Methodenartikel

Bepaling van vier componenten in een RNA-afgiftesysteem voor lipidennanodeeltjes door middel van vloeistofchromatografie in combinatie met verdampingslichtverstrooiingsdetector

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 mei 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen we een kwantitatieve analysemethode vast voor vier componenten in een RNA-afgiftesysteem voor lipide nanodeeltjes (LNP) met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie in combinatie met een verdampingslichtverstrooiingsdetector (ELSD). De methode heeft een goede scheiding, hoge gevoeligheid en hoge efficiëntie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een methode voor de analyse van componenten van lipide nanodeeltjes (LNP). LNP, dat dient als een cruciale vector voor op RNA gebaseerde geneesmiddelen, bestaat voornamelijk uit cholesterol, PEG met modificaties, ioniseerbare lipiden en helperlipiden. Deze componenten vertonen een zwakke polariteit, wat leidt tot een sterke retentie en moeilijkheid om te scheiden met behulp van reverse-phase chromatografie, evenals het ontbreken van duidelijke ultraviolette absorptiekarakteristieken. Om deze uitdaging aan te gaan, werd een vloeistofchromatografiesysteem gekoppeld aan een verdampingslichtverstrooiingsdetector (ELSD). Door het type chromatografische kolom systematisch aan te passen en het gradiënt-elutieprogramma van de mobiele fase te optimaliseren, werd een snelle en volledige basislijnscheiding van de vier kritieke componenten bereikt. Door gebruik te maken van de nieuwste ELSD-technologie werd de detectiegevoeligheid aanzienlijk verbeterd en werd het lineaire bereik van de methode uitgebreid. Experimentele resultaten toonden aan dat binnen een concentratiebereik van 5 μg/ml tot 250 μg/ml de vier componenten van LNP een uitstekende lineariteit vertoonden met correlatiecoëfficiënten die allemaal groter waren dan 0,999, en de nauwkeurigheid varieerde van 94,2% tot 108,0%. In precisie-experimenten waren de relatieve standaarddeviaties van zowel de retentietijd als het piekoppervlak voor een standaardoplossing van 10 μg/ml respectievelijk minder dan 0,1% en 2%. Wanneer deze methode wordt gebruikt om verschillende LNP-monsters te analyseren, worden alle componenten met succes gescheiden en wordt hun respectieve inhoud nauwkeurig gekwantificeerd, wat het robuuste aanpassingsvermogen van deze analytische benadering benadrukt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipide nanodeeltje (LNP) is een van de meest geavanceerde niet-virale genafgiftesystemen, voornamelijk gebruikt voor de afgifte van nucleïnezuurgeneesmiddelen, zoals antisense-oligonucleotiden, kleine storende nucleotiden, mRNA, enz. 1,2,3. LNP bestaat over het algemeen uit vier componenten: ioniseerbare lipiden, gemodificeerde lipiden van polyethyleenglycol (PEG), fosfolipiden en cholesterol. Het belangrijkste bestanddeel zijn ioniseerbare lipiden, die de doorslaggevende factor zijn in de efficiëntie van de afgifte van nucleïnezuurgeneesmiddelen. De andere drie componenten kunnen de stabiliteit van LNP verhogen en de herkenning van het immuunsysteem verminderen 4,5,6.

De variërende verhoudingen van de vier componenten in LNP kunnen een aanzienlijke invloed hebben op het zelfassemblageproces van de nanodeeltjes, waardoor eigenschappen zoals de inkapselingsefficiëntie van het actieve farmaceutische ingrediënt (API), de afgifte-efficiëntie en de snelheid van afgifte in vivo 7,8,9 worden beïnvloed. Daarom is het essentieel om een kwantitatieve analysemethode voor LNP-componenten op te zetten, waardoor de synthese van een optimaal LNP-afgiftesysteem wordt vergemakkelijkt10,11.

Hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) is een hedendaagse analytische techniek die veel wordt gebruikt in farmaceutische analyse en wordt gewaardeerd om zijn hoge efficiëntie, gevoeligheid en automatiseringsmogelijkheden. HPLC omvat verschillende detectoren, waaronder conventionele ultraviolette (UV) detectoren, maar ook detectoren voor algemeen gebruik zoals brekingsindexdetectoren (RID), verdampingslichtverstrooiingsdetectoren (ELSD), geladen aerosoldetectoren (CAD) en zeer selectieve radiofrequentiedetectoren (RF), onder andere12.

In het geval van de analyse van de vier componenten van LNP, die geen duidelijke UV-absorberende groepen hebben en dus geen respons opleveren in UV-detectoren, werd het gebruik van detectoren voor algemeen gebruik overwogen. Hoewel RID zo'n optie is, is het niet geschikt voor gradiëntanalyse en biedt het een relatief lagere gevoeligheid in vergelijking met de andere twee detectoren voor algemeen gebruik; Daarom werd het niet gekozen12. Bovendien, hoewel CAD-detectoren een hoge gevoeligheid hebben, maken hun onbetaalbare kosten ze minder aantrekkelijk12.

Daarom werd gekozen voor de ELSD-detector. Deze detector beschikt over een kenmerkende versterkingsmodus - de 'brede' modus - die gelijktijdige analyse van zowel hoge concentratie als sporencomponenten mogelijk maakt, waardoor de gevoeligheid wordt verbeterd en het lineaire bereik wordt vergroot.

Dit artikel maakt gebruik van een HPLC-systeem in combinatie met ELSD, waardoor een efficiënte scheiding en kwantitatieve analyse van de vier componenten van LNP wordt bereikt door optimalisatie van chromatografische kolommen, gradiënt-elutie van mobiele fasen en andere omstandigheden13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van het instrument

  1. Instrument instellen
    1. Zet een HPLC-systeem op in combinatie met een ELSD.
  2. Kolom installatie
    1. Installeer de chromatografische kolom (C4-300; 150 mm × 4,6 mm binnendiameter, 5 μm), in de richting van de pijl op de kolom, met het ene uiteinde aangesloten op de uitlaat van de autosampler en het andere op de ELSD-inlaat.
  3. Voorbereiding van mobiele fasen
    1. Bereid de mobiele fasen voor: fase A, een 10 mM TEAA waterige oplossing (pH = 7,0), en B-fase, een 10 mM TEAA methanoloplossing (pH = 7,0).
    2. Om de A-fase voor te bereiden, weegt u nauwkeurig 1,01 g triethylamine af, lost u het op in 1000 ml water, mengt u goed en stelt u de pH in op 7,0 met azijnzuur.
    3. Los voor de B-fase 1,01 g triethylamine op in 1000 ml methanol, meng en pas de pH aan op 7,0 met azijnzuur.
  4. Methode bewerken
    1. Zet de aan/uit-schakelaars voor elke module van de LC-ELSD aan en start de LabSolutions-software . Open vervolgens het venster Realtime analyse .
    2. Klik op Bestand en selecteer Nieuw om een nieuw methodebestand te maken. Wijzig de LC-stoptijd in de methode in 15 en klik op Toepassen op alle acquisitietijd.
    3. Klik vervolgens op Pomp om de pompparameters te wijzigen. Selecteer de analysemodus als Binaire hogedrukgradiënt (B.GE) en stel het debiet in op 1,0 ml/min.
    4. Stel vervolgens de initiële pompconcentratie B (%B) in op 80% en wijzig de mobiele fasegradiënt: bij 3 minuten is %B 80%, bij 4 minuten is %B 85% van 5,5 min tot 12 min, %B is 100%, bij 12,1 min keert %B terug naar 80%.
    5. Klik vervolgens op Kolom Oven en stel de oventemperatuur in op 55 °C. Klik ten slotte op ELSD om de temperatuur van de drijfbuis te wijzigen naar 40 °C. Sla de methode op.
      OPMERKING: De samenvatting van de parameters wordt weergegeven in tabel 1.
  5. Start en breng het instrument in evenwicht.
    1. Klik op Downloaden en opstarten om het instrument te starten en in evenwicht te brengen.

2. Bereiding van standaardoplossingen en monsters

  1. Voorbereiding van standaardoplossingen
    1. Weeg nauwkeurig 10,0 mg van de vier LNP-componenten standaardstoffen afzonderlijk, los op in 1 ml methanol en draai tot het volledig is opgelost om voorraadoplossingen te verkrijgen met een concentratie van 10 mg/ml voor elk bestanddeel.
    2. Breng met behulp van een pipet nauwkeurig 100 μl van elk van de vier voorraadoplossingen over in een monsterflesje en voeg vervolgens 600 μl methanol toe. Meng grondig tot een gemengde tussenoplossing 1 met een concentratie van 1000 μg/ml.
    3. Breng nauwkeurig 20 μL van elk van de vier voorraadoplossingen over in een monsterflesje en voeg vervolgens 920 μL methanol toe. Meng grondig tot een gemengde tussenoplossing 2 met een concentratie van 200 μg/ml.
    4. Bereid vervolgens een reeks standaardoplossingen in concentraties van 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml en 250 μg/ml door seriële verdunning volgens tabel 2.
  2. Voorbereiding van monsters
    1. Breng met behulp van een pipet nauwkeurig 100 μL van het monster over in een monsterflesje, voeg vervolgens 900 μL methanol toe en meng goed. Zorg er nu voor dat de LNP-concentratie in het monster 10-voudig is verdund en dat de LNP wordt gedissocieerd van het nucleïnezuurgeneesmiddel.

3. Gegevensverzameling

  1. Plaats de standaardoplossingen en monsteroplossingen in de autosampler van de vloeistofchromatograaf.
  2. Klik op Realtime batch in de assistent-werkbalk van het venster Realtime analyse . Klik vervolgens op Nieuw in het menu Bestand om een nieuwe batchtabel te maken.
  3. Voer in de batchtabel de injectieflacon#, de naam van de tray, het gegevensbestand en het injectievolume van de standaard- en monsteroplossingen in en selecteer het methodebestand dat in stap 1.4 is opgeslagen. Klik op Batchbestand opslaan in het menu Bestand om het batchbestand op te slaan.
  4. Wacht tot de vloeistofchromatograafdruk en de basislijn van het chromatogram stabiel zijn. Klik vervolgens op Start Realtime Batch in de werkbalk van de assistent om de gegevensverzameling te starten.

4. Gegevensanalyse

  1. Kalibratiecurves vaststellen
    1. Open het browservenster van de LabSolutions-software en sleep de standaardoplossingsgegevens naar de weergave Kwantitatieve resultaten om een kalibratiecurve vast te stellen. Wijzig vervolgens de parameters voor gegevensverwerking. Klik op Bewerken in de weergave Methode.
    2. Wijzig in het venster Integratieparameters de hellingswaarde in 10000. Wijzig vervolgens in de identificatieparameters de identificatiemethode in Band en stel de standaardbandbreedte in op 0.1 min.
    3. Wijzig daarna de kwantitatieve parameters. Wijzig de kwantitatieve methode in externe standaard en stel de # van het kalibratieniveau in op 7. Selecteer het type kalibratiecurve als Exponentieel. Wijzig vervolgens de Compound.
    4. Voer de namen en standaardoplossingsconcentraties van de vier LNP-componenten in. Dubbelklik op de piektop om de retentietijden bij te werken. Klik ten slotte op Bekijken om de wijziging van de gegevensverwerkingsparameters te voltooien.
    5. Wijzig het steekproeftype in de weergave Kwantitatieve resultaten in Standaard (berekeningspunt). Stel volgens de concentraties de niveaus van de standaardoplossing in op 1-7. Zodra de kalibratiecurven zijn vastgesteld, klikt u op Bestand in de menubalk en slaat u het methodebestand op.
  2. Kwantitatieve analyse van monsters
    1. Sleep de gegevens van monsters naar de weergave Kwantitatieve resultaten van het browservenster, waarin de concentratieresultaten van de vier LNP-componenten in de monsters worden weergegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De analyse van de LNP-standaardoplossing met behulp van deze methode bereikte een scheidingsgraad van meer dan 1,5 voor de vier componenten, waardoor een basislijnscheiding werd gerealiseerd. Bovendien werden er geen residuen waargenomen in standaardoplossingen met een hoge concentratie, zoals weergegeven in figuur 1. Er werd een kalibratiecurve vastgesteld binnen een concentratiebereik van 5 tot 250 μg/ml, met correlatiecoëfficiënten van meer dan 0,999, wat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle vier de componenten van LNP vertonen een relatief zwakke polariteit. Wanneer ze worden geanalyseerd met behulp van een C18-kolom, vertonen de doelverbindingen een sterke retentie in de kolom, wat leidt tot de verbreding van de fosfolipidenpiek voor sterk vastgehouden componenten. Bovendien hopen zich na analyse van oplossingen met een hoge concentratie residuen op aan de kop van de C18-kolom, wat de nauwkeurigheid van de kwantificering in gevaar kan brengen. Het chromatogram is weer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dank aan biofarmaceutische bedrijven voor het leveren van de LNP-monsters voor het experiment, en dank aan Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd voor het leveren van de chromatografiekolom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BalansShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdAP135W
KolomShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO.,LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO.,LTD
LCShimadzu (China) CO.,LTDLC40D XR
MethanolANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipet-100 µLShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,Ltd00-NAR-100
Pipet-1000 µLShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Ultrapuur watersysteemMilliporeZIQ7000T0C
VortexmixerANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lipidenanodeeltjesanalyse van LNP componentengradi nteluutiebasislijnscheidinghogedrukvloeistofchromatografiekalibratiecurveexterne standaardmethode

Gerelateerde artikelen