Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Innervatie van menselijke darmorganoïden

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67702

⸱

17 januari 2025

 ,  , 
1Program in Children's Regenerative Medicine, Department of Pediatric Surgery, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

In dit artikel

Samenvatting

Menselijke darmorganoïden moeten worden geïnnerveerd om de structuur en functie van de inheemse menselijke darm beter samen te vatten. Hier presenteren we een methode om een enterisch zenuwstelsel in deze constructies op te nemen.

Samenvatting

De complexiteit van de cytoarchitectuur en functie van de darm vormt een aanzienlijke uitdaging voor de aanleg van de bio-engineered dunne darm. Technieken voor het genereren van menselijke darmorganoïden (HIO's) die lijken op de menselijke dunne darm zijn eerder gerapporteerd. HIO's bevatten epitheel en mesenchym, maar missen andere kritieke componenten van de functionele darm, zoals het enterische zenuwstelsel (ENS), immuuncellen, vaatstelsel en microbioom. Twee onafhankelijke onderzoeksgroepen hebben verschillende methoden gepubliceerd om HIO's te innerveren met een ENS. Hier bespreken we een unieke methode om het ENS op te nemen in een HIO-afgeleide bio-engineered dunne darm, die componenten van deze eerdere rapporten gebruikt om de identiteit van de voorlopercellen en de ontwikkelingstiming te optimaliseren.

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) worden gedifferentieerd om onafhankelijk HIO's en enterische neurale lijstcellen (ENCC's) te genereren door temporele regulatie van differentiatiemarkers over een periode van enkele dagen volgens gepubliceerde protocollen. Zodra HIO's het sferoïde stadium in het midden van de dikke darm bereiken (ongeveer dag 8), worden ENCC-sferoïden op dag 15-21 gedissocieerd, samen gekweekt met HIO's en gesuspendeerd in heldere driedimensionale (3D) basaalmembraanmatrixdruppels. HIO + ENCC-co-culturen worden 28-40 dagen in vitro gehouden voordat ze worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen van >9 weken oud voor verdere ontwikkeling en rijping. Getransplanteerde HIO's (tHIO's) met ENS kunnen 4-20 weken later worden geoogst. Deze methode integreert elementen uit twee eerder gepubliceerde technieken door gebruik te maken van ENCC's die zijn gegenereerd uit hPSC's en deze in een vroeg stadium van ontwikkeling samen te kweken met HIO's om de blootstelling aan vroege ontwikkelingssignalen die waarschijnlijk bijdragen aan de vorming van een meer volwassen darmmorfologie te maximaliseren.

Inleiding

De menselijke dunne darm is een complex, meerlagig orgaan dat tal van essentiële functies vervult, zoals spijsvertering, opname van voedingsstoffen, vochtregulatie, immuunbarrièrefunctie en beweeglijkheid. Talrijke klinische ziekten, zoals het kortedarmsyndroom, enteropathieën of motiliteitsstoornissen, worden gekenmerkt door kritische vermindering van de darmmassa of verstoringen van de normale fysiologie, wat leidt tot significante morbiditeit en mortaliteit 1,2,3,4. De huidige behandelingsopties omvatten vaak een operatie om de disfunctionele darm te verwijderen ten koste van een verminderde darmlengte en daarmee de functionele capaciteit van de resterende darm5. Er is behoefte aan regeneratieve therapieën die additief van aard zijn, waardoor de functionele darmcapaciteit wordt vergroot en de darmfunctie wordt hersteld op manieren die de huidige therapeutische paradigma's niet kunnen bereiken.

Bio-engineered dunne darm is een veelbelovende oplossing voor deze uitdagingen. Menselijke darmorganoïden (HIO's) afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) zijn een uitgangsmateriaal voor de bio-engineered dunne darm. In 2011 rapporteerden Spence et al. voor het eerst de succesvolle creatie van moderne HIO's uit hPSC-lijnen, waaronder zowel H1- als H9-lijnen van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en meerdere door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) lijnen 6,7. Hun protocol omvatte een zorgvuldig getimede reeks incubaties met specifieke groeifactoren om de menselijke foetale darmontwikkeling na te bootsen. Activine A, een TGFβ-signaalmolecuul, drijft hPSC-differentiatie aan in de richting van het endodermale lot, gevolgd door gerichte posterieure patronen met Wnt/FGF. Onder deze omstandigheden organiseren hPSC's zichzelf om darmsferoïden te vormen die gepolariseerd epitheel en mesenchym bevatten. 3D-cultuur binnen een basaalmembraanmatrix maakt extra ontwikkeling mogelijk, wat resulteert in organoïden met een inwendig lumen, villusachtige involuties van epitheel en zelfregenererende voorlopercelniches binnen crypte-achtige structuren.

Hoewel HIO's die met dit oorspronkelijke protocol uit 2011 zijn gegenereerd, structureel lijken op de inheemse darm, missen ze het vermogen om de neuronen of glia van het enterische zenuwstelsel (ENS) te genereren. In 2017 beschreven twee grote artikelen vergelijkbare, maar verschillende methoden om HIO's te innerveren. ENS-voorlopercellen (enterische neurale lijstcellen, ENCC's) kunnen worden afgeleid van hPSC's. In cultuur vormen ENCC's 3D-neurosferen, die onder de juiste omstandigheden kunnen differentiëren tot enterische neuronen en glia. Workman en Mahe et al. hebben een bestaand protocol aangepast om ENCC's af te leiden uit hPSC's en deze te behandelen met FGF-verrijkte media gevolgd door retinoïnezuur gedurende 2 dagen voor posteriorisatie en bevordering van het lot van vagaledieren 8,9. Dag 6 neurosferen werden nog eens 4 dagen geïncubeerd zonder RA en vervolgens werden gemigreerde cellen verzameld na enzymatische loslating. Ongeveer 20.000-50.000 ENCC's werden geaggregeerd met vroege sferoïden in de middendikke darm en deze ENCC-gezaaide darmsferoïden werden gedurende 28 dagen in vitro gekweekt in een heldere 3D-basaalmembraanmatrix tot in vivo implantatie in de niercapsule van immunodeficiënte muizen gedurende 6-10 weken. De resulterende HIO + ENS vertoonde significante rijping van epitheliale en mesenchymale componenten, evenals neurogliale structuren vergelijkbaar met ganglia, zij het met een lagere cellichaamsdichtheid dan de inheemse darm, afwezigheid van bepaalde klinisch relevante neuronale subtypes (d.w.z. CHAT-positieve neuronen in HIO + ENS na transplantatie) en algehele foetale kenmerken.

In hetzelfde jaar publiceerden Schlieve et al. een alternatieve methode met een mengsel van 40-60 intacte, dag 15 ENCC-neurosferen met meer rijpe HIO's op het moment van in vivo transplantatie in het omentum van immunodeficiënte muizen gedurende 3 maanden zonder voorafgaande in vitro co-cultuur10. Hun constructies, ENCC-HIO-TESI (weefselgemanipuleerde dunne darm) genaamd, leken een volwassener ENS-fenotype te bevatten dan dat van Workman en Mahe's HIO + ENS met een grotere diversiteit aan neuronale subtypes en neuro-epitheliale synaptische verbindingen die niet worden gezien in HIO + ENS. Belangrijk is dat de ENCC's die in de experimenten van Schlieve werden gebruikt, via een andere methode werden afgeleid, zoals eerder beschreven door Fattahi et al.11. In het kort ondergingen hPSC's (zowel hESC's als hiPSC's) neurale lijstinductie in FGF2-verrijkte media. Deze cellen werden ook behandeld met RA om een enterisch vagaal lot vast te stellen, maar gedurende 5 dagen (dag 6-11), een toename ten opzichte van de 2 dagen van Workman en Mahe (dag 4-5). In 2019 publiceerden Barber et al. een herziene versie van het Fattahi-protocol, inclusief een grondigere beschrijving van de kweekomstandigheden en een overgang naar gedefinieerde basale media om inconsistentie te verminderen en de veranderende celcultuurvoorkeuren op dat moment weer te geven12.

Onze methode voor het innerveren van HIO's, die hieronder in detail wordt beschreven, bevat elementen van zowel de Workman/Mahe- als de Schlieve-protocollen. Hoewel het ENS in Schlieve's ENCC-HIO-TESI volwassener leek met een grotere neuronale diversiteit en neurogliale integratie, integreerden beide methoden met succes een functioneel ENS in de HIO's met aangetoonde veranderingen in gastro-intestinale transcriptionele expressie. Workman en Mahe's HIO + ENS induceerde verhoogde expressie van verschillende genen die verband houden met intestinale stamcellen en de ontwikkeling van epitheelcellen, die niet waren veranderd in ENCC-HIO-TESI. Een mogelijke verklaring voor dit onderscheid zijn de verschillende tijdstippen waarop ENCC's en HIO's werden gecombineerd tussen de protocollen. Ons laboratorium heeft waargenomen dat vroege cocultuur resulteert in de verhoogde expressie van meerdere genen die betrokken zijn bij epitheliale en mesenchymale differentiatie, en de timing van cocultuur beïnvloedt de diversiteit van epitheelcellen (niet-gepubliceerde gegevens). Het is mogelijk dat eerdere blootstelling van ENS-voorlopers voor het ontwikkelen van HIO's en vice versa tijd biedt voor nog ongedefinieerde signaaloverspraak die de epitheliale diversiteit en andere vroege ontwikkelingsprocessen bevordert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9 was afkomstig van WiCell (Madison, WI) en alle experimenten met hESC's werden goedgekeurd door het UTHealth Houston Stem Cell Research Oversight (SCRO) Committee (protocol #SCRO-23-01). Voor dit protocol verwijzen alle verwijzingen naar gecoate platen of putten naar platen of putten die zijn voorbereid met hESC-gekwalificeerde 3D-basaalmembraanmatrix.

1. Preparaat van de celcultuur

OPMERKING: Ons lab gebruikt H9 hESC's, maar meerdere hPSC-lijnen zijn met succes gebruikt door andere laboratoria om HIO's en ENCC's te genereren, waaronder H9 hESC's 9,10,12, H1 hESCs9, hESC-lijn UCSF412 en meerdere hiPSC-lijnen zoals WTC1112, WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9, WTC10 9,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)9 en WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)9.

  1. Bereid een plaat met 6 putjes voor door elk gewenst putje te coaten met een 3D-basaalmembraanmatrix verdund in een geschikt celkweekmedium (verdunningsfactor en instructies voor de bereiding zijn te vinden in het materiaalgegevensblad). Bestrijk elk gewenst putje met 1 ml per putje en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur of een nacht om uit te harden voordat de cellen worden uitgestippeld.
    OPMERKING: Dit protocol kan worden aangevuld met cellen uit slechts één put of indien nodig worden opgeschaald. We raden aan om ten minste drie putten te coaten om te beginnen met het vergemakkelijken van extra passage en onderhoud van ongedifferentieerde hPSC's.
    Het is belangrijk om de basaalmembraanmatrix koud te houden tijdens het werken, aangezien de meeste matrices bij kamertemperatuur beginnen te polymeriseren. Gecoate putjes zijn tot 2-3 weken bruikbaar bij opslag bij 37 °C. Bewaar met voldoende verdunningsmiddel om de hele put te bedekken om te voorkomen dat de coating uitdroogt.
  2. Ontdooi hPSC's (idealiter een laag passagegetal) door kort rond te draaien in een warmwaterbad. Resuspendeer onder een laminaire stromingskap één injectieflacon met cellen in 2 ml stamcelmedia (tabel 1). Zuig het verdunningsmiddel op van een eerder gecoate put in een schaal met 6 putjes onmiddellijk voor het plateren van de cellen en breng vervolgens de volledige 2 ml geresuspendeerde cellen over naar de gecoate put. Voor het onderhoud van ongedifferentieerde hPSC's (ook wel onderhoudsplaten genoemd), incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en vervang de media om de dag met 2 ml stamcelmedia per putje.
  3. Passeer de cellen wanneer ze 70-80% samenvloeiing bereiken. Zuig de media vanaf de zijkant van de put op zonder de cellen te verstoren. Voeg 1 ml stamceldissociatiereagens op kamertemperatuur toe aan het putje en zuig het binnen 1 minuut op, waarbij er een dunne vloeistoflaag over de cellen overblijft. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Wachten tot de cellen voorbij 80% samenvloeiing naar doorgang zijn, kan problemen veroorzaken met voortijdige differentiatie, waardoor de opbrengst bij de volgende stappen afneemt.
  4. Voeg 1 ml per putje warm stamcelmedium toe en tik op de zijkant van de plaat om kolonies los te maken. Pipetdruk de media voorzichtig met behulp van een P1000-micropipet met een pipetpunt met brede opening (zie de materiaaltabel) om de kolonies op te breken en tegelijkertijd celbeschadiging tot een minimum te beperken.
    OPMERKING: Bij het tritureren van de celsuspensie wordt aanbevolen om grote klonten cellen op te splitsen, maar kleinere clusters intact te laten. Het wordt niet aanbevolen om een eencellige suspensie te bereiken, maar om te streven naar minder, kleinere kolonies die gelijkmatig over de put zijn verspreid.
  5. Zuig het verdunningsmiddel op uit een eerder gecoate put in een schaaltje met 6 putjes en voeg 2 ml warme stamcelmedia toe. Breng het gewenste volume van de celsuspensie over in dit putje om hPSC-kolonies te behouden, waarbij u de media om de dag vervangt met 2 ml stamcelmedia per putje.
    OPMERKING: Ons laboratorium brengt doorgaans volumes tussen 50-150 μL over om eenmaal per week hPSC-onderhoudsplaten te kunnen passeren. Dit volume kan variëren afhankelijk van de specifieke hPSC-regel en het passagenummer en moet dus worden aangepast. Gebruik de resterende cellen om het genereren van ENCC (sectie 2) of HIO-generatie (sectie 3) te starten. Pas ontdooide hPSC's moeten ten minste twee keer worden gepasseerd voordat wordt overgegaan op ENCC-generatie of HIO-generatie.

2. ENCC-generatie

OPMERKING: Onze methode voor het genereren van ENCC volgt nauwgezet de methode die is beschreven door het Fattahi-lab en wordt gebruikt door Schlieve et al.10. We gebruiken een licht gewijzigde versie van de protocoloptie B via de secties "Enteric Neural Crest (ENC) Induction (Days 0-12)" en "ENCC Spheroid Formation (Day 12-15)" in Barber et al.10,12.

  1. Zuig het verdunningsmiddel uit een eerder gecoate put op in een nieuwe schaal met 6 putjes en voeg 2 ml warme stamcelmedia toe. Breng 850 μL hPSC-celsuspensie over van stap 1.5 naar dezelfde put (meestal een passagingsverhouding van 5:6).
  2. Houd de cellen op 37 °C, 5% CO2. Vervang de media om de dag met 2 ml stamcelmedia per putje totdat de confluentie 60-80% bereikt. Dan is de plaat klaar om met ENC-inductie te beginnen.
  3. ENC-inductie
    1. Dag 0. Zuig media op vanaf de zijkant van de put en voeg 2 ml warme Cocktail A-media toe (Tabel 1). Keer terug naar de couveuse voor 48 uur.
    2. Dag 2. Zuig Cocktail A-media aan vanaf de zijkant van de put en vervang deze door 2 ml warme Cocktail B-media (Tabel 1). Keer terug naar de couveuse voor 48 uur.
    3. Dag 4. Zuig Cocktail B-media op vanaf de zijkant van de put en vervang deze door 2 ml verse, warme Cocktail B-media. Keer terug naar de couveuse voor 48 uur.
    4. Dagen 6-12. Zuig Cocktail B-media op vanaf de zijkant van de put en vervang deze door 2 ml warme Cocktail C-media (Tabel 1). Keer terug naar de incubator en vervang de media door 2 ml verse, warme Cocktail C om de 48 uur tot de voltooiing van de ENC-inductie op dag 12.
      OPMERKING: In dit stadium kunnen ENC-lijnen worden bevestigd door genexpressieanalyse zoals beschreven door Barber et al.12.
  4. ENCC sferoïde vorming
    1. Dag 13. Aspireer Cocktail C-media vanaf de zijkant van de put. Voeg 1 ml warm enzymatisch celloskoppelingsreagens toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Tik op de zijkant van de plaat om de cellen los te maken en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml met behulp van een pipetpunt met brede opening. Was het putje met 1 ml Neural Crest Cell (NCC) media (Tabel 1) en voeg het wasgoed toe aan de 15 ml conische buis.
    2. Centrifugeer de celsuspensie in de conische buis van 15 ml bij 300 × g gedurende 1 min. Aspiratie van het bovenlevende. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 2 ml warme NCC-media.
    3. Voeg de geresuspendeerde cellen toe aan een nieuw, niet-gecoat putje van een plaat met een ultralage binding en incubeer bij 37 °C 5% CO2 gedurende 48 uur.
    4. Dagen 15-21. Bewaak de groei van ENCC-sferoïden en vervang de media elke 48 uur door 2 ml verse, warme NCC-media.
      OPMERKING: Mediawijzigingen moeten met zorg worden uitgevoerd om beschadiging of aspiratie van de ENCC-sferoïden te voorkomen. Dit kan het beste worden bereikt door de plaat in een cirkelvormige beweging rond te draaien om de sferoïden in het midden van de put te concentreren en vervolgens de media vanaf de rand van de put op te zuigen.
      De vorming van ENCC-sferoïden is doorgaans voltooid op dag 15, hoewel het acceptabel is om ze tot dag 21 te kweken om een ideale timing van cocultuur met sferoïden in de midden-achterdarm mogelijk te maken.

3. HIO-generatie (sferoïde fase in het midden van de achterdarm)

OPMERKING: Onze methode voor het genereren van HIO is fundamenteel hetzelfde als het oorspronkelijke protocol dat in detail is beschreven door McCracken et al. en anderen van de Spence- en Wells-laboratoria 6,7. Het proces vindt plaats in twee fasen: definitieve inductie van het endoderm (DE) en sferoïde vorming van de middendarm.

  1. Voorbereiding op HIO-generatie
    1. Bereid een plaat met 24 putjes voor door elk gewenst putje te bedekken met een 3D-basaalmembraanmatrix verdund in een geschikt celkweekmedium (verdunningsfactor en instructies voor de bereiding zijn te vinden in het materiaalgegevensblad). Smeer elk gewenst putje in met 500 μl per putje en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur of een nacht om uit te harden voordat de cellen worden geplateerd.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de basaalmembraanmatrix koud te houden tijdens het werken, aangezien de meeste matrices bij kamertemperatuur beginnen te polymeriseren. Gecoate putjes zijn tot 2-3 weken bruikbaar bij opslag bij 37 °C. Bewaar met voldoende verdunningsmiddel om de hele put te bedekken om te voorkomen dat de coating uitdroogt.
      Plan om 6 putjes van een plaat met 24 putjes te coaten voor elke 1 put van de hierboven beschreven hPSC-onderhoudsplaten met 6 putjes. Deze verhouding kan naar wens worden opgeschaald.
    2. Zuig het verdunningsmiddel op uit alle eerder gecoate putjes in een schaal met 24 putjes. Voeg voldoende warme stamcelmedia toe aan de hPSC-celsuspensie uit stap 1.5 en verdeel 500 μl over elk putje (bv. als er 850 μl hPSC-celsuspensie overblijft na het passeren van de hPSC-onderhoudsplaat, meng dan voor 6 putjes van een plaat met 24 putjes 2.150 μl warme stamcelmedia met 850 μl hPSC-celsuspensie uit stap 1.5; en 500 μL verdeeld in elk van de 6 putjes).
      OPMERKING: Aangezien we doorgaans hPSC-onderhoudsplaten met een volume van 50-150 μl doorvoeren, hebben we meestal volumes van 850-950 μl beschikbaar voor deze stap. Het volume hPSC's per putje in de plaat met 24 putjes benadert dus 150 μL/putje.
      Zodra de nieuw voorbereide plaat met 24 putjes in de broedmachine is geplaatst, schudt u de plaat voorzichtig heen en weer (van noord naar zuid en van oost naar west) om de cellen zo gelijkmatig mogelijk over de bodem van de put te verdelen.
    3. Houd de cellen op 37 °C, 5% CO2. Vervang de media om de dag met 500 μL stamcelmedia per putje totdat de confluentie 50-70% bereikt. Dan is de plaat klaar om te beginnen met DE-inductie.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat cellen geen >70% confluentie bereiken voorafgaand aan DE-inductie, aangezien een hogere confluentie de dichtheid van het endoderm en de morfogenese van de dikke darm in de volgende stadia nadelig beïnvloedt. Idealiter bereiken cellen na 24-48 uur ongeveer 50-70% samenvloeiing bij de gespecificeerde passageverhoudingen.
  2. DE inductie
    1. Dag 1. Zodra hPSC's een samenvloeiing van 50-70% hebben bereikt, zuigt u de stamcelmedia volledig op uit elke put en vervangt u deze door 500 μL warme Dag 1 DE-media (Tabel 1) per putje. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
    2. Dag 2. Zuig de Dag 1 DE op en vervang deze door 500 μL warme Dag 2 DE (Tabel 1) media per putje. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
    3. Dag 3. Zuig de Dag 2 DE op en vervang deze door 500 μL warme Dag 3 DE (Tabel 1) media per putje. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
  3. Sferoïde formatie van de middenhinddarm
    1. Dagen 4-8. Zuig de media volledig op uit elke put en vervang deze door 500 μL warme media in de middendikke darm (MHGM, tabel 1) per putje. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2. Herhaal deze stap dagelijks tot dag 8, wanneer de sferoïden in de middendarm klaar zijn voor verzameling en cocultuur (sectie 4).

4. Co-cultuur van sferoïden in de midden-achterdarm met ENCC's

OPMERKING: Een grafische samenvatting van dit gedeelte vindt u in Figuur 1.

  1. Voorbereiding van de ENCC-suspensie
    1. Verzamel dag 15-21 ENCC-sferoïden uit stap 2.4.4. Door de media voorzichtig uit de put te verwijderen en het opzuigen van de sferoïden te vermijden met behulp van de wervelmethode die wordt beschreven in de opmerking voor die stap.
    2. Voeg 1 ml van een reagens voor warme enzymatische celloslating toe aan het putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    3. Tik op de zijkant van de plaat om door te gaan met het dissociëren van sferoïden en trituleer met een P1000-micropipet met een punt met brede opening door voorzichtig op en neer te pipetteren om klonten cellen te breken totdat het mengsel homogeen is.
    4. Breng de ENCC-suspensie over in een conische buis van 15 ml. Was de put met 1 ml warme NCC-media (zie tabel 1) om eventuele resterende cellen op te vangen en voeg dit toe aan de conische buis van 15 ml.
    5. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 1 min. Zuig het bovenstaande op met een steriele pipetpunt.
    6. Gebruik een pipetpunt met brede opening om de celpellet opnieuw te suspenderen in 1 ml warme NCC-media. Bereken de concentratie van de ENCC-suspensie met behulp van een hemacytometer of celteller.
  2. Combinatie van ENCC-suspensie met sferoïden in de middenachterdarm
    1. Verzamel de sferoïden in het midden van de achterdarm uit alle putjes van een HIO-plaat met behulp van een pipetpunt met brede opening en breng ze over naar een conische buis van 15 ml.
    2. Bepaal het aantal cocultuurputjes dat zal worden gebruikt in een plaat met 24 putjes. Streef ernaar om 10-30 sferoïden in de middendikke darm en 50.000-100.000 ENCC's per put te plaatsen voor cocultuur.
      LET OP: In de praktijk is er vaak een één-op-één relatie tussen het aantal putjes met gezonde sferoïden en het uiteindelijke aantal putjes dat nodig zal zijn voor cocultuur. Een hemocytometer kan ook worden gebruikt om de concentratie van verzamelde sferoïden in de middendikke darm te berekenen.
    3. Voeg het berekende volume van de ENCC-suspensie toe om 50.000-100.000 ENCC's per geplande cocultuurput af te leveren aan de conische buis met de sferoïden in het midden van de achterdarm. Trituleer voorzichtig met een pipetpunt met brede opening om de sferoïden en ENCC's in het midden van de achterdarm gelijkmatig te mengen.
    4. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 300 × g en zuig het bovenstaande voorzichtig op met een steriele pipetpunt. Gebruik een pipetpunt met brede opening om de celpellet te resussen in een volume koude, fenolvrije (heldere), groeifactor-gereduceerde basaalmembraanmatrix, gelijk aan 30 μL per uiteindelijke cocultuurput.
      OPMERKING: Vermijd het vormen van luchtbellen in de heldere basaalmembraanmatrix tijdens het resuspensie, omdat deze moeilijk te verwijderen zijn, een goede imbibitie van de media door de HIO+ENCC-coculturen belemmeren en de visualisatie van de HIO+ENCC-coculturen verminderen naarmate ze groeien.
    5. Piket in het midden van elke droge put een druppel van 30 μl geresuspendeerde sferoïden in de middendikke darm + ENCC's in een heldere basaalmembraanmatrix zonder omringende media. Zodra alle druppels in de putjes zijn geplateerd, bedek en keer de plaat om. Incubeer omgekeerd bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 min.
      OPMERKING: Deze stap geeft de sferoïden en ENCC's in de middendikke darm de tijd om weg te vallen van de bodem van de plaat en te zweven tijdens de polymerisatie van de heldere 3D-basaalmembraanmatrix.
  3. In vitro HIO+ENS cocultuur
    1. Dag 0: Zodra de heldere basaalmembraanmatrix is gepolymeriseerd, bedek je elke druppel met 500 μL warme Dag 0-3 HIO-media (zie Tabel 1).
    2. Dag 3: Zuig de Day 0-3 HIO-media voorzichtig op vanaf de zijkant van de put, zonder de heldere druppel van de basaalmembraanmatrix te verstoren. Vervang de media door 500 μL warme dag 3-14 HIO-media (zie tabel 1). Plaats de plaat terug in de broedmachine. Vervang in dit stadium de media elke 3-4 dagen.
    3. Dag 7-14: Ga door met het vervangen van dag 3-14 HIO-media als dat nodig is om de 3-4 dagen en houd de groei in de gaten.
  4. HIO's splitsen
    1. Dag 14: Onderzoek elke put zorgvuldig onder een microscoop en beoordeel hoeveel zich ontwikkelende HIO + ENS er in elke heldere 3D-basaalmembraanmatrixdruppel zitten.
    2. Bereid 2 ml microcentrifugebuisjes voor met 30 μl heldere basaalmembraanmatrix en bewaar deze op ijs.
    3. Gebruik onder een laminaire stromingskap een fijne tang om de heldere 3D-basaalmembraanmatrixdruppel voorzichtig te verwijderen met de hangende HIO+ENS. Plaag de afzonderlijke HIO+ENS voorzichtig uit elkaar.
      OPMERKING: Chirurgische loepen of een ontleedmicroscoop kunnen in dit stadium zeer nuttig zijn, maar zijn niet strikt noodzakelijk, aangezien HIO's vaak met het blote oog goed zichtbaar zijn.
    4. Plaats elke geïsoleerde HIO + ENS in een van de voorbereide microcentrifugebuisjes met 30 μl heldere basaalmembraanmatrix met behulp van een tang of een pipetpunt met brede opening.
      OPMERKING: Oude heldere 3D-basaalmembraanmatrix hoeft in dit stadium niet vloeibaar te worden gemaakt of opgelost. Vermijd het verstoren van de HIO's indien mogelijk, maar als dit gebeurt, kan het in latere stadia nog steeds groeien.
    5. Herhaal stap 4.2.5 voor de gespleten en opnieuw geplateerde HIO+ENS. Zodra de heldere 3D-basaalmembraandruppels zijn gepolymeriseerd, voegt u 500 μL warme, verse Dag 3-14 HIO-media toe aan elke put en broedt u deze een nacht uit.
  5. HIO+ENS-cocultuur voortgezet
    1. Dag 15: Zuig de dag 3-14 HIO-media voorzichtig op vanaf de zijkant van de put. Vervang de media door 500 μL warme Day 15-28 HIO-media (zie tabel 1).
    2. Dag 15-40: Ga door met het vervangen van dag 15-28 HIO-media indien nodig elke 3-4 dagen en het monitoren van de HIO + ENCC-groei.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het ENS reguleert de essentiële functies van de rijpe dunne darm, waaronder peristaltiek, opname van voedingsstoffen, vloeistoftransport en onderhoud van de epitheelbarrière. Het doel van het innerveren van HIO's is dus om deze constructies te voorzien van de elementen die nodig zijn om meer volwassen functionaliteit op een hoger niveau te ontwikkelen. Daartoe bestudeert ons lab specifiek de ontwikkeling van het ENS binnen HIO's en de functionele resultaten in verschillende stadia.

<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

HIO's worden sinds het begin van de jaren 2010 gebruikt als modelsysteem voor de ontwikkeling van de menselijke darm en zijn sindsdien steeds complexer geworden. Het is nu mogelijk om deze constructen te voorzien van een ENS, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan in de studie van normale ontwikkeling die kunnen worden toegepast om een aantal klinische gastro-intestinale entiteiten te begrijpen en beter te behandelen.

In vivo ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dank aan onze vele medewerkers en mentoren, waaronder Noah Shroyer, Michael Helmrath, James Wells en Faranak Fattahi, die ons in staat hebben gesteld hun laboratoria te bezoeken en ons in de loop der jaren hebben geholpen ons protocol te verfijnen. We willen ook Chris Mayhew en Amy Pitstick van de Pluripotent Stem Cell Facility en het Center for Stem Cell & Organoid Medicine (CuSTOM) van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center bedanken voor het verstrekken van HIO-training, begeleiding en advies aan ons laboratorium. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Texas Medical Center Digestive Diseases Center Pilot/Feasibility grant award (gedeeltelijk gefinancierd door NIH/NIDDK P30DK056338) (Speer), de NIDDK (NIH 1K08DK131326-01A1) (Speer), de Men of Distinction award (Speer) en de American Neurogastroenterology and Motility Society (ANMS) Transition Award (Speer).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)ThermoFischer Scientific11140050
15 mL conical tubesThermo Scientific12565269
AccutaseSTEMCELL Technologies07920"enzymatic cell detachment reagent"
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AThermoFischer Scientific12587010Voor ENCC
B-27 Supplement (50x), serum freeGibco17504044Voor HIO
Bright-Line HemacytometerHausser Scientific3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment MicroplatesFisher Scientific07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treatedVWR29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 wellVWR29442-042
Essential 6 MediaThermo FischerA1516401
Essential 8 MediaThermo FischerA2858501Alternatief stamcelmedium, gebruikt voor ENCC platen. 
Fine-tip forcepsDumont11223-20
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific50145522
Gibco Advanced DMEM/F12ThermoFischer Scientific12634-010
Gibco HEPES 1 MThermoFischer Scientific15630-080
Gibco Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103-049
Glutagro, 200 mM, 100xCorning25-015-CI
GlutamaxThermoFischer Scientific35050061
H9 human ESCWicell International Stem Cell BankN/A
HyCloneTM FBS DefinedVWR16777-002
LabGard Biological Safety CabinetNuaireNu-430-400
Matrigel GFR Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-FreeCorning356231"Clear 3D basement membrane matrix"
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-FreeCorning354277"3D basement membrane matrix"
MicropipettesEppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0.5-10, 0.1-2.5 uL)2231300008
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850"stamcelmedium"
Catalognummer omvat het 5x supplement, dat vooraf in bulk moet worden toegevoegd. 
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048Voor HIO
N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)Thermo FisherA1370701Voor ENCC. Iets andere formulering.
Nikon DS-Fi2 TS-100 microscopeNikonTS100
Noggin-conditioned mediaTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFischer Scientific15140-122
Recombinant Human Activin ACell Guidance SystemsGFH6-100
Recombinant Human BMP-4Fisher Scientific314BP010
Recombinant Human EGF Protein, CFThermoFisher Scientific236-EG-200
Recombinant Human FGF basic/FGF2 (146 aa) ProteinThermoFischer Scientific233-FB-010
Recombinant Human FGF-4Peprotech100-31
ReLeSRSTEMCELL Technologies5872"Stamceldissociatiereagens"
Retinoic acidSIGMAR2625-50MG
Rnase-free Microfuge tubes, 2 mLThermo ScientificAM12425
RPMI 1640 MediumThermoFischer Scientific11875093
R-Spondin conditioned mediaTexas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
SB 431542, Tocris BioscienceFisher Scientific16-141-0
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific
Standard Wide Orifice Pipettor TipsVWR89049-166
Stemolecule Chir99021 in SolutionStemgent04-0004-02
Sterile filter pipette tipsVWR (1000uL, 200uL, 10uL)76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XFStem Cell Technologies7180Alternatieve 3D basement membrane matrix, gebruikt voor ENCC platen. 

Referenties

  1. Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).
  2. Spencer, A. U., et al. Pediatric short bowel syndrome: redefining predictors of success. Ann Surg. 242 (3), discussion 409-412 403-409 (2005).
  3. Goulet, O., Pigneur, B., Charbit-Henrion, F. Congenital enteropathies involving defects in enterocyte structure or differentiation. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 56-57, 101784(2022).
  4. Koglmeier, J., Lindley, K. J. Congenital diarrhoeas and enteropathies. Nutrients. 16 (17), 2971(2024).
  5. Duggan, C. P., Jaksic, T. Pediatric intestinal failure. N Engl J Med. 377 (7), 666-675 (2017).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6 (12), 1920-1928 (2011).
  8. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  9. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23 (1), 49-59 (2017).
  10. Schlieve, C. R., et al. Neural crest cell implantation restores enteric nervous system function and alters the gastrointestinal transcriptome in human tissue-engineered small intestine. Stem Cell Rep. 9 (3), 883-896 (2017).
  11. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  12. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  13. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Rep. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  14. Boyle, M. A., et al. In vivo transplantation of human intestinal organoids enhances select tight junction gene expression. J Surg Res. 259, 500-508 (2021).
  15. Finkbeiner, S. R., et al. Generation of tissue-engineered small intestine using embryonic stem cell-derived human intestinal organoids. Biol Open. 4 (11), 1462-1472 (2015).
  16. Mahe, M. M., Brown, N. E., Poling, H. M., Helmrath, M. A. In vivo model of small intestine. Methods Mol Biol. 1597, 229-245 (2017).
  17. McNeill, E. P., Gupta, V. S., Sequeira, D. J., Shroyer, N. F., Speer, A. L. Evaluation of murine host sex as a biological variable in transplanted human intestinal organoid development. Dig Dis Sci. 67 (12), 5511-5521 (2022).
  18. Singh, A., et al. Evaluation of transplantation sites for human intestinal organoids. PLoS One. 15 (8), e0237885(2020).
  19. Watson, C. L., et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat Med. 20 (11), 1310-1314 (2014).
  20. Cortez, A. R., et al. Transplantation of human intestinal organoids into the mouse mesentery: A more physiologic and anatomic engraftment site. Surgery. 164 (4), 643-650 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Enterisch zenuwstelselinnervatie van organo denenterische neurale kampluripotente stamcellen3D beeldvormingbasaalmembraanmatrixsfero de cocultuurneuronale markersgliale markers
Innervatie van menselijke darmorganoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.