Methodenartikel

Het craniale Neurale Protocol van de Lijstcellen Driedimensionaal in vitro Differentiatie voor Gemultiplexte Analyse

DOI:

10.3791/67695

⸱

14 februari 2025

 ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Inserm, Institut Cochin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een driedimensionaal (3D) in vitro differentiatieprotocol dat neurosferen van reproduceerbare grootte genereert om craniale neurale lijstcellen te produceren uit embryonale stamcellen van muizen. We laten zien dat deze methodologie de variabiliteit vermindert in vergelijking met eerdere protocollen en hoe deze kan worden gebruikt voor multiplexed assay om de ontwikkeling van craniale neurale lijstcellen te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met hun opmerkelijke vermogen om zowel ectodermale als mesenchymale derivaten te genereren, hebben craniale neurale lijstcellen (CNCC) veel belangstelling getrokken voor het bestuderen van de mechanismen die beslissingen over het lot van cellen en plasticiteit reguleren. Deze celpopulatie is afkomstig uit het dorsale neuro-epitheel en is van voorbijgaande aard en relatief zeldzaam in het zich ontwikkelende embryo - waardoor functionele tests, genomische screenings en biochemische tests een uitdaging zijn om in vivo uit te voeren. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn er verschillende methoden ontwikkeld om CNCC-ontwikkeling in vitro te modelleren.Op neurosfeer (NS) gebaseerde kweekmethoden bieden een complexe micro-omgeving die het zich ontwikkelende anterieure neuro-epitheel in 3D recapituleert. Deze systemen maken de groei van veel NS in dezelfde plaat mogelijk om een grote hoeveelheid CNCC te genereren, maar de geproduceerde NS vertonen een hoge variabiliteit in vorm, grootte en aantal gevormde CNCC's, waardoor kwantitatieve tests moeilijk uit te voeren zijn. Dit protocol schetst een reproduceerbare methode voor het genereren van NS uit embryonale stamcellen van muizen (mESC) in een formaat met 96 putjes. NS gegenereerd in platen met 96 putjes produceert craniale neurale lijstcellen (CNCC), die verder kunnen worden gekweekt. Door het aantal startcellen te beheersen, vermindert deze aanpak de variabiliteit in de grootte en vorm tussen NS en verhoogt het de reproduceerbaarheid tussen experimenten. Ten slotte is dit cultuursysteem aanpasbaar aan verschillende toepassingen en biedt het een hogere mate van flexibiliteit, waardoor het in hoge mate aanpasbaar is en geschikt is voor het multiplexen van experimentele omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Craniale neurale lijstcellen (CNCC) zijn een stamachtige celpopulatie die ontstaat in het voorste deel van het zich ontwikkelende embryo, op de grens tussen de neurale plaat en het oppervlak ectoderm1. CNCC ondergaat vervolgens een epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT), delamineert van het neuro-epitheel en migreert dorsoventraal naar verschillende locaties in het embryo waar ze differentiëren in een grote verscheidenheid aan celtypen2. Het bestuderen van deze celpopulatie is van groot belang omdat het een opmerkelijke plasticiteit bezit3 en het unieke vermogen om te differentiëren in zowel ectodermale als mesenchymale derivaten, zoals craniofaciale botten en kraakbeen4. Hoewel CNCC relatief toegankelijk zijn in het embryo, zijn ze een voorbijgaande populatie met een laag aantal cellen, waardoor systemische mechanistische studies moeilijk in vivo kunnen worden uitgevoerd. CNCC-cellijnen zijn de afgelopen jaren geïsoleerd en gekarakteriseerd om deze beperkingen te overwinnen. Met name de O9-1 CNCC-cellijn is een geweldig hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkeling van migrerende en postmigrerende neurale toppen 5,6; Deze cellijn maakt het echter niet mogelijk om de vroege gebeurtenissen voorafgaand aan de migratie te bestuderen die leiden tot inductie en specificatie van de neurale lijst. In dit opzicht zijn er belangrijke ontwikkelingen geweest in de ontwikkeling van in vitro differentiatieprotocollen om CNCC in een schaal te differentiëren via het gebruik van 3D-structuren die lijken op het zich ontwikkelende neuro-epitheel, neurosferen (NS)7,8 genaamd, verkregen na differentiatie van embryonale stamcelkolonies (ESC). Deze 3D-protocollen produceren op robuuste wijze grote aantallen CNCC, waardoor biochemische en genomische mechanistische studies kunnen worden uitgevoerd 9,10. NS worden gekweekt op platen met een lage hechting in met N2B27 aangevuld medium, samen met fibroblastgroeifactor (FGF) en epidermale groeifactor (EGF)10,11 om celproliferatie te stimuleren. Deze protocollen worden uitgevoerd in petrischalen, waarbij meerdere NS op dezelfde plaat worden gekweekt. Binnen de groeiende NS aggregeren cellen en blijven ze zich delen - ze bereiken een diameter van 100-200 μm op volwassen leeftijd. Op de vervaldag (ongeveer dag 5) hechten NS zich aan het substraat en differentiëren ze in CNCC die lijkt op hun in vivo tegenhangers 9,12. Deze CNCC ondergaan vervolgens EMT en delamineren op het plaatoppervlak. Morfologische verschillen kunnen worden waargenomen, afhankelijk van de NS-grootte, aangezien grotere bollen in de kern donkerder zullen lijken als gevolg van een lagere beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof, wat leidt tot cellen die apoptose13 ondergaan. Hoewel dit type procedure een groot aantal CNCC genereert aan het eindpunt van differentiatie, vertoont het verschillende beperkingen, waardoor de studie van de verschillende moleculaire dynamieken die tijdens het differentiatieproces plaatsvinden, bijna onmogelijk is. Ten eerste maakt het gebruik van ESC-kolonies - die in grootte variëren - het moeilijk om het startcelaantal voor elk experiment te controleren. Dit resulteert in het genereren van NS in verschillende vormen en diameters die zich anders ontwikkelen door specifieke signaalroutes te activeren, wat leidt tot veranderde celdifferentiatie en dus geen uniform monster vormt op een bepaald tijdstip. Ten tweede leidt het kweken van meerdere NS in dezelfde plaat er vaak toe dat ze14 samensmelten en mogelijk signaalmoleculen vrijgeven die de micro-omgeving van hun buren en dus hun ontwikkeling beïnvloeden. Al met al genereren deze procedures veel variabiliteit tussen monsters en experimenten.

Hier presenteren we een strategie om deze moeilijkheden te overwinnen die een enkele NS genereren - die in staat is om CNCC te produceren - door muizen-ESC (mESC) samen te voegen in niet-TC behandelde U-bodemplaten met 96 putjes. Starten met mESC maakt het mogelijk om het specificatieproces en de vroege stadia van CNCC-ontwikkeling te bestuderen in vergelijking met het starten met reeds gevestigde neurale lijstcellijnen. Dit protocol begint met de desaggregatie van mESC-kolonies om een enkele celsuspensie te verkrijgen, gevolgd door het zaaien van een specifiek aantal mESC in elk putje van een niet-TC behandelde U-bodem 96-putjesplaat. De cellen worden twee dagen geaggregeerd en vervolgens verplaatst naar een niet-TC behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem, waarin NS zich aan de plaatbodem kan hechten. Door het startcelaantal en de micro-omgeving van elke NS tijdens het differentiatieproces te controleren, vermindert dit protocol de monstervariabiliteit, wat de experimentele reproduceerbaarheid verhoogt. Wij geloven dat dit een handig platform zal zijn voor het ontwerpen van gemultiplexte experimenten, zoals het testen van het effect van verschillende kweekomstandigheden of het uitvoeren van genverstoringsschermen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Genereren van een eencellige suspensie uit ESC-kolonies van muizen

OPMERKING: Dit protocol is aangepast aan het gebruik van CK35 mESC (een mESC-lijn die bekwaam is voor kiembaanoverdracht, om vervolgens de mogelijkheid te hebben om in vivo modellen15 te ontwikkelen) gekweekt op geïnactiveerde feeders in een met gelatine beklede TC-behandelde plaat met 6 putjes. Eén putje van een met TC behandelde plaat met 6 putjes zou ongeveer 1,5 × 106 mESC moeten opleveren, wat voldoende is voor de rest van het protocol. Dit kan indien nodig worden opgeschaald. Pas de eerste stappen aan in overeenstemming met de gekozen ESC-stam- en onderhoudscultuurmethode, evenals het juiste kweekmedium. Dit protocol moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Begin met mESC bij een samenvloeiing van 70%-80% geteeld in mESC-kweekmedium. Zie Tabel 1 voor de samenstelling van het mESC-kweekmedium dat in dit onderzoek is gebruikt.
    OPMERKING: Laat mESC niet meer dan 80% samenvloeien, omdat ze zullen gaan differentiëren en dit zal het aggregatieproces beïnvloeden. Kolonies moeten compact zijn en een gezonde morfologie vertonen (geen scheuren of golven, duidelijk nucleair-cytoplasma-contrast).
  2. Bereid CNCC-differentiatiemedium voor. Zie tabel 1 voor de samenstelling van het CNCC-differentiatiemedium.
    OPMERKING: Nadat groeifactoren zijn toegevoegd, kan het medium maximaal 3 weken bij 4 °C worden bewaard. Zorg ervoor dat het medium beschermd is tegen licht.
  3. Bereid een verse collagenaseoplossing met een concentratie van 2 mg/ml in het DMEM-Knockout-medium.
    OPMERKING: Het gebruik van collagenase zorgt ervoor dat alleen de kolonies worden losgemaakt en niet de feeders, omdat hun aanwezigheid in de volgende stappen de NS-aggregatie zal verstoren. Filtreer de collagenaseoplossing voor gebruik met een filter van 0,22 μm.
  4. Zuig het ESC-medium op van mESC.
  5. Voeg voorzichtig 1 ml PBS toe aan de zijkant van de put. Schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige wasbeurt te garanderen.
  6. Verwijder PBS en vervang door 2 ml collagenaseoplossing. Incubeer bij 37 °C gedurende 30-45 minuten.
    1. Controleer de plaat onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 10x na de eerste 20 minuten en vervolgens elke 5 minuten.
    2. Wanneer de kolonies opgerolde randen vertonen, tik je krachtig op de plaatzijde en de kolonies zullen loskomen.
  7. Verzamel met een serologische pipet van 5 ml de kolonies en breng ze over in een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Controleer de plaat onder een lichtmicroscoop op overgebleven kolonies. Deze kunnen worden opgevangen met een PBS-wasbeurt.
  8. Centrifugeer de kolonies bij 16 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  9. Zuig zoveel mogelijk medium op uit de conische buis en zorg ervoor dat u de kolonies op de bodem van de buis niet verstoort.
  10. Voeg 1 ml 0,05% trypsineoplossing toe en incubeer de buis gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  11. Dissocieer kolonies in de buis door krachtig op en neer te pipetteren, eerst met een p1000 en vervolgens met een p200 micropipet.
    OPMERKING: Dit zorgt voor het verkrijgen van een eencellige suspensie.
  12. Voeg 2 ml mESC-kweekmedium toe om de trypsine te blokkeren en centrifugeer bij 160 × g gedurende 3 minuten bij RT. Verwijder het bovenstaande en voeg 1 ml CNCC-differentiatiemedium toe.
  13. Tel cellen met behulp van een geautomatiseerd celtelapparaat of een gestandaardiseerd systeem onder de microscoop, volgens de instructies van de fabrikant.
  14. Na het tellen verdunnen met voldoende CNCC-differentiatiemedium om een concentratie van 3000 levende cellen per 50 μL te verkrijgen.
  15. Zaai met behulp van een p200-micropipet 50 μL van de celsuspensie in elk putje van een niet-TC behandelde U-bodem 96-putje plaat en vul vervolgens het putje bij tot 200 μL met CNCC-differentiatiemedium.
    OPMERKING: Suspendeer tijdens het vullen van de plaat van tijd tot tijd de eencellige suspensie met een p1000 micropipet om een homogene concentratie te verkrijgen.
  16. Broed een nacht in een broedmachine bij 37 °C, 5% CO2.

2. Overbrengen in een plaat met 96 putjes met platte bodem voor CNCC-differentiatie

  1. Bekijk de volgende dag (dag 1) de plaat onder een lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat er op de bodem van elk putje een klein celcluster met duidelijke randen zichtbaar is. Zet de plaat een nacht terug in de broedmachine.
    OPMERKING: Er kunnen enkele cellen rond het hoofdaggregaat zijn, sommige dood. Dit heeft geen invloed op de NS-aggregatie.
  2. Verwijder op dag 2 langzaam 100 μL medium uit elk putje.
    1. Let er bij het aanzuigen van medium op dat u de NS niet verwijdert. Om dit te voorkomen, plaatst u de pipetpunt dicht bij het oppervlak en ver van de bodem.
  3. Knip de punt van een p200 micropipet af op ongeveer 3-4 mm van de punt. Gebruik dit om de NS met het resterende medium aan te zuigen.
    OPMERKING: Om het oppakken van de NS te vergemakkelijken, pipetteert u voorzichtig een paar keer op en neer voordat u aanzuigt.
  4. Breng NS en het resterende medium over in een niet-TC-behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem en controleer de overdracht onder een lichtmicroscoop en bedek vervolgens elke nieuwe put met 100 μL voorverwarmd CNCC-differentiatiemedium. Laat NS tot dag 4 in de broedmachine bij 37 °C, 5% CO2, staan.
  5. Verwijder op dag 4 100 μL medium uit elk putje en vervang het door 100 μL voorverwarmd CNCC-differentiatiemedium.
    NOTITIE: Om te voorkomen dat de NS-bevestiging aan de onderkant van de plaat wordt gestoord, zuigt u het medium langzaam aan en vervangt u het.
  6. Controleer op dag 5 en 6 het NS-opzetstuk onder de lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat lichtere cellen - delamineren van de NS - beginnen rond het hoofdlichaam van de NS.
  7. Vervang op dag 7 het medium zoals beschreven in 2.5. Vervang het medium elke 2 dagen met dezelfde procedure tot het eindpunt van het onderzoek.

3. CNCC passeren en onderhoud

OPMERKING: CNCC-passeren kan worden uitgevoerd zodra er voldoende cellen zichtbaar zijn rond NS. Dit kan al op dag 7 zijn, omdat eerdere tijdstippen niet voldoende CNCC opleveren.

  1. Bereid het CNCC-onderhoudsmedium voor. Zie Tabel 1 voor de samenstelling van het CNCC-onderhoudsmedium.
    1. Voordat u het aan het medium toevoegt, filtert u BSA na oplosbaarheid door een filter van 0,22 μm. Zodra de groeifactoren zijn toegevoegd, bewaart u het medium maximaal 3 weken bij 4 °C. Zorg ervoor dat het medium beschermd is tegen licht.
  2. Bereid fibronectine voor op 7,5 μg/ml in PBS. Meng krachtig.
  3. Smeer de putjes van een niet-TC behandelde plaat met 96 putjes in door 100 μL fibronectineoplossing per putje toe te voegen. Laat 30 minuten onder de motorkap coaten bij RT.
    OPMERKING: Als CNCC bedoeld is voor immunofluorescentiekleuring, plaats dan een steriel glazen dekglaasje op de bodem van de put voordat u gaat coaten. Zorg ervoor dat de schuif op de bodem van de put blijft en niet drijft om te voorkomen dat de andere kant dan de kant die wordt gebruikt wordt bedekt. Volg de instructies in sectie 5 voor CNCC-bevestiging en -montage.
  4. Zuig in de tussentijd in de niet-TC behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem zoveel mogelijk CNCC-differentiatiemedium uit de putjes op en vervang dit door 50 μL accutase. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  5. Voeg na incubatie 100 μL CNCC-onderhoudsmedium per putje toe om de accutase te doven. Verwijder fibronectine uit de putjes van de ontvangende niet-TC behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem. Filter de losgeraakte post-migratie CNCC door ze door een 40 μm filter te leiden bovenop de put van de ontvangende niet-TC behandelde platbodem 96-well plaat.
    OPMERKING: Hiermee worden celklonten of resterende NS uitgefilterd die nog niet eerder zijn verwijderd. CNCC dat in dezelfde toestand is gekweekt, kan worden samengevoegd in een buis van 50 ml om vervolgens in dezelfde put van een met TC behandelde plaat met 6 putjes te worden gezaaid. Smeer in dit geval de put in met 1 ml fibronectine en gebruik 1 ml CNCC-onderhoudsmedium om de accutase te blussen.
  6. Laat post-migratie CNCC 15-30 minuten hechten bij 37 °C. Gooi het medium weg en vervang het door 100 μL CNCC-onderhoudsmedium. Wissel het medium elke 2 dagen.
    OPMERKING: Voeg voorzichtig medium toe, aangezien snelle stroom differentiatie van CNCC in neurale derivaten induceert. Als u in een formaat met 6 putjes werkt, gebruik dan 1 ml CNCC-onderhoudsmedium.

4. NS-fixatie en -montage voor immunofluorescentie

  1. Breng op het gewenste tijdstip NS over van de niet-TC behandelde plaat met 96 putjes met platte bodem in een DNA-buis met een lage binding van 2 ml door de punt van een p200-micropipet af te snijden en voorzichtig op en neer te pipetten om de NS op te nemen.
    LET OP: Op latere tijdstippen (vanaf dag 7) zal NS groot genoeg zijn om met het oog te worden gezien, maar ook moeilijker los te maken.
  2. Laat NS 3 minuten in de tube zitten bij RT, verwijder zoveel mogelijk medium en spoel af met 1 ml koude PBS.
    OPMERKING: Als u kleine NS overbrengt vanaf vroege tijdstippen (vóór dag 3-4), draai dan gedurende 3 minuten op 16 × g om ervoor te zorgen dat NS naar de bodem zakt.
  3. Verwijder PBS en vervang het in een chemische kap door 2 ml 4% PFA in PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
    1. Keer de tube langzaam om na het toevoegen van 4% PFA-oplossing en laat deze tijdens het fixeren op de zijkant rusten. Het doel is om NS iets te spreiden, zodat ze in deze stap niet aan elkaar plakken.
  4. Verwijder 4% PFA-oplossing (in de chemische kap) en was NS met 1 ml koude PBS/0,5% Tween20. Laat het 3 minuten bezinken op RT. Herhaal dit in totaal 3 keer.
    LET OP: NS gaat onderaan naar beneden.
  5. Verwijder PBS/0,5% Tween20 en voeg 2 ml PBS/0,1% Triton X-100 toe. Keer de tube om en laat hem op de zijkant rusten. Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
  6. Was NS 3 keer in koude PBS/0,5% Tween20, zoals aangegeven in stap 4.4.
  7. Verwijder PBS/0,5% Tween20 en blokkeer met 2% BSA in PBS bij 4 °C gedurende minimaal 1 uur, bij voorkeur 's nachts.
    OPMERKING: Monsters kunnen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard in 2% BSA/PBS. Beschermen tegen licht.
  8. Bereid de primaire antilichaamoplossing door de juiste verdunning van het primaire antilichaam toe te voegen aan 2% BSA/PBS in een eindvolume van 500 μl. Zie tabel 2 voor de primaire antilichaammix die in dit onderzoek is gebruikt.
  9. Verwijder zoveel mogelijk van de blokkeeroplossing en breng de NS over in een buis van 0.5 ml door de punt van een p200 micropipet af te snijden.
  10. Voeg de primaire antilichaamoplossing toe en pipetteer langzaam op en neer om de NS weer in suspentie te brengen. Incubeer een nacht op een rotator bij 4 °C.
  11. Was NS 3 keer in koude PBS gedurende 5 minuten bij RT.
  12. Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor door de secundaire antilichamen naar keuze te verdunnen in 2% BSA/PBS en 1/1000 DAPI toe te voegen. Zie tabel 2 voor de secundaire antilichaammix die in dit onderzoek is gebruikt.
    OPMERKING: Houd de buizen beschermd tegen licht.
  13. Vervang PBS door 500 μL secundaire antilichaamoplossing en wikkel de buis in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Incubeer gedurende 1 uur op de rotator bij RT.
  14. Was NS 3 keer in koude PBS, zoals aangegeven in stap 4.11.
  15. Verwijder zoveel mogelijk PBS zonder de NS op te zuigen, vervang door 50 μL klaringsmiddel en volg de instructies van de fabrikant.
  16. Incubeer 's nachts bij RT, beschermd tegen licht.
  17. Bereid de montagekamers voor.
    1. Plaats op een microscoopglaasje drie lagen dubbelzijdig plakband. Gebruik transparante, vezelloze tape om resten in de montagekamer te voorkomen.
    2. Knip met een scheermes een venster van 3 mm × 8 mm in de dubbele tape.
      OPMERKING: De afmetingen van de kamer zijn afhankelijk van het tijdstip van het monster. Dit voorbeeld is geschikt voor het hosten van 50 μL montagemedium, wat optimaal is voor 10-20 enkele NS op latere tijdstippen (dag 7-9).
  18. Breng onder een stereoscoop de NS in het klaringsmiddel voorzichtig over in de montagekamer door een p200 micropipetpunt met lage hechting door te snijden. Gebruik een vergroting tussen 2x en 4x om een gezichtsveld van de hele kamer te krijgen en voldoende vergroting om de NS te identificeren. Als de stereoscoop is uitgerust voor fluorescerende beeldvorming, zal het werken met een blauw fluorescentiefilter het identificeren van de NS gemakkelijker maken, omdat de DAPI-kleuring de anders transparante NS zal doen opvallen.
    OPMERKING: Controleer of het medium een lichte convexe meniscus vormt boven de kamer. Dit zorgt ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer zijn.
  19. Leg een dekglaasje op het oppervlak en druk lichtjes op de zijkanten om het te laten hechten. Voer deze stap uit onder de stereoscoop en controleer of de NS niet buiten de kamer worden geduwd.
  20. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot beeldvorming.

5. CNCC-fixatie en montage voor immunofluorescentie

  1. Verwijder het CNCC-onderhoudsmedium uit de putjes en was ze met PBS. Voeg PBS voorzichtig toe door aan de zijkant van de put te pipetteren.
  2. Ga verder met fixeren, permeabiliseren en kleuren zoals beschreven in de stappen 4.3-4.14.
  3. Monteer dekglaasjes op een microscopie-glasplaatje door montagemedium op het glaasje toe te voegen, het dekglaasje vast te pakken en te draaien met behulp van een pincet zodat het CNCC na de migratie naar het glasplaatje is gericht, en het op de druppel te plaatsen.
    1. Optioneel: Sluit het dekglaasje af met nagellak of andere veelgebruikte afdichtingssystemen.
  4. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het protocol werden mESC-kolonies gedissocieerd en werden 3000 cellen gezaaid in niet-TC behandelde U-bodem platen met 96 putjes. Op dag 2 werden geaggregeerde NS overgebracht naar niet-TC behandelde platen met 96 putjes met platte bodem om ze te laten hechten. Een vereenvoudigde visualisatie van het NS-aggregatieprotocol wordt gegeven in figuur 1A. NS werden gekweekt tot dag 9 en vervolgens verwerkt voor immunofluorescentiekleuring. Cellen die van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro 3D-differentiatiemodellen maken het mogelijk om complexe celinteracties te analyseren die moeilijk of niet kunnen worden waargenomen in 2D-celcultuur. Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om de ontwikkeling van CNCC in vitro te bestuderen. Deze zijn over het algemeen rechtstreeks afgeleid van ESC-kolonies 7,21 of weefselexplantaten22,23. Ho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Remi Xavier Coux voor zijn advies over het ontwerp van de primer en zijn expertise op het gebied van celcultuur. Dit werk werd gesteund door de European Research Council (ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST) en de Fondation pour la Recherche Médicale (Amorçage - AJE202205015403).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 μm syringe filtersClearLine146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter TipsDutscher713263
40 µm filtersFalcon352340
5 mL Serological pipetteStarstedt86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
Antibiotic-antimycotic solution Merck-SigmaA5955
B27 PLUS supplementThermofisher Scientific17504044
Bovine serum albumin (BSA)Merck-SigmaA9418
ChloroformCarlo Erba438601
Collagenase Type IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well platesCorning3516
Cover glasses, roundVWR 630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM high glucoseMerck-SigmaD0822
DNA LoBind Tubes, 2 mLEppendorf30108078
DNase/RNase-Free Distilled WaterThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermofisher Scientific14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mLEppendorf30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mLEppendorf30120094
ESGRO mLIF Medium SupplementMerck-SigmaESG1107
Ethanol 70%Carlo Erba528170
Fetal Bovine SerumMerck-SigmaF7524
FibronectinMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
Gelatin solutionMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
Human EGFPeprotechAF-100-15-500UG
Human FGF-basicPeprotech100-18B
Human SOX9 AntibodyR&DsystemsAF3075
Insulin from bovine pancreasMerck-SigmaI6634
iScript cDNA Synthesis KitBiorad1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, UnconjugatedDSHB3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, UnconjugatedDSHBPAX7
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
Neurobasal MediumThermofisher Scientific21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottomFalcon351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottomFalcon351177
Paraformaldehyde 16% solution, em gradeElectron Microscopy Sciences15710
Propan-2-olCarlo Erba415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) AntibodyBiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 mClear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX KitMeridian BioscienceBIO-98020
Sterile Disposable Surgical ScalpelsSwann-Morton05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope SlidesEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100Thermofisher ScientificA16046.AP
TRIzol ReagentFisherScientific15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)Cell signaling technologyE7E2G
β-mercaptoethanolThermofisher Scientific3135001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
  2. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-630 (2023).
  3. Zalc, A., et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest. Science. 371 (6529), eabb4776(2021).
  4. Perera, S. N., Kerosuo, L. On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood. Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).
  5. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. J Vis Exp. (140), e58346(2018).
  6. Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest. Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).
  8. Cederquist, G. Y., et al. Specification of positional identity in forebrain organoids. Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).
  9. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  10. Prescott, S. L., et al. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  11. Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies. J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).
  12. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  13. Sipahi, R., Zupanc, G. K. Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis. J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).
  14. Mori, H., et al. Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells. J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).
  15. Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation. Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).
  16. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  17. Memberg, S. P., Hall, A. K. Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin. J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).
  18. Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus. Science. 382, eadf9941(2023).
  19. Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. ELife. 11, e70235(2022).
  20. To, K., et al. A multiomic atlas of human early skeletal development. Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).
  21. Bajpai, R., et al. Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells. Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).
  22. Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).
  23. Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells. Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).
  24. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  25. Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres. Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Differentiatie van de neurale kamdriedimensionale kweekvorming van neurosferenembryonale stamcellen van muisbeslissingen over het cellotimmunofluorescentieanalyseexpressie van EMT markers96 wellplaat

Gerelateerde artikelen