Methodenartikel

Karakterisering van extracellulaire blaasjes uit biologische vloeistoffen

DOI:

10.3791/67699

⸱

28 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 3Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we de karakteriseringsmethode voor extracellulaire blaasjes (EV's) verzameld uit biologische vloeistoffen, zoals tranen en speeksel, van menselijke proefpersonen. De scanner die bij deze methode wordt gebruikt, is in staat om het fenotype, de grootte en het totale aantal deeltjes van EV's van 1 μL van het monster te detecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn structuren die worden geproduceerd uit cellen en deelnemen aan intercellulaire communicatie door biomoleculen van de ene cel naar de andere te transporteren. Van EV's is aangetoond dat ze korte en lange afstanden in het lichaam afleggen en weefselspecifiek zijn. EV's worden niet alleen aangetroffen in weefsels, maar ze zijn ook te vinden in vrijwel alle lichaamsvloeistoffen, zoals tranen, speeksel, hersenvocht, bloed, enz. Hoewel EV's niet-invasief kunnen worden verzameld uit tranen en speeksel, kunnen slechts kleine hoeveelheden tegelijk worden verzameld, wat problemen kan veroorzaken bij het verkrijgen van voldoende EV's om eiwitten te analyseren. De scanner die in dit artikel wordt besproken, is een nanodeeltjesanalysator die een oplossing biedt voor dit probleem, waardoor we het fenotype, de grootte en het totale aantal deeltjes van EV's kunnen karakteriseren en bestuderen vanaf slechts 1 μL biologische vloeistof. Dit protocol zal de kennis van EV's uitbreiden uit kleine hoeveelheden monsters die moeilijk te extraheren zijn bij patiënten. Dit zou het comfort van de patiënt kunnen verbeteren en mogelijk nieuwe therapeutische doelen kunnen identificeren voor een reeks ziekten en aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen communiceren met naburige cellen via verschillende signaalmechanismen, waaronder het vrijkomen van extracellulaire blaasjes (EV's), die een sleutelrol spelen in intercellulaire communicatie. EV's nemen deel aan intercellulaire communicatie door genetische lading, zoals DNA, RNA en eiwitten, van de ene cel naar de andere door te geven 1,2,3,4,5. Momenteel zijn er drie categorieën EV's: exosomen, microblaasjes en apoptotische lichamen, die worden gekenmerkt door hun grootte. Exosomen zijn de kleinste, met een diameter van 30-150 nm 6,7,8, en worden gevormd uit het endosomale membraansysteem 9,10,11 (Figuur 1). Microblaasjes zijn groter dan exosomen in die zin dat ze variëren van 100-1000 nm 12,13,14 en knoppen van het plasmamembraan 11,12,13 (Figuur 1). Apoptotische lichamen zijn de grootste van de EV's en variëren van 1000-5000 nm 12,14,15, en ze ontluiken ook van het plasmamembraan 12,16,17 (Figuur 1). Afgezien van de grootte kunnen EV's worden geclassificeerd op basis van andere biofysische kenmerken, waaronder dichtheid, moleculaire markers zoals CD63, CD81, CD9 en ook biogenesemechanisme18. EV's kunnen korte afstanden afleggen tussen aangrenzende cellen en lange afstanden door het hele lichaam 19,20,21,22,23. EV's zijn te vinden in biologische vloeistoffen zoals bloed 24,25,26, cerebraal spinaal vocht 27,28,29, tranen 30,31,32 en speeksel 33,34,35, om er maar een paar te noemen.

Tot op heden is ultracentrifugatie een van de bekendste methoden voor het isoleren van EV's uit monsters 36,37,38. Deze methode vereist meerdere rondes van centrifugaties en ultracentrifugatie die kunnen worden uitgevoerd door de snelheid te verhogen om de EV's te isoleren van cellen en celresten. Deze methode kan worden gestart met de lage snelheid met pelletcellen die worden gevolgd door een gemiddelde snelheid om grotere blaasjes te elimineren en ten slotte een ultracentrifugatiestap om EV's18 te pelleteren. Hoewel ultracentrifugatie wordt beschouwd als de beste methode voor isolatie, bestaan er nog steeds enkele beperkingen in die zin dat het de morfologie van de EV's verandert 39,40,41. Een andere techniek die wordt gebruikt om EV's te isoleren is flowcytometrie, die de voordelen benadrukt van evaluatie van meerdere tijdstippen en eindpunten en analyse van enkelvoudige EV's met hoge doorvoer. De beperkingen van flowcytometrie omvatten, maar zijn niet beperkt tot, verstopping van de poriën en zwakke signalen. Een andere gebruikte benadering is gradiëntcentrifugatie, waarbij materialen met verschillende dichtheden worden gebruikt die met de EV's worden gecentrifugeerd en die een betere scheiding van de EV's mogelijk maakt in vergelijking met ultracentrifugatie. Hoewel deze techniek de scheiding verbetert, is het arbeidsintensief, tijdrovend en kan het leiden tot aanzienlijk verlies van monster. Bovendien kunnen precipitatie en filtratie ook worden gebruikt om EV's te isoleren. Beide technieken zijn eenvoudig en snel, maar beide kunnen leiden tot monstercontaminatie. Hoewel er verschillende technieken zijn om EV's te isoleren, heeft elke techniek zijn voordelen en beperkingen, die hieronder worden vermeld (Tabel 1) 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55, 56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67.

Zodra de EV's zijn geïsoleerd, kunnen moleculaire tests worden uitgevoerd om de EV's te karakteriseren. Westerse vlekken zijn een veelgebruikte test om te zoeken naar oppervlakte- en ladingseiwitexpressie 68,69,70 en polymerasekettingreactie (PCR) wordt gebruikt voor miRNA-expressie 71,72,73 voor EV's 74,75,76. Deze tests zijn vastgesteld en kunnen intrigerende resultaten opleveren. Een beperking van deze methoden is dat ze een grote hoeveelheid eiwitten of RNA van EV's nodig hebben om een meting77 te krijgen, wat om te beginnen een probleem is voor monsters met een klein volume of EV-concentratie.

De nanodeeltjesanalysator die in dit document wordt besproken, stelt de gebruiker in staat om veel van de beperkingen te overwinnen die in Tabel 1 en Tabel 2 worden vermeld 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90 . Deze methode vereist geen gebruik van isolatietechnieken, die de verminderde opbrengst van EV's zullen helpen overwinnen. Deze methode stelt de gebruiker ook in staat om de oppervlakte- en vrachteiwitten, het totale aantal EV's en de EV-grootte te analyseren op basis van een monstervolume van slechts 1 μL. Dit wordt gedaan door gebruik te maken van tetraspanine-chips die door het bedrijf worden geleverd en die een antilichaammicroarray met tetraspanine-antilichamen, CD63, CD81 en CD9, gebruikt om EV's in een oplossing te identificeren, zoals weergegeven in figuur 2. Fluorescerende antilichamen bevestigen de aanwezigheid van EV's en voorkomen dat vervuilende deeltjes de resultaten vertekenen.

Het algemene doel van deze techniek is om een minder tijdrovende methode te bieden om EV's te analyseren en om EV's te analyseren uit een klein monstervolume. Met behulp van deze nanodeeltjesanalysator kunnen gebruikers de grootte, het totale aantal deeltjes en oppervlakte-eiwitten analyseren vanaf slechts 1 μL van een monster, wat ideaal is voor biologische vloeistoffen zoals tranen en speeksel.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven studies hielden zich aan de Verklaring van Helsinki. Van elke proefpersoon werd schriftelijke toestemming verkregen voordat deze in het onderzoek werd opgenomen. De goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van het Aarhus University Hospital (1-10-72-77-14) en het Dean McGee Institute (1576837-2) werd ontvangen volgens de federale en institutionele richtlijnen. Vóór de verwerking werden alle traan- en speekselmonsters geanonimiseerd. Alle studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de North Texas Regional Institutional Review Board (#2020-030). Het volgende protocol voldoet aan alle richtlijnen en is goedgekeurd, zoals hierboven vermeld.

1. Dag 1: Monstervoorbereiding en incubatie

  1. Verzamel biologische vloeistofmonster(s), dwz tranen en speeksel van een proefpersoon(en) of ontdooimonster(s) uit de vriezer.
    1. Tranen: Verzamel passief tranen van de laterale meniscus met behulp van een glazen capillaire buis.
      1. Plaats de glazen capillaire buis op het onderste ooglid en zorg ervoor dat u het hoornvlies niet aanraakt.
      2. Verzamel binnen 10 minuten een volume van 10 μL tranen.
      3. Gebruik de tranen direct of bewaar ze bij -20 °C.
    2. Speeksel: Verzamel speeksel van passief kwijl in een microcentrifugebuis van 1,5 ml
      1. Laat de donor speeksel in zijn mond plassen.
      2. Vraag de donor om met een trechter in de buis te kwijlen.
      3. Gebruik speeksel onmiddellijk of bewaar bij -20 °C.
  2. Plaats de tetraspanin-spaan(en) 15 minuten in de spaanwasserplaat voordat u monsters toevoegt zodat ze op kamertemperatuur kunnen komen. Zorg er bij het plaatsen van de chips in de put voor dat de nummers aan de onderkant naar boven staan en dat de chip(s) de zijwanden van de put(ten) niet raken.
  3. Noteer het ID-nummer en het chipnummer in de notebook om de chip(s) bij te houden.
  4. Sluit de universele seriële bus (USB) aan die bij de kit wordt geleverd, en pak de map met het bijbehorende kitnummer uit en sla deze op in een aangewezen gebied naar keuze.
  5. Pipetteer 99 μl oplossing B in een buisje van 1,5 ml.
  6. Voeg 1 μL biologische vloeistof toe aan de 1,5 ml tube die in de vorige stap is voorbereid.
  7. Draai de buizen naar beneden.
  8. Neem 70 μl van de oplossing uit stap 1.6 en pipetteer op de tetraspaninechip.
  9. Plaats de film op de spaanwasplaat om te voorkomen dat het monster verdampt.
  10. Incubeer gedurende 16 uur bij kamertemperatuur (RT) op een trillingsvrije bank.

2. Dag 2: Friet wassen

  1. Zet de friteswasmachine aan.
  2. Verwijder de folie uit stap 1.9 van de plaat.
  3. Plaats de plaat in de fritesschaar, zorg ervoor dat deze op zijn plaats klikt en sluit het deksel.
    NOTITIE: De plaat zal niet gemakkelijk bewegen als deze correct op zijn plaats is vergrendeld.
  4. Druk op de CW-TETRA v0-optie op de spaanwasser.
  5. Selecteer de startrij en het aantal rijen dat u wilt wassen.
  6. Druk op Doorgaan op de friteswasmachine.
  7. Terwijl de spaander(en) wordt (worden) gewassen, bereidt u de blokkerende oplossing met de antilichamen als volgt in een buisje:
    1. Bereid 300 μL blokkeeroplossing per chip.
    2. Voeg 0,6 μL of elk antilichaam per chip toe (vortex en spin down antilichamen alvorens toe te voegen aan de blokkerende oplossing)
    3. Vortex de blokkerende oplossing + antilichaamcocktail.
      OPMERKING: Bedek de blokkerende oplossing + antilichaamcocktail met licht om de stabiliteit van het antilichaam te garanderen. Dit moet op de dag van gebruik gebeuren.
  8. Wanneer de frienwasser piept, voeg dan 250 μL van de blokkerende oplossing + antilichaamcocktail toe aan de chip(s).
  9. Sluit het deksel en druk op Doorgaan.
    OPMERKING: De frietwasser zal nu een incubatie van 1 uur uitvoeren, samen met verschillende extra was- en spoelrondes.
  10. Wanneer de spaanwasser piept, verwijdert u de spaanwasplaat en verplaatst u de spaan(en) de oprijplaat op.
  11. Plaats de plaat terug in de spaanwasser en zorg ervoor dat deze op zijn plaats klikt. Sluit het deksel en druk op Doorgaan.
  12. Wanneer de spaanwasser het programma heeft voltooid, verwijdert u de plaat en plaatst u de spaan(en) op een papieren handdoek. Bedek de chip(s) tegen het licht.

3. Dag 2: Scannen van de chip(s)

  1. Zet de scanner aan en open de scansoftware.
    OPMERKING: De scanner ondergaat zelfcontroles om aan te geven of er fouten zijn of dat het scannen kan worden voortgezet.
  2. Selecteer Map opslaan en kies de locatie om de bestanden op te slaan.
  3. Selecteer ChipFile Folder en kies de map die in stap 1.4 is opgeslagen.
  4. Selecteer de vervolgkeuzelijst om elke chip te kiezen en zoek deze in de spaanpositie op de klauwplaat. Herhaal deze stap voor alle chips die gescand moeten worden.
  5. Schakel de fluorescentie in door op de drie vierkantjes onder Chip Position te klikken. Vierkanten worden respectievelijk geel, blauw en rood.
  6. Verwijder het deksel van de boorkop door het deksel naar beneden te drukken en eraan te trekken.
  7. Plaats de spaan(en) op de boorkop en zorg ervoor dat ze stevig vastzitten.
  8. Plaats het deksel van de boorkop er weer op door de pinnen in de gaten te plaatsen, druk naar beneden en schuif het deksel om het op zijn plaats te vergrendelen.
  9. Plaats de boorkop op het podium en zorg ervoor dat deze op zijn plaats klikt.
  10. Selecteer Chips scannen.
  11. Selecteer OK.
  12. Zodra de tafel volledig in de machine is geplaatst, sluit u de deur.
    OPMERKING: Het duurt ongeveer 12 minuten om een enkele chip te scannen.
  13. Zodra het programma klaar is met het scannen van de chip(s), opent u de deur om de fasecontrole uit te werpen om te zien of de scans zijn geslaagd.
    1. Als de scans zijn gelukt, gooit u de chip(s) weg en plaatst u de volgende set chips op de klauwplaat, of plaatst u de lege klauwplaat terug op het podium. Sluit vervolgens de software af en schakel de machine uit als u klaar bent.
    2. Als de scans niet succesvol waren, kijk dan naar de foutcode en corrigeer de fout.

4. Gegevensverwerking

  1. Open de analysesoftware.
  2. Selecteer Gegevens vooraf scannen en kies de map met de scan vanaf dag 2, stap 3.2.
  3. Selecteer Volgende.
  4. Label de chip(s) in de kolom Voorbeeldnaam met de naam van het voorbeeld door op de cel te klikken en de voorbeeld-ID in te typen.
  5. Label vervolgens de tetraspanins in de kolom Kanaalnaam . Rood = CD63, Groen = CD81 en Blauw = CD9.
  6. Selecteer Volgende.
  7. Selecteer Hoog CV in de groep Spot selecteren om de vervolgkeuzelijst te inspecteren en schakel de hoge CV's voor elke chip uit door een of twee spots uit te schakelen.
  8. Selecteer vervolgens Hoog aantal en probeer de waarschuwingen voor hoog aantal uit te schakelen.
    OPMERKING: Sommige monsters hebben mogelijk een te hoog aantal, maar ze kunnen nog steeds worden geanalyseerd.
  9. Selecteer Alle vlekken in het vervolgkeuzemenu, selecteer Spotmontage en controleer elke chip visueel op eventuele vervormingen of krassen.
  10. Selecteer Volgende.
  11. Stel in het CD63-kanaal het minimum in op 300 om rode cellen in de rij Gem. % inbegrepen te verwijderen; gele cellen zijn prima en gaan verder naar het CD81-kanaal. Als het instellen van de minimumwaarde op 300 de rode cel niet verandert in geel of wit, gaat u verder met stap 4.14 voor het oplossen van problemen.
  12. Stel in het CD81-kanaal het minimum in op 300 om rode cellen in de rij Gem. % inbegrepen te verwijderen; gele cellen zijn prima, en ga verder naar het CD9-kanaal. Als het instellen van de minimumwaarde op 300 de rode cel niet verandert in geel of wit, gaat u verder met stap 4.14 voor het oplossen van problemen.
  13. Stel in het CD9-kanaal het minimum in op 400 om rode cellen in de rij Gemiddeld % inbegrepen te verwijderen; Gele cellen zijn prima en ga verder met stap 4.15. Als het instellen van de minimumwaarde op 400 de rode cel niet verandert in geel of wit, gaat u verder met stap 4.14 voor het oplossen van problemen.
  14. Probleemoplossing
    1. Verhoog de minimumwaarde met 100 eenheden.
    2. Als stap 4.14.1 niet werkte, selecteert u de chip in de sectie Chips kiezen om aan te werken en kiest u de chip. Selecteer Deeltjestelling en schakel de vlek(ken) met een hoog deeltjesaantal uit. Selecteer Intensiteit/Grootte, selecteer Alle chips en kijk of dit het probleem oplost.
    3. Als stap 4.14.2 niet werkte, selecteert u de chip in de sectie Chips kiezen om aan te werken en kiest u de chip. Selecteer Single-Chip Cutoffs en verhoog het minimum met 100 eenheden. Selecteer vervolgens Alle fiches om te zien of de rode cel nu geel is. Als dit niet werkt, herhaalt u deze stap totdat de cel Gemiddeld % inbegrepen nu geel of wit is.
  15. Selecteer Volgende.
  16. Deselecteer het IM-kanaal.
  17. Stel de heatmap-waarde in de rechterbenedenhoek in om alle deeltjes op te nemen en selecteer Plot aan rapport toevoegen.
    1. Pas het maximale aantal aan in de vervolgkeuzelijst en voer handmatig een waarde in.
  18. Selecteer vervolgens het vervolgkeuzemenu in het midden bovenaan onder Capture Probes en selecteer CD63.
  19. Selecteer Plot toevoegen aan rapport om het totale aantal deeltjes aan het rapport toe te voegen.
  20. Selecteer de vervolgkeuzelijst onder Analysemodus, kies Colokalisatie en Voeg plot toe aan rapport.
  21. Selecteer vervolgens Grootte, selecteer Weergave wijzigen in plot en selecteer Plot toevoegen aan rapport.
  22. Selecteer ten slotte Afbeeldingen en selecteer Plot toevoegen aan rapport.
  23. Herhaal stap 4.18-4.22 voor CD81 en CD9 en zorg ervoor dat u de selectie van het IM-kanaal elke keer ongedaan maakt.
  24. Nadat alle items aan het rapport zijn toegevoegd, selecteert u Rapport exporteren, controleert u of het in het juiste bestand wordt opgeslagen en selecteert u Map.
    OPMERKING: Excel-bestanden en afbeeldingen zijn gegenereerd en kunnen nu worden gebruikt voor verdere analyse.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streef bij het analyseren van de vlekken op de chips naar een optimale concentratie van EV's door fluorescerend gelabelde EV's in de CD63-, CD81- en CD9-kanalen te observeren, en het MIgG-kanaal30,91 moet zwart blijven, aangezien dit het controlekanaal is zoals te zien is in figuur 3A. CD81 wordt verminderd voor biologische vloeistoffen. Als er geen fluorescentie is in de CD63-, CD81- en CD9-kanalen, is er een afwezigheid van EV's (Figuur 3B). Pas op dat u de chip niet oververzadigt (Afbeelding 3C). Dit maakt het voor de analysesoftware moeilijk om de nauwkeurigheid van de grootte, het totale aantal deeltjes en de fenotypes van de EV's te berekenen. Vanaf de plekken met de optimale concentratie kan de analysesoftware de grootte (50-200 nm), het totale aantal deeltjes en de tetraspanine-expressie van de EV's meten (Figuur 4) en worden geëxporteerd naar individuele spreadsheets voor verdere analyse. De tetraspanine-analyse omvat de colokalisatie van de oppervlakte-eiwitten op de EV's. De colokalisatie wordt weergegeven met een "/", bijvoorbeeld "CD63/CD81". Dit betekent niet dat CD63 en CD81 worden gecombineerd; het betekent dat zowel de CD63 als de CD81 zich op het oppervlak van de EV bevinden.

Deze resultaten zullen waardevol inzicht verschaffen tussen gezonde en zieke monsters. We zullen kunnen bepalen of gezonde monsters of zieke monsters meer EV's, grotere of kleinere EV's produceren, en het fenotype van de EV's. Een of meer van deze kenmerken kunnen een rol spelen in de biogenese en/of progressie van de ziekte. Met deze resultaten kunnen we zien of er sprake is van een afwezigheid of verhoging van de tetraspaninespiegels, wat inzicht kan geven in celprocessen en de vorming van EV's.

figure-results-1
Figuur 1: De types en maten van de verschillende EV's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schematisch van hoe de tetraspanine-chips EV's opvangen en detecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Optimalisatie van EV-concentraties. (A) Optimale concentratie van EV's. (B) Negatief resultaat: geen EV's aanwezig. (C) Oververzadiging van EV's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Gegevens gegenereerd door de nanodeeltjesanalysator. (A) Grootte van de EV-diameter gemeten in nanometer. (B) Totaal aantal deeltjes van EV's. (C) EV gecolokaliseerd fenotype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

TechniekVoordelenBeperkingen
UltracentrifugeHoge zuiverheid42,43Veranderingen EV-morfologie42,44
Homogeniteit42,45Vereist groot volume42,44,46
Functionaliteit42,43Duur42,43
FlowcytometrieEvalueer monsters op meerdere tijdstippen47Zwak signaal48,49
Meerdere eindpunten47,50Verstopte poriën51
Analyse van enkelvoudige EV's met hoge doorvoer52,53
Dichtheid gradiënt centrifugatieProduceer zeer zuivere monsters54Arbeidsintensief55,56
Verscheidenheid aan monsters55,57Tijdrovend55,58 
Aanzienlijk opbrengstverlies54
NeerslagEenvoudig59,60Vervuiling36,44,61
Snel61,62Niet-specifiek63
Hoog rendement44,59,62
Neutrale pH36
FiltratieEenvoudig64 Val exosomen65
Snel64Beschadigt grote blaasjes36
Goedkoop64Filter koek66,67
Exosoom verstopt65

Tabel 1: Voordelen en beperkingen van EV-isolatietechnieken. Een lijst van de verschillende manieren om EV's te isoleren, inclusief hun voordelen en beperkingen.

TechniekVoordelenBeperkingen
Dynamische lichtverstrooiingMeet deeltjes variërend in grootte 1 nm tot 6 μM78 Niet geschikt voor het meten van complexe exosoommonsters met een groot groottebereik79 
De ondergrens is 10 nm, geschikt voor monodisperse systemen79 Niet in staat om besmette eiwitten van exosomen te onderscheiden79
Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)Observeer de morfologie van exosomen79,80 Gecompliceerde monstervoorbereidingen79 
Let op de interne structuur81 Niet in staat om exosomen te onderscheiden op basis van grootte en vorm vanwege overdreven fluorescentiesignalen82 
Analyse van het volgen van nanodeeltjesMeet de concentratie, grootte en grootteverdeling van exosomen in het bereik van 10 nm tot 2 μM78 Kan de EV's niet onderscheiden van eiwitaggregaten en andere verontreinigingen83 
Snelle monstervoorbereiding en meting78,84Duur NTA instrument85 
Monsters kunnen worden teruggevonden in inheemse vorm84 Gevoelig voor trillingen85
Western Blot (WB's)Kan markereiwitten kwalitatief en kwantitatief analyseren79,86 Ingewikkeld en tijdrovend79 
Analyse van exosomen uit celkweekmedia79 EV-isolaten kunnen lipoproteïnen en andere verontreinigingen bevatten86 
FlowcytometrieHogere gevoeligheid en beeldvorming met hoge resolutie totTijdrovend en arbeidsintensief met een detectielimiet van 400 nm79,88 
Onderscheid gekleurde exosomen van insluitingen87 
Vereiste lage monsterconcentratie79 Optische signalen belemmeren de nauwkeurigheid en resolutie88 
ExoviewMeet tetraspaninen (CD9, CD63 en CD81) op exosomen89 Meet geen grotere EV-maten75
Meet EV ladingseiwitten90

Tabel 2: Voordelen en beperkingen van EV-karakteriseringstechnieken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest cruciale stap in dit protocol is ervoor te zorgen dat een optimale concentratie van EV's wordt bereikt. Er moeten voldoende EV's aanwezig zijn om een meting te krijgen, maar niet te veel EV's die de chip oververzadigen. De beste manier om de optimale EV-concentratie te bepalen, is door een optimalisatierun uit te voeren met 1 μL monster en te kijken of de concentratie moet worden aangepast. Een andere cruciale stap is om te zien of er een overvloed aan celresten in het monster is, wat kan worden bepaald door grote brokken op de chips in de analysesoftware te bekijken. Als het monster celresten bevat, zou een eenvoudige centrifugatie of filtering van het monster dit probleem moeten oplossen.

Een extra, cruciale stap is ervoor te zorgen dat de spaan(s) de wanden van de put niet raken en contact met het midden van de spaan(s) te vermijden wanneer ze op de helling worden geplaatst. De scanner leest vanaf het vierkant in het midden van de chip, dus het is essentieel om dat gebied niet met de tang aan te raken om te voorkomen dat de EV's worden verstoord.

Deze methode heeft enkele beperkingen, zoals een onvoldoende concentratie van EV's voor detectie door het instrument. De concentratie kan worden verbeterd door het monster te drogen of door een concentratorbuis te gebruiken. Een andere beperking is dat de analysesoftware alleen EV's meet in het bereik van 50-200 nm, waarbij sommige microblaasjes en alle apoptotische lichamen worden uitgesloten van de groottemetingen75.

Er zijn veel manieren om te isoleren (Tabel 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56,57,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67) en analyseer EV's (Tabel 2 78,79,80,81,82,83,84,85, 86,87,88,89,90), en de huidige gouden standaard voor EV-isolatie is ultracentrifugatie 36,37,38 om de cellen te pelleteren voor tests zoals Western Blots 68,69,70 en PCR 71,72,73,74,75,76. Hoewel dit protocol goed werkt voor grote monsters 42,44,46, kan het verkrijgen van biologische vloeistoffen een uitdaging zijn, en vaak kan er maar een klein aantal monsters tegelijk worden verzameld, wat niet ideaal is voor ultracentrifugatie. Het gebruik van deze nanodeeltjesanalysator daarentegen stelt de gebruiker in staat om waardevolle gegevens te genereren, zoals grootte, totale deeltjestelling en fenotype van de EV's, in slechts 1 μL monster, waardoor het ideaal is voor biologische vloeistoffen. We zullen in staat zijn om de kennis van EV's uit te breiden uit kleine hoeveelheden monsters die moeilijk te extraheren zijn, wat het comfort van de patiënt kan vergroten en mogelijk potentiële therapeutische doelen kan vinden voor verschillende ziekten en aandoeningen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om openbaar te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de NIH bedanken voor de financiering (EY031316 en EY034714). We willen ook UNTHSC en NTERI bedanken voor de labruimte.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100Incubeert, wast, spoelt en droogt de tetraspanine chips. Dit huidige model is niet langer beschikbaar. Prijs op het moment van aankoop: $9,995.00 
ExoView Analyzer softwareNanoViewN/AAnalyseert de chipinformatie en produceert excel-bestanden voor verdere analyse. Niet langer beschikbaar.
ExoView R100NanoViewEV-R100Wordt gebruikt om de tetraspanine chips te scannen bij 3 golflengten. Dit huidige model is niet langer beschikbaar. Prijs op het moment van aankoop:  $110,000.00
ExoView Scanner softwareNanoViewN/AScant de chips op 3 verschillende golflengten. Niet langer beschikbaar.
Human Tetraspanin KitsUnchained LabsEV-TETRA-CBevat 8 tetraspanine chips, Incubatie Oplossing, Blocking Oplossing, CD63 antilichaam, CD81 antilichaam, CD9 antilichaam, Oplossing A, Oplossing B, USB en plaatdeksel.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Radler, J., Gupta, D., Zickler, A., Andaloussi, S. E. Exploiting the biogenesis of extracellular vesicles for bioengineering and therapeutic cargo loading. Mol Ther. 31 (5), 1231-1250 (2023).
  3. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 113961(2021).
  4. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  6. Zhang, H., et al. Exosome-induced regulation in inflammatory bowel disease. Front Immunol. 10, 1464(2019).
  7. Barzin, M., et al. Application of plant-derived exosome-like nanoparticles in drug delivery. Pharm Dev Technol. 28 (5), 383-402 (2023).
  8. Zhou, C., et al. Stem cell-derived exosomes: emerging therapeutic opportunities for wound healing. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 107(2023).
  9. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), aau6977(2020).
  10. Mondal, J., et al. Hybrid exosomes, exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications. J Control Release. 353, 1127-1149 (2023).
  11. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  12. Paul, N., Sultana, Z., Fisher, J. J., Maiti, K., Smith, R. Extracellular vesicles- crucial players in human pregnancy. Placenta. 140, 30-38 (2023).
  13. Zaldivia, M. T. K., McFadyen, J. D., Lim, B., Wang, X., Peter, K. Platelet-derived microvesicles in cardiovascular diseases. Front Cardiovasc Med. 4, 74(2017).
  14. Tamasi, V., Nemeth, K., Csala, M. Role of extracellular vesicles in liver diseases. Life (Basel). 13 (5), 1117(2023).
  15. Fu, Y., et al. Emerging understanding of apoptosis in mediating mesenchymal stem cell therapy. Cell Death Dis. 12 (6), 596(2021).
  16. Santavanond, J. P., Rutter, S. F., Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. H. Apoptotic bodies: Mechanism of formation, isolation and functional relevance. Subcell Biochem. 97, 61-88 (2021).
  17. Yu, L., et al. Apoptotic bodies: bioactive treasure left behind by the dying cells with robust diagnostic and therapeutic application potentials. J Nanobiotechnology. 21 (1), 218(2023).
  18. Momen-Heravi, F., Getting, S. J., Moschos, S. A. Extracellular vesicles and their nucleic acids for biomarker discovery. Pharmacol Ther. 192, 170-187 (2018).
  19. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  20. Grange, C., Bussolati, B. Extracellular vesicles in kidney disease. Nat Rev Nephrol. 18 (8), 499-513 (2022).
  21. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends Cell Biol. 25 (6), 364-372 (2015).
  22. Iannotta, D. A. A., Kijas, A. W., Rowan, A. E., Wolfram, J. Entry and exit of extracellular vesicles to and from the blood circulation. Nat Nanotechnol. 19 (1), 13-20 (2024).
  23. Saint-Pol, J., Gosselet, F., Duban-Deweer, S., Pottiez, G., Karamanos, Y. Targeting and crossing the blood-brain barrier with extracellular vesicles. Cells. 9 (4), 851(2020).
  24. Alberro, A., Iparraguirre, L., Fernandes, A., Otaegui, D. Extracellular vesicles in blood: Sources, effects, and applications. Int J Mol Sci. 22 (15), 8163(2021).
  25. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  26. Thangaraju, K., Neerukonda, S. N., Katneni, U., Buehler, P. W. Extracellular vesicles from red blood cells and their evolving roles in health, coagulopathy and therapy. Int J Mol Sci. 22 (1), 153(2020).
  27. Li, C., et al. Cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles after spinal cord injury promote vascular regeneration via PI3K/AKT signaling pathway. J Orthop Translat. 39, 124-134 (2023).
  28. Deng, Y., et al. Phosphoproteome analysis of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in primary central nervous system lymphoma. Analyst. 148 (15), 3594-3602 (2023).
  29. Hirschberg, Y., et al. Proteomic comparison between non-purified cerebrospinal fluid and cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles from patients with Alzheimer's, Parkinson's and Lewy body dementia. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12383(2023).
  30. Hefley, B. S., et al. Revealing the presence of tear extracellular vesicles in Keratoconus. Exp Eye Res. 224, 109242(2022).
  31. Cross, T., et al. RNA profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  32. Ma, H., et al. Metabolic signatures of tear extracellular vesicles caused by herpes simplex keratitis. Ocul Surf. 31, 21-30 (2024).
  33. Han, P., Bartold, P. M., Ivanovski, S. The emerging role of small extracellular vesicles in saliva and gingival crevicular fluid as diagnostics for periodontitis. J Periodontal Res. 57 (1), 219-231 (2022).
  34. Han, P., Li, X., Wei, W., Ivanovski, S. Saliva diagnosis using small extracellular vesicles and salivaomics. Methods Mol Biol. 2588, 25-39 (2023).
  35. Reseco, L., et al. Characterization of extracellular vesicles from human saliva: Effects of age and isolation techniques. Cells. 13 (1), 95(2024).
  36. Tiwari, S., Kumar, V., Randhawa, S., Verma, S. K. Preparation and characterization of extracellular vesicles. Am J Reprod Immunol. 85 (2), e13367(2021).
  37. Tomiyama, E., Fujita, K., Nonomura, N. Urinary extracellular vesicles: Ultracentrifugation method. Methods Mol Biol. 2292, 173-181 (2021).
  38. Xu, K., Jin, Y., Li, Y., Huang, Y., Zhao, R. Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research. Front Chem. 10, 844124(2022).
  39. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  40. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  41. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  42. Ansari, F. J., et al. Comparison of the efficiency of ultrafiltration, precipitation, and ultracentrifugation methods for exosome isolation. Biochem Biophys Rep. 38, 101668(2024).
  43. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  44. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  45. Le Roy, A., et al. AUC and small-angle scattering for membrane proteins. Methods Enzymol. 562, 257-286 (2015).
  46. Chhoy, P., Brown, C. W., Amante, J. J., Mercurio, A. M. Protocol for the separation of extracellular vesicles by ultracentrifugation from in vitro cell culture models. STAR Protoc. 2 (1), 100303(2021).
  47. McDorman, K. S., Chan, C., Rojko, J., Satterwhite, C. M., Morrison, J. P. Chapter 7 - Special Techniques in Toxicologic Pathology. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology (Third Edition). , Academic Press. (2013).
  48. Woud, W. W., et al. An imaging flow cytometry-based methodology for the analysis of single extracellular vesicles in unprocessed human plasma. Commun Biol. 5 (1), 633(2022).
  49. Gul, B., Syed, F., Khan, S., Iqbal, A., Ahmad, I. Characterization of extracellular vesicles by flow cytometry: Challenges and promises. Micron. 161, 103341(2022).
  50. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-based screening using high-throughput flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
  51. Safford, H. R., Bischel, H. N. Flow cytometry applications in water treatment, distribution, and reuse: A review. Water Res. 151, 110-133 (2019).
  52. Kobayashi, H., et al. Precise analysis of single small extracellular vesicles using flow cytometry. Sci Rep. 14 (1), 7465(2024).
  53. Welsh, J. A., et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry. J Extracell Vesicles. 12 (2), e12299(2023).
  54. Carnino, J. M., Lee, H. Extracellular vesicles in respiratory disease. Adv Clin Chem. 108, 105-127 (2022).
  55. Sun, Y., Sethu, P. Low-stress microfluidic density-gradient centrifugation for blood cell sorting. Biomed Microdevices. 20 (3), 77(2018).
  56. Strachan, B. C., Xia, H., Voros, E., Gifford, S. C., Shevkoplyas, S. S. Improved expansion of T cells in culture when isolated with an equipment-free, high-throughput, flow-through microfluidic module versus traditional density gradient centrifugation. Cytotherapy. 21 (2), 234-245 (2019).
  57. Malvezzi, H., Sharma, R., Agarwal, A., Abuzenadah, A. M., Abu-Elmagd, M. Sperm quality after density gradient centrifugation with three commercially available media: a controlled trial. Reprod Biol Endocrinol. 12, 121(2014).
  58. Sun, Y., Sethu, P. Microfluidic adaptation of density-gradient centrifugation for isolation of particles and cells. Bioengineering (Basel). 4 (3), 67(2017).
  59. Karttunen, J., et al. Precipitation-based extracellular vesicle isolation from rat plasma co-precipitate vesicle-free microRNAs. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1555410(2019).
  60. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  61. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  62. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  63. Konoshenko, M. Y., et al. Isolation of extracellular vesicles from biological fluids via the aggregation-precipitation approach for downstream miRNAs detection. Diagnostics (Basel). 11 (3), 384(2021).
  64. Drozdz, A., et al. Low-vacuum filtration as an alternative extracellular vesicle concentration method: A comparison with ultracentrifugation and differential centrifugation. Pharmaceutics. 12 (9), 872(2020).
  65. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  66. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  67. Helling, A., et al. Investigation of microbial cell deformability by filter cake compressibility using ultrafiltration membranes. Colloids Surf B Biointerfaces. 185, 110626(2020).
  68. Bagci, C., et al. Overview of extracellular vesicle characterization techniques and introduction to combined reflectance and fluorescence confocal microscopy to distinguish extracellular vesicle subpopulations. Neurophotonics. 9 (2), 021903(2022).
  69. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. van Maanen, J. C., et al. A combined western and bead-based multiplex platform to characterize extracellular vesicles. Tissue Eng Part C Methods. 29 (11), 493-504 (2023).
  71. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  72. Lee, H., He, X., Le, T., Carnino, J. M., Jin, Y. Single-step RT-qPCR for detection of extracellular vesicle microRNAs in vivo: a time- and cost-effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (4), L742-L749 (2020).
  73. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  74. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  75. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. J Extracell Vesicles. 10 (10), e12130(2021).
  76. Salunkhe, S., Basak Dheeraj, M., Chitkara, D., Mittal, A. Surface functionalization of exosomes for target-specific delivery and in vivo imaging, tracking: Strategies and significance. J Control Release. 326, 599-614 (2020).
  77. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Adv Drug Deliv Rev. 179, 114001(2021).
  78. Gurunathan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the isolation, characterization, biological function, and multifarious therapeutic approaches of exosomes. Cells. 8 (4), 307(2019).
  79. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  80. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  81. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  82. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular vesicles: Composition, biological relevance, and methods of study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
  83. Kowkabany, G., Bao, Y. Nanoparticle tracking analysis: An effective tool to characterize extracellular vesicles. Molecules. 29 (19), 4672(2024).
  84. Li, H. Metastatic characteristics of SY86B human gastric carcinoma in athymic nude mice. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 10 (6), 421-423 (1988).
  85. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 2, 80-103 (2021).
  86. Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends Biotechnol. 38 (10), 1066-1098 (2020).
  87. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  88. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. J Extracell Vesicles. 4, 25530(2015).
  89. Breitwieser, K., et al. Detailed characterization of small extracellular vesicles from different cell types based on tetraspanin composition by ExoView R100 platform. Int J Mol Sci. 23 (15), 8544(2022).
  90. An, H. J., Cho, H. K., Song, D. H., Kee, C. Quantitative analysis of exosomes in the aqueous humor of Korean patients with pseudoexfoliation glaucoma. Sci Rep. 12 (1), 12875(2022).
  91. Hefley, B. S., McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Ciolino, J. B., Karamichos, D. Corneal epithelial-stromal constructs to study differences associated with diabetes mellitus. Exp Eye Res. 248, 110100(2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EV BiomarkersNanoparticle AnalyzerTetraspanin ChipTear SamplesNon Invasive BiomarkersFluorescence DetectionCD63 CD81 CD9Disease Monitoring

Gerelateerde artikelen