laat in de cryostaat minstens 5 minuten stollen bij -20 °C.
3. Bevestig de boorkop aan de monsterhouder en een mes aan de meshouder.
4. Knip het blok af totdat de tibiale groeischijf is bereikt. Idealiter doorsnede met het scheenbeen naar boven gericht.
5. Knip cryofilmtape op een formaat dat past bij het monster met voldoende ruimte eromheen. Monteer de cryofilm op het snijvlak en zorg met een passend gereedschap voor een goede hechting van de cryofilm. Snijd 40-60 μm dikke secties om tweecellige dikke secties te verkrijgen. Verzamel de tape met behulp van een tang en plaats deze op een objectglaasje, met de monsterzijde naar boven, en de tibiale groeischijf in lijn met het korte glaasje van het objectglaasje.
6. Bewaar de objectglaasjes bij -20 °C.

4. Voorbereiding en montage van de dia

1. Ontdooi de dia horizontaal bij kamertemperatuur.
2. Was de dia 3 x 5 minuten met een druppel PBS om de SCEM te verwijderen.
3. Kleur met 10 μM DAPI gedurende 1 minuut.
4. Was de dia 2 x 5 minuten met een druppel PBS.
5. Monteer, dek af met een dekglaasje en laat een nacht op kamertemperatuur staan. Sluit de randen van het dekglaasje af met dekglaasjeskit.
6. Afbeelding de volgende dag.

5. Beeldvorming door confocale microscopie

OPMERKING: De resolutie van het 40x/1.4-objectief op de gebruikte confocale microscoop is 240 nm.

1. Stel de microscoop in.
   1. Zet de microscoop aan en open de software. Klik op de knop Systeem .
   2. Klik op het tabblad Acquisitie op Smart Setup om de kanalen in te stellen. Selecteer en voeg de GFP-, mCherry- en DAPI-kanalen toe. Selecteer de Airyscan-optie en de SR8Y-functie in de Airyscan-driehoek (tussen resolutie en snelheid-multiplex 8Y). Klik op Beste signaal | OK (aanvullende figuur S1A).
   3. Selecteer op het tabblad Lokaliseren onder Microscoopbediening het 40x/1.4-objectief met olieonderdompeling.
2. Zoek de regio waarin u geïnteresseerd bent.
   1. Plaats de schuif in de schuifhouder en breng het objectief omhoog totdat de olie het dekglaasje raakt.
   2. Plaats de groeischijf of een ander interessegebied onder het lichtpad.
   3. Klik op het tabblad Zoeken op Fluorescentie, selecteer DAPI en verplaats met behulp van het oculair de diahouder met de joystick om de groeischijf of het interessegebied onder het gezichtsveld te plaatsen.
   4. Selecteer op het tabblad Acquisitie alleen het DAPI-kanaal .
   5. Klik op Doorlopend om het beeld van dat kanaal op het scherm te bekijken en zorg ervoor dat de groeischijf in beeld is.
   6. Open de tegelviewer door op het tabblad Tegels op Viewer weergeven te klikken. Voeg het aantal benodigde tegels toe (meestal 1 tegel in de x-richting en 3-5 in de y-richting) en klik op Voorbeeld en Start (Aanvullende Figuur S1B).
   7. Controleer of de tegels de drie zones van de groeischijf bedekken: rust, proliferatie en hypertrofie. Pas de positie en het aantal tegels naar wens aan.
3. Stel de beeldvormingsparameters in.
   1. Klik op Doorlopend in het tabblad Acquisitie . Pas op het tabblad Kanalen de versterking (master) en het laservermogen aan om de kernen duidelijk op het scherm weer te geven. Laat de Airyscan-detector uitlijnen. Open het venster voor het aanpassen van de Airyscan-detector door op het betegelde rozetsymbool onder aan het venster te klikken; zodra het is uitgelijnd, worden alle tegels groen (aanvullende afbeelding S1C).
   2. Selecteer de GFP- en mCherry-kanalen afzonderlijk en herhaal deze stappen: stel de versterking (master), laservermogen in en lijn de Airyscan-detector uit.
   3. Selecteer alle drie de kanalen en klik op Continu. Laat de Airyscan-detector uitlijnen.
   4. Definieer op het tabblad Acquisitiemodus de waarden Afbeeldingsgrootte, Pixel, Grootte, Framegrootte, Snelheid en Gemiddelde. Zie aanvullende afbeelding S1D,E voor waarden van de instellingen van de acquisitiemodus, versterking (master) en laservermogen voor de gebruikte kanalen.
4. Verkrijg afbeeldingen.
   1. Klik op het tabblad Acquisitie op het selectievakje Z-Stack .
   2. Met alleen het DAPI-kanaal geselecteerd, klikt u op Continu om de afbeelding op het scherm te bekijken. Verplaats het doel naar het dichtstbijzijnde vlak dat moet worden afgebeeld. Klik op het tabblad Z-Stack op Eerste vlak instellen , focus weg naar het laatste vlak dat moet worden bekeken en klik op Laatste vlak instellen . Afbeelding 30-40 μm z-stacks.
   3. Stel het interval in op 0,15 μm.
   4. Ga naar het midden van de z-stack. Klik op het tabblad Tegels , onder Tegelgebieden, op Verifiëren en klik op Z instellen en ga naar de volgende.
   5. Controleer op het tabblad Focusstrategie of de focusstrategie is ingesteld op Z-waarden/focusoppervlak gebruiken dat is gedefinieerd in de tegelinstellingen.
   6. Klik op Experiment starten om de beeldacquisitie te starten.
5. Beeldverwerking
   1. Selecteer op het tabblad Verwerking de optie Enkelvoudige of Batchmodus . Selecteer Airyscan-verwerking. Vink 3D-verwerking aan en selecteer Standaard autofilter. Selecteer de verkregen onbewerkte afbeelding en begin met verwerken (aanvullende afbeelding S2A).
   2. Zodra de Airyscan-verwerking is voltooid, selecteert u Naaien in de verwerkingsmethoden. Selecteer Nieuwe uitvoer, Tegels fuseren, Arcering corrigeren en Alles op verwijzing, met de verwijzing als DAPI. Selecteer de door Airyscan verwerkte afbeelding en begin met verwerken (aanvullende afbeelding S2B).
   3. Sla de onbewerkte en dubbel bewerkte afbeeldingen op. Deze laatste wordt automatisch opgeslagen in de batchmodus .

6. Beeldanalyse

OPMERKING: De hier gebruikte analysepijplijn is aangepast aan de doeleinden van dit onderzoek. De details van de pijpleidingoperaties worden weergegeven in aanvullende figuur S3.

1. Importeer het czi-afbeeldingsbestand in de software. Open het analysepaneel; selecteer in de vervolgkeuzelijst Nieuwe pijplijn...
2. Als u een pijplijn voor celdetectie wilt maken, importeert u de Cellpose Python Segmenter in de pijplijn¹². Stel Model_Name in op cyto2, Input_channel op 2, Second_channel op 3, Diameter_in_μm op 10, Flow_threshold op 0,4 en Cellprob_threshold op 0. Voeg een Import Document Objects (hernoemd naar Import Manual Labels) toe vóór en een Object Feature Filter (hernoemd naar Size Filter) operator na de pijplijn door te klikken op + Bewerking toevoegen. Zie aanvullende afbeelding S3A voor de waarden van de pijplijninstellingen.
   1. Verplaats de kijker naar het eerste interessante vlak
   2. Klik op het pictogram van het gereedschap Objecten tekenen
   3. Klik op het pictogram van de Polygoonmodus
   4. Teken het te analyseren gebied
   5. Verplaats de kijker naar het laatste interessante vlak
   6. Teken het te analyseren gebied
   7. Klik op het groene vinkje Wijzigingen toepassen
   8. Klik op het pictogram Tabel met objecten weergeven
   9. Klik met de rechtermuisknop op het gemaakte object en selecteer Naam van object wijzigen om de naam van het object te wijzigen in een toepasselijke naam. Klik met de rechtermuisknop op het gemaakte object en klik op Tag toevoegen. Voeg een tag toe met de naam Analyseregio.
3. Voer deze pijplijn uit door op de blauwe pijl naar voren boven aan het deelvenster Analyse te klikken.
4. Als u een primaire detectiepijplijn voor cilia en centriolen wilt maken, opent u het analysepaneel en selecteert u in de vervolgkeuzelijst Nieuwe pijplijn.... Voeg de volgende operatoren toe aan de pijplijn: Documentobjecten importeren (hernoemd naar Handmatige labels importeren), twee Intensity Threshold Segmenter-operators (hernoemd naar Cilia Threshold en Centriole Threshold), Splitting (hernoemd naar Centriole Splitting), Object Feature Filter (hernoemd naar Centriole Splitting size filter) en Compartiment (hernoemd naar Compartiment - Cel). Zie aanvullende figuur S3B voor de waarden van de pijplijninstellingen.
5. Voer deze pijplijn uit door op de blauwe pijl naar voren boven aan het deelvenster Analyse te klikken.
6. Open het venster Objecten . Klik op Im/Export..., selecteer Excel Export.... Selecteer de volgende functies om op te slaan: # Kinderen, Naam, Bovenliggende namen, 3D-georiënteerde grenzen Korte zijde, Middelste zijde, Lange zijde, Hoek XY, Hoek XZ, Hoek YZ, Begrenzingsvak X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, MaatX, GrootteY, MaatZ, Middelpunt van de geometrie X, Y, Z, Vlak Eerste, Laatste, Aantal, Sfericiteit (Mesh), Volume (Mesh), Oppervlakte (Mesh).

Resultaten

De groeischijf van de 6 weken oude muis werd in beeld gebracht met behulp van het beschreven protocol en de organisatie van de primaire trilharen werd in het weefsel in kaart gebracht. Een beeld van alle drie de regio's van de groeischijf - rustend, proliferatief en hypertrofisch - werd vastgelegd en door de analysepijplijn gehaald (Figuur 2A). Individuele cellen kunnen worden geïdentificeerd met de DAPI-kleuring, met hun ciliaire axoneem in rood en hun centriolen in groen. De resolutie met deze methode is hoog genoeg om individuele centriolen te onderscheiden (Figuur 2B). Met deze resolutie kunnen de trilharen worden gevisualiseerd in hun 3D-omgeving, wijzend in verschillende richtingen (Video 1).

Beelden met een lagere resolutie, met objectieven met een hogere vergroting, kunnen ook worden vastgelegd om primaire trilharen over een groter weefselgebied te visualiseren; deze zijn echter niet geschikt voor analyse van de oriëntatie van de trilharen in 3D. Zo werden de primaire trilharen in het gewrichtskraakbeen in beeld gebracht met het 20x-objectief, wat aantoont dat de methode ook op andere weefsels werkt (Figuur 2C). Bij deze resolutie kunnen de ciliaire axonemen in rood worden geïdentificeerd, maar de centriolen zijn moeilijker te onderscheiden. Subchondraal bot heeft de neiging om veel GFP-achtergrondsignaal te vertonen, waardoor de identificatie van centriol in dit weefsel moeilijk is.

De pijplijn kan individuele cellen, primaire trilharen en centriolen detecteren, en het werkt voor goed georganiseerde jonge groeischijven en oudere groeischijven waar de kolommen minder goed gedefinieerd zijn, zoals bij muizen van 10 weken oud (Figuur 3). Cellen en trilharen worden in 3D gedetecteerd, zoals te zien is in de z-stack.

Figuur 1: Experimentele workflow. Stroomschema van de verschillende stappen in het protocol, van weefselafname tot beeldanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Primaire cilia in muizenweefsel van de ARL13B-CENTRIN-2 muis. (A) Een 6 weken oude groeischijf, met DAPI in wit, CENTRIN-2 in groen en ARL13B in rood, afgebeeld met het 40x objectief. (B) Zoom in op een individueel primair cilium en zijn twee centriolen. (C) Gewrichtskraakbeen en subchondraal bot van een 4 weken oude muis, afgebeeld met het 20x objectief. (D) Nier van een muis van 6 weken oud, afgebeeld met behulp van dezelfde pijplijn als voor musculoskeletaal weefsel. (E) Vergroting van de witte doos in D met individuele primaire cilia en hun centriolen in de nier. Schaalbalken = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Pijplijn voor het detecteren van cellen en trilharen. Voorbeeld van toepassing van de beeldanalysepijplijn op een groeischijf van 10 weken oud. (A) Afbeelding geopend in de software. (B) Resultaat van de celdetectiepijplijn. (C) Resultaat van de detectiepijplijn voor trilharen en centriolen. Trilharen zijn in roze en centriolen in groen. Het zijaanzicht illustreert dat de resolutie hoog genoeg is om trilharen die in verschillende richtingen zijn georiënteerd in 3D te onderscheiden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1: Driedimensionale reconstructie van een 6 weken oude groeischijf van de ARL13B-CENTRIN-2 muis. De driedimensionale reconstructie werd uitgevoerd in de Imaris-software en opgenomen als een animatievideo. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Instellingen voor beeldacquisitie op het microscoopsysteem. (A) Smart Setup-venster om de kanalen toe te voegen en de Airyscan-modus te kiezen. (B) Tegelviewer om de tegels naar afbeelding te selecteren en te bekijken. (C) Aanpassingsvenster voor de Airyscan-detector , waar de uitlijning van de Airyscan-detectoren wordt bevestigd zodra alle tegels groen worden. (D) Laserinstellingen voor de drie kanalen. (E) Instellingen voor Acquisitiemodus en Z-Stack. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding S2: Instellingen voor beeldverwerking op het microscoopsysteem. (A) Instellingen voor Airyscan-verwerking. (B) Instellingen voor stikken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding S3: Pijplijnen voor aangepaste beeldanalyse. (A) Pijplijn voor celdetectie met behulp van de GFP- en DAPI-kanalen. (B) Primaire cilia- en centrioldetectiepijplijn met behulp van respectievelijk de mCherry- en GFP-kanalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In dit protocol is het essentieel om direct na het verzamelen door te gaan met de stappen voor weefselverwerking en inbedding. De blokjes en glaasjes weefsel zijn echter minimaal 3 maanden houdbaar bij -20 °C. Verschillende stappen in dit protocol kunnen worden aangepast aan verschillende toepassingen, met name sectiedikte, vergroting en z-stack-parameters. Dit heeft invloed op de diepte van de beeldvorming en de verkregen resolutie. Veranderingen in het numerieke diafragma en de resolutiemodus konden worden gebruikt om een nog hogere resolutie te verkrijgen en de intervalgrootte van de z-stacks kon worden verkleind. Dit zou echter de beeldvormingstijd verlengen of de grootte van het gezichtsveld dat kan worden afgebeeld verkleinen. De beschreven beeldvormingsparameters zijn de minimumvereisten die zijn geïdentificeerd voor 3D-analyse van de oriëntatie van primaire trilharen.

De keuze van het montagemedium is belangrijk om een hoge resolutie te verkrijgen. De brekingsindex van het montagemedium moet vergelijkbaar zijn met die van het onderdompelingsmedium om beelddegradatie in de z-stack te minimaliseren. De brekingsindex van het dekmiddel en de dompelolie die hier worden gebruikt, hebben een brekingsindex van respectievelijk 1,52 en 1,518. De Airyscan-functie op de confocale microscoop die hier wordt gebruikt, biedt beelden met een superresolutie. Andere superresolutiemicroscopen kunnen worden gebruikt; We ontdekten echter dat de confocale modus alleen niet voldoende was om de resolutie te verkrijgen die nodig is voor de grootte van de afgebeelde gebieden. De maximale resolutie van de Multiplex SR-8Y Airyscan-modus is 120/160 nm in x/y en 450 nm in z, en een maximaal aantal frames/s van 47,5. We ontdekten dat de Multiplex SR-4Y Airyscan-modus, die een maximale resolutie van 140 nm in x/y en 450 nm in z presenteert, maar beelden op de helft van de snelheid met een maximaal aantal frames/s van 25, geen significant verschil oplevert voor het afbeelden van primaire trilharen in 3D. Evenzo zou de Airyscan superresolutie (SR) -modus, die de hoogste resolutie op deze microscoop biedt - 120 nm in x / y en 350 nm in z - langer duren om in beeld te brengen, aangezien het maximale aantal frames / s 4,7¹³ is.

Het GFP-achtergrondsignaal kan worden waargenomen in andere weefsels, zoals de spier. Om dit te minimaliseren, kan het bereik van de lasers worden verkleind om overlap met andere golflengten te verminderen. Deze lijn is eerder gebruikt om primaire trilharen in het embryo, primaire celculturen, spiervezels en het retinale pigmentepitheel in beeld te brengen ^9,14,15. We hebben met succes primaire trilharen in nier-, kraakbeen- en botweefsel in beeld gebracht. Enige optimalisatie van beeldvormingsinstellingen zal waarschijnlijk nodig zijn voor verschillende weefsels; Dit cryosectieprotocol moet echter zorgen voor behoud van het signaal.

Secties met twee cellen dik (40-60 μm) zijn voldoende om 3D-oriëntatie-informatie in de groeischijf te verkrijgen, omdat dit beeldvorming van hele cellen en hun primaire trilharen mogelijk maakt. Voor andere weefsels waar cellen groter zijn dan chondrocyten, zoals adipocyten, kunnen dikkere secties nodig zijn om celpopulatiegegevens te verzamelen. Afhankelijk van de diepteresolutie van de gebruikte microscoop, is het mogelijk dat het niet mogelijk is om diep in dikkere secties te beelden. Technieken voor het opruimen van weefsel zouden waarschijnlijk leiden tot verlies van het endogene mCherry- en GFP-signaal vanwege de tijd die het vereist. Dit werd onderzocht, aangezien opruimingsmethoden werden gebruikt voor andere beeldvorming in de ledemaat, maar dit werd in deze context niet nodig geacht. Onze ervaring met endogene CD31-RFP suggereerde dat clearingtechnieken zorgvuldige, op maat gemaakte optimalisatie van de bemonstering nodig zouden hebben.

Deze ARL13B-CENTRIN-2-lijn kan worden gekruist met andere muislijnen om de organisatie van primaire cilia in weefsels verder te bestuderen. We hebben het bijvoorbeeld gekruist met een aggrecan-Cre IFT88^fl/fl om IFT88, een primair cilia-eiwit waarvan de deletie ciliatie voorkomt, voorwaardelijk uit te schakelen in cellen die aggrecan tot expressie brengen (postnatale chondrocyten)^5,6. Deze ARL13B- en CENTRIN-2 fluorescerende signalen kunnen vervolgens worden gebruikt om de efficiëntie van genetische verstoringen op het niveau van de ciliaire structuur in weefsels en eventuele bijbehorende veranderingen in de ciliaire organisatie te meten. Lopend werk doet momenteel precies dit. Ons eerste doel zal zijn om, met deze robuustere methodologie, het effect van IFT88-deletie op de prevalentie van cilia te kwantificeren. Eerder hebben we dit gemeten met behulp van immunofluorescentie en dit geschat op een vermindering van 20%⁶. Deze methode kan ook worden gecombineerd met immunohistochemie om primaire trilharen in beeld te brengen in combinatie met andere eiwitten, bijvoorbeeld een celmembraaneiwit.

Het transgen op ARL13B kan een effect hebben op de expressie van ARL13B en de lengte van de primaire trilharen. Eerdere studies hebben verschillende lengtes van primaire cilia gemeten met de ARL13B-CENTRIN-2-lijn in vergelijking met niet-transgene ARL13B in bepaalde delen van de hersenen van de muis, zonder verschil in andere¹⁶. Een andere studie observeerde verschillen in de lengte van primaire cilia in een GFP-gelabelde ARL13B-muislijn in vergelijking met niet-gelabelde ARL13B in embryonale fibroblasten van muizen¹⁰. Lopend werk is het verifiëren van eventuele veranderingen in de lengte van de primaire cilia in de groeischijf en andere weefsels door de resultaten te vergelijken met behulp van de ARL13B-CENTRIN-2-muislijn met antilichaamkleuring tegen niet-transgene ARL13B.

De beeldanalysepijplijn in dit protocol is ontworpen om vervolgens het ciliatiepercentage, de lengte en de 3D-oriëntatie van primaire trilharen te meten, evenals het aantal centriolen en de positie in de groeischijf. Met de beeldanalysesoftware kunnen aangepaste pijplijnen worden gemaakt door de betrokken stappen te wijzigen. De uitvoer van deze pijplijn is een spreadsheet met de metingen van de gekozen kenmerken voor de gedetecteerde cellen, trilharen en centriolen. Postanalyse kan vervolgens worden uitgevoerd in R of andere software, afhankelijk van de doeleinden van het onderzoek. Net als bij de beeldvormingsinstellingen kunnen de pijplijnstappen en specifieke instellingen worden gewijzigd om aan verschillende afbeeldingen en volgens de doelstellingen van het onderzoek te werken. Over het algemeen maakt deze methode een high-throughput analyse van primaire cilia mogelijk dan eerder is gepubliceerd in de groeischijf. Het aantal cellen en bijbehorende trilharen dat kan worden bestudeerd, maakt grotere en betrouwbaardere metingen mogelijk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
22 x 50 mm dekglasjes	fisherscientific	12373128
arivis Vision4D software	Zeiss	N/A	Beeldanalysesoftware
Confocal laser scanning microscoop	Zeiss	Zeiss 980 Airyscan 2
CoverGrip Dekglaskleefstof	Biotium	23005
Cryofilm type 3C(16UF) (bladtype) 2,0 cm breed	Section-lab	C-FUF303	Te kopen bij Section-lab direct
Cryostat	Leica	CM1900 UV
DAPI	invitrogen	D1306
Disponibel basisvormen	epredia	58952
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	gibco	14190
Formaline	Sigma	20260630
Imaris software	Oxford Instruments	N/A	Beeldanalysesoftware voor 3D reconstructie
Dompelolie 518F	Zeiss	ISO 8036
Microtoommessen	Feather	02.075.00.006
SlowFade Glass Antifade Mountant	invitrogen	S36917
Sucrose	Sigma	S9378
Super Cryoembedding Medium (SCEM)	Section-lab	C-EM001	Te kopen bij Section-lab direct
Superfrost Plus Microscoopglazen	avantor	631-0108
Zen software	Zeiss	N/A	Freeware voor confocale laser scanning microscopie