Kwantificering van het verzorgingsgedrag van Drosophila melanogaster voor evaluatie van overmatige verzorgingsfenotypes

Summary

De hier gepresenteerde methode omvat het handmatig annoteren van beeldmateriaal dat is verkregen van Drosophila melanogaster voor specifiek verzorgingsgedrag. Het maakt het mogelijk om zowel het aantal vlooiingsperiodes als de totale tijd die aan vlooiing wordt besteed te kwantificeren om te evalueren op atypische fenotypes van zelfverzorging.

Abstract

Waarneembare veranderingen in stereotiepe vlooiing worden translationeel toegepast in modelorganismen. Deze veranderingen zijn representatief voor pathologieën die soortgelijke afwijkingen in menselijk gedrag uitlokken; overmatige verzorging fungeert bijvoorbeeld als een proxy voor obsessief en dwangmatig gedrag dat aanwezig is bij aandoeningen zoals het Tourette-syndroom of obsessief-compulsieve stoornis. De gepresenteerde verzorgingstest maakt de evaluatie mogelijk van abnormale fenotypes van zelfverzorging in Drosophila melanogaster. Vliegen worden gedurende een periode van 10 minuten geregistreerd en deze opnames worden geobserveerd en blind geannoteerd voor eerder gedefinieerd verzorgingsgedrag. Kwantitatieve metingen van zowel de frequentie van de vlooiingsperiode als de tijd die aan zelfverzorging wordt besteed, kunnen worden verkregen door de beelden handmatig te annoteren. De test is relatief goedkoop, vereist weinig materialen die nog niet beschikbaar zijn in laboratoriumomgevingen en is gemakkelijk aan te passen aan de specifieke behoeften van een bepaald onderzoek dat gericht is op het observeren van vlooien. Bovendien maakt het lage vaardigheidsniveau dat nodig is om de test uit te voeren, in vergelijking met geautomatiseerde methoden met veel computerwetenschappen, het protocol zeer geschikt voor kleine laboratoria en studenten. We bespreken in detail de stappen die nodig zijn om deze test uit te voeren en de huidige beperkingen ervan.

Introduction

Drosophila melanogaster is een gerenommeerd modelorganisme in gedrags- en neurobiologische studies, dat inzicht geeft in mechanismen die analoog menselijk gedrag aansturen. Zelfverzorging in dit organisme is een sterk gereguleerd en goed gedefinieerd gedrag, volgens stereotiepe patronen die gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn¹. Het afzonderlijke verzorgingsgedrag van de vlieg kan over het algemeen worden geclassificeerd in anatomisch gebied², waarbij het gemakkelijkst kan worden gedefinieerd als posterieur of anterieur. Drosophila-verzorging zal zich in eerste instantie richten op het voorste gebied en vervolgens overgaan naar het achterste uiteinde³. Onder typische omstandigheden vertonen vliegen vlooiingsgedrag om schoon te blijven (bijvoorbeeld door stof te verwijderen) en treden ze op als reactie op blootstelling aan mogelijk schadelijke externe stimuli zoals pathogene microben⁴.

Afwijkingen in vlooiingsgedrag, met name spontane obsessieve vlooien, zijn in verschillende modelsystemen gebruikt als een indicator van obsessief en/of dwangmatig gedrag. Translationele bevindingen die obsessief vlooigedrag observeren bij organismen zoals knaagdieren, vogels en hoektanden hebben inzicht gegeven in aandoeningen die soortgelijk dwangmatig gedrag bij mensen uitlokken⁵. Deze omvatten aandoeningen zoals trichotillomanie, obsessief-compulsieve stoornis en het Tourette-syndroom⁶. Overmatig vlooigedrag is ook gebruikt als benchmark bij het evalueren van gedragsfenotypes in modellen van vergelijkbare neurologische ontwikkelingsstoornissen bij Drosophila melanogaster. Obsessief vlooigedrag is waargenomen in vliegenmodellen van het Fragile-X-syndroom (FSX) en de bijbehorende autismespectrumstoornis (ASS). Overmatige spontane vlooiing treedt op bij mutaties van dfmr1, de ortholoog van het ASS en FSX-geassocieerde gen FMR1⁷. Er is bovendien een opmerkelijke verandering in de vlooiende verdeling tussen achterste en voorste uiteinden bij deze mutanten⁸. Deze veranderingen worden geïnterpreteerd als een weerspiegeling van obsessief en dwangmatig lichaamsgericht gedrag dat sommige patiënten met deze aandoeningen vertonen. Bij het gebruik van de hier beschreven verzorgingstest hebben we vlooigedrag bij vliegen waargenomen na een RNAi-gemedieerde knockdown van het Drosophila-gen Atg8a, geproduceerd door in de handel verkrijgbare GAL4-drivers en UAS-RNAi-lijnen⁹.

Deze methode omvat het handmatig annoteren van beelden van vliegen voor specifiek verzorgingsgedrag. Eerdere studies die gericht zijn op het evalueren van vlooiingsgedrag, zoals die met behulp van indirecte methoden zoals kleurstoffen, zijn weliswaar effectief in het kwantificeren van de werkzaamheid van vlooien, maar maken het niet mogelijk om de vlooiduur of frequentie¹⁰ te meten. Deze test maakt het echter mogelijk om de frequentie en duur van de Drosophila-vlooiende te kwantificeren, zowel in het algemeen als per anatomisch gebied. De methode die hier wordt beschreven, biedt enkele voordelen ten opzichte van de huidige geautomatiseerde methoden, omdat deze gemakkelijk kan worden aangepast en kan worden uitgevoerd door personen zonder een computationele achtergrond. Met de vereiste apparatuur die in de meeste laboratoria gemakkelijk beschikbaar is, bieden we een kostenefficiënte manier om te evalueren op de aanwezigheid van een overmatig zelfverzorgend fenotype (zie Materiaaltabel). Dit maakt de methode gemakkelijk toegankelijk voor voornamelijk niet-gegradueerde instellingen en gemakkelijk aan te passen aan trainingsomgevingen of onderwijslaboratoria.

Protocol

OPMERKING: Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Voorbereiding op het filmen

1. Plaats vier schaaltjes met drie putjes naast elkaar op een wit oppervlak en bedek ze elk met een glasplaatje.
2. Plaats een camera (hier een Raspberry Pi-systeem, maar elke camera die high-definition video kan maken is voldoende) boven de gerechten.
   1. Controleer of alle gerechten in beeld en focus zijn.
   2. Controleer of er geen schittering op de dia's is die de zichtbaarheid van vliegen in de schotel beperkt. Elimineer de schittering door de positie van de plaat aan te passen of de lichten in de opnameruimte te dimmen.
   3. Gebruik een hoge resolutie (minimaal 1920 x 1080 pixels) om vliegende ledematen nauwkeurig te visualiseren.
3. Markeer de positie van de servies en de camera op de bank waar de opname plaatsvindt.
   NOTITIE: Dit beperkt de tijd die wordt besteed aan stap 2 bij toekomstig gebruik van het apparaat. Door de tests op hetzelfde moment en in dezelfde ruimte uit te voeren, wordt de variabiliteit in gedrag beperkt op basis van factoren die verder gaan dan de beoogde manipulaties.
4. Verdoof de 4-9 dagen oude vliegen lichtjes met kou op een ijsblok bedekt met parafilm en een papieren handdoek (CO₂ -anesthesie heeft een aanzienlijke invloed op het gedrag).
   1. Tik de vliegen op het blok en eenmaal verdoofd, verplaats je de vliegen zo snel mogelijk met een penseel naar observatiekamers.
      OPMERKING: Deze overdracht moet zo snel mogelijk gebeuren, aangezien overmatige blootstelling aan verdoving van welke aard dan ook een negatieve invloed kan hebben op vliegen.
5. Plaats een enkele vlieg in elk putje.
6. Laat bestanden 30 minuten na de verdoving wennen aan hun nieuwe omgeving. Raak de putten met vliegen na dit punt niet meer aan of verstoor ze niet, omdat extra stressfactoren het gedrag beïnvloeden.

2. Registreren van de vliegen

1. Na de acclimatisatie van 30 minuten neemt u de vliegen op met een camera.
2. Gebruik een Raspberry Pi-camera die door PiSpy¹¹ wordt geleid voor het verzamelen van gedragsgegevens.
   OPMERKING: De software is gratis en beschikbaar op GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), en een Pi-systeem kan eenvoudig worden ingesteld voor minder dan $ 300. Andere camera's, indien al beschikbaar, zijn ook voldoende voor het opnemen van beelden
3. Start een opname met Pi met de volgende opdrachtstroom.
   1. Open de terminal en typ cd PiSpy. Typ vervolgens python3 PiSpy.py, voer de gewenste opnamelengte in en voer de gewenste framesnelheid in. Selecteer de gewenste resolutie en klik op Snel vastleggen.
   2. Gebruik de functie Preview Camera om ervoor te zorgen dat de vliegen scherp en voldoende zichtbaar zijn.
4. Neem de vliegen 10 minuten op met een aanbevolen framesnelheid van 24 fps en sla het bestand op (PiSpy slaat automatisch op in de map met video's).

3. Video-analyse (Figuur 2)

1. Om de video te analyseren, importeert u het bestand in de Elan 6.8-software¹².
   OPMERKING: Deze software, hoewel oorspronkelijk ontwikkeld voor psycholinguïstische talg voor gedetailleerde annotatie van video's en diepgaande analyse van het verzorgingsgedrag
2. Wijs elke rij toe, zoals hieronder geïllustreerd, om het beeldmateriaal van personen handmatig te annoteren.
   1. Doe dit met de volgende opdrachtstroom: Laag > Nieuwe laag toevoegen > Typ Locatie in de schotel op Laagnaam > Toevoegen.
3. Afhankelijk van de behoeften van een onderzoek, noteer en kwantificeer verschillende specifieke gedragingen (voorste en achterste verzorging, lopen, slapen en staan).
   1. Maak aantekeningen aan de hand van de onderstaande stappen.
      1. Dubbelklik op de laag waarvan u aantekeningen wilt maken. Klik met de rechtermuisknop en sleep de cursor langs het geselecteerde niveau voor een periode waarin een enkele verzorgingswedstrijd wordt vertoond. Klik met de linkermuisknop, selecteer Nieuwe annotatie en dubbelklik op de zojuist gemarkeerde periode. Typ de afkorting voor het gedrag dat op dat tijdstip wordt vertoond.
   2. Bekijk de video's langzaam, schrob er met een muis doorheen en maak annoteringen. Zoom tijdens het annoteren in op een enkele vlieg om valse identificatie van gedrag te voorkomen. Deze kunnen bestaan uit het tikken op de rand van het glas door de vlieg of het verschuiven van de benen, wat in eerste instantie op verzorging kan lijken.
4. Zodra de video volledig is geannoteerd, krijgt u een overzicht van elk gedrag. Zorg ervoor dat in de video's dezelfde afkorting of annotatie wordt gebruikt om deze functie te gebruiken.
   OPMERKING: Elan 6.8 geeft het aantal keren dat een gedrag voorkomt, de totale duur van het gedrag en de gemiddelde tijd die aan elk gedrag is besteed.
   1. Definieer vlooiingen als 2 seconden ononderbroken vlooien. Identificeer elk waargenomen gedrag als volgt. Definieer de parameters voor anatomische gebieden voorafgaand aan de uitvoering van de test.
      1. Anterieure verzorging: Identificeer de vlooiing die wordt uitgevoerd in het voorste deel van het lichaam van de vlieg als voorste vachtverzorging.
         OPMERKING: Dit gedrag omvat bijna altijd een wrijvende beweging op een voorste deel, zoals het hoofd of de slurf, met de voorste twee poten van de vlieg.
      2. Achterste verzorging: Identificeer de verzorging die wordt uitgevoerd aan het voorste-achterste uiteinde van het vliegenlichaam als achterste verzorging.
         OPMERKING: Bovendien werden voor de eenvoud vleugels opgenomen in het achterste gebied. Dit gedrag omvat bijna altijd een wrijvende beweging met de centrale en meest achterste set benen tijdens de vlieg. Een goede indicator dat er sprake is van achterste vlooiing is dat de vlieg er op het eerste gezicht uitziet alsof hij zijn meest achterste poten mist, zoals weergegeven in figuur 2D.

Results

Deze test produceert kwantitatieve gegevens die de tijd en frequentie van het verzorgingsgedrag meten op basis van geannoteerde beelden. Een representatief beeld van de opstelling en hoe gedrag wordt gedefinieerd, wordt geschetst in figuur 2. Gezien de subjectiviteit die door videoanalyse wordt geïntroduceerd, moeten alle annotaties van video's blind zijn voor de onderzoeker die de analyse uitvoert.

Deze methode werd gebruikt om d...

Discussion

Over het algemeen maakt deze gemakkelijk uitvoerbare en kosteneffectieve test een robuuste karakterisering van het verzorgingsgedrag van Drosophila melanogaster mogelijk. Deze techniek geeft inzicht in de frequentie, de tijd die wordt besteed aan en de anatomische verdeling van een groot aantal eerder geïdentificeerde verzorgingsgedragingen. Een goede indicator dat de vlooiing zal plaatsvinden of aan de gang is, zijn veranderingen in de plaatsing van de benen, met name het optil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 GB Micro SD card	Adafruit	1294	Voor gebruik bij het introduceren van het besturingssysteem
Display	Adafruit	3578	Elke display die via HDMI of flex kabel kan worden aangesloten is voldoende
Drosophila Atg8a-RNAi UAS line	Bloomington Stock Center	34340	Lijn gebruikt in representatieve gegevens
Drosophila Ok6 Driver	N/A	N/A	Lijn gebruikt in representatieve gegevens
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Houdt vliegen in isolatie
Heatsinks	Adafruit		Voorkomt oververhitting van de computer
Lens	Adafruit	4563	Alleen gebruikt met HD camera
PiCamera	Adafruit	4561	De HD versie werd hier gebruikt, maar onder budgetbeperkingen kan een standaard camera worden gebruikt
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	Computer waarop PiSpy wordt uitgevoerd
Ribbion Cable	Adafruit	1648	Voor gebruik bij het aansluiten van camera en display
SB components Case	Adafruit	4301	Beschermt de computer
Spot Plate	Fisher Scientific	S99406	Pyrex-versies waren al beschikbaar voor ons gebruik, maar celcultuurschalen of plastic spotplaten zijn ook voldoende
Tripod	Best Buy	6355959	Voor ophanging en positionering van de camera, elk apparaat dat dit kan is voldoende
USB C Power Supply	Adafruit	1995	Voedt de computer