Methodenartikel

Visualisatie van methaan-cyclische microbiële dynamiek in wetlands aan de kust

DOI:

10.3791/67715

⸱

31 januari 2025

 ,  ,  , 
1School of Earth, Environmental and Marine Sciences, University of Texas - Rio Grande Valley

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol detecteert belangrijke methaancyclusgenen in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas en visualiseert hun ruimtelijke verdeling om het begrip van methaanregulatie en de milieueffecten ervan in deze dynamische ecosystemen te vergroten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wetlands aan de kust zijn de grootste biotische bron van methaan, waar methanogenen organisch materiaal omzetten in methaan en methanotrofen methaan oxideren, en zo een cruciale rol spelen bij het reguleren van de methaancyclus. De wetlands in Zuid-Texas, die onderhevig zijn aan frequente weersomstandigheden, fluctuerende zoutgehaltes en antropogene activiteiten als gevolg van klimaatverandering, beïnvloeden de methaancyclus. Ondanks het ecologische belang van deze processen, blijft de methaancyclus in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas onvoldoende onderzocht. Om deze kloof te dichten, hebben we een methode ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het detecteren van genen die verband houden met methanogenen en methanotrofen, waaronder mcrA als biomarker voor methanogenen en pmoA1, pmoA2 en mmoX als biomarkers voor methanotrofen. Bovendien was deze studie gericht op het visualiseren van de ruimtelijke en temporele distributiepatronen van de overvloed aan methanogeen en methanotrofe met behulp van de geografische informatiesysteem (GIS) -software ArcGIS Pro. De integratie van deze moleculaire technieken met geavanceerde geospatiale visualisatie leverde kritische inzichten op in de ruimtelijke en temporele verdeling van methanogene en methanotrofe gemeenschappen in de wetlands van Zuid-Texas. De methodologie die in deze studie is vastgesteld, biedt dus een robuust kader voor het in kaart brengen van microbiële dynamiek in wetlands, het vergroten van ons begrip van methaancycli onder verschillende omgevingsomstandigheden en het ondersteunen van bredere ecologische en milieuveranderingsstudies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wetlands aan de kust zijn vitale ecosystemen die bijdragen aan klimaatregulering, behoud van biodiversiteit en waterbeheer door middel van processen zoals koolstofvastlegging, evapotranspiratie en methaanemissies (CH4)1. Deze ecosystemen, waaronder zowel zoetwater- als zoutwatermoerassen2, zijn zeer productief en fungeren als kritieke zones voor de opname van koolstofdioxide (CO2 ) en vangen organisch materiaal op uit terrestrische en mariene milieus 3,4. De dynamische interacties binnen deze wetlands stimuleren de microbiële productie en consumptie van CH4 6, waardoor ze worden gepositioneerd als een van de grootste natuurlijke bronnen van CH46. Als het op één na belangrijkste broeikasgas heeft CH4 een aardopwarmingsvermogen dat ongeveer 27-30x groter is dan dat van CO2 4,7,8,9, waardoor de studie van CH4-emissies van wetlands aan de kust essentieel is in het tijdperk van klimaatverandering. De emissie van CH4 wordt beïnvloed door verschillende omgevingsfactoren, met name het zoutgehalte, die een cruciale rol spelen in microbiële processen10. Zoetwatermoerassen dragen aanzienlijk bij aan atmosferisch methaan vanwege hun lagere sulfaatgehalten, wat een grotere microbiële CH4-productie mogelijk maakt, terwijl zoutwaterwetlands over het algemeen de neiging hebben om minder CH4 uit te stoten vanwege hogere sulfaatconcentraties 11,12,13.

CH4-emissies van wetlands aan de kust worden over het algemeen gecontroleerd door twee groepen micro-organismen, bekend als methanogenen en methanotrofen14. Methanogenen produceren CH4 in anoxische sedimenten door substraten zoals formiaat, acetaat, waterstof of gemethyleerde verbindingen af te breken via een proces dat bekend staat als methanogenese15. Het belangrijke enzym in deze route is methyl-co-enzym M-reductase (MCR), omdat het de laatste en snelheidsbeperkende stap van methanogenese katalyseert 15,16,17. Het mcrA-gen, dat codeert voor de alfa-subeenheid van MCR, is een functionele marker die in alle methanogene archaea kan worden aangetroffen18. Bovendien vormt zich in wetlands aan de kust de sulfaat-methaanovergangszone (SMTZ) boven de methanogene zone, waar methaan dat naar boven diffuus is en sulfaat dat naar beneden beweegt, samenkomen en uitgeput zijn19. Binnen deze zone oxideren anaërobe methanotrofe archaea (ANME) methaan tot koolstofdioxide met behulp van het MCR-enzym, terwijl sulfaatreducerende bacteriën (SRB) sulfaat tot sulfide reduceren. SRB overtreft methanogenen voor waterstof en acetaat en beperkt de methaanproductie totdat het sulfaat is uitgeput 16,17.

Daarentegen oxideren aërobe methanotrofe bacteriën CH4 in aërobe omgevingen20, waarbij gebruik wordt gemaakt van verschillende vormen van methaanmonooxygenase (MMO). Deze omvatten methaanmonooxygenase (pMMO), een koperhoudend enzym dat is ingebed in het intracytoplasmatische membraan, en oplosbaar methaanmonooxygenase (sMMO), een ijzerhoudend enzym dat in het cytoplasma wordt aangetroffen. Voor pMMO zijn er echter drie genoperonen: pmoCAB21; onder hen is het pmoA-gen het meest conservatief voor alle methanotrofen. Er zijn twee verschillende biomarkergenen voor pmoA: pmoA1 en pmoA222. Bovendien wordt het mmoX-gen voor een uitgebreid begrip van methanotrofen gebruikt als hulpmiddel in de moleculaire biologie om sMMO-bevattende methanotrofen23 te identificeren. Dit onderscheid in metabole routes en milieuvereisten van methanogenen en aërobe methanotrofen benadrukt de complexe microbiële interacties die de methaancyclus in wetland-ecosystemen aan de kust reguleren.

Het wetland van Boca Chica (BC), een productieve zoutwateromgeving in Zuid-Texas, ervaart getijdeninvloeden van de Golf van Mexico (GOM), wat leidt tot variabele zoutgehaltes aan het oppervlak, vooral vanwege de nabijheid van de hypersaline Laguna Madre24. Deze getijdenwerking, afwisselend bij eb en vloed, zorgt ervoor dat het zuurstofgehalte fluctueert25 wat de methanogene en methanotrofe activiteit in sedimenten zou kunnen veranderen26. Daarentegen worden zoetwatermoerassen aan de kust beschouwd als een belangrijke hotspot voor CH4-fluxen 27. De zoetwatermoerassen aan de kust in Zuid-Texas, waaronder Resaca Del Rancho Viejo (RV) en Lozano Banco (LB), ver weg van de getijdeneffecten van de GOM, hebben een duidelijk hydrologisch beheer. RV ervaart pulsstromen aangevuld met rivierwater tijdens lage waterstanden, terwijl LB werkt als een offline stroomsysteem zonder een dergelijke suppletie. Bovendien behouden RV en LB een lager zoutgehalte als gevolg van een hoge afvoer van kunstmatig opgepompt zoet water en omdat het respectievelijk een oxbow-meer is. De verschillende omgevingsfactoren kunnen de methaancyclus in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas aanzienlijk beïnvloeden. De methaancyclus in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas blijft echter een gebied dat nog grondig moet worden onderzocht.

Polymerasekettingreactie (PCR) en real-time PCR (ook wel kwantitatieve PCR [qPCR] genoemd) vertegenwoordigen fundamentele en veelgebruikte technieken voor het detecteren en kwantificeren van de relatieve overvloed van specifieke genen in milieumonsters. Deze technieken versterken specifiek gerichte DNA-gebieden om de aanwezigheid en relatieve hoeveelheid van CH 4-cyclusgerelateerde genen aan te geven, wat indicatoren oplevert voor mogelijke methaancycli. Desalniettemin kunnen de beschikbaarheid en werkzaamheid van PCR-primersets worden beperkt door verschillende remmende factoren in het geëxtraheerde omgevings-DNA, die worden beïnvloed door de soorten omgevingen28,29. Deze studie heeft dus voornamelijk een optimale PCR-methode vastgesteld voor het detecteren van de aanwezigheid van CH4-cyclusgerelateerde genen in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas (Figuur 1) en vervolgens hun gekwantificeerde relatieve abundantie in deze ecosystemen gevisualiseerd. De resultaten van deze studie kunnen worden toegepast op andere kustregio's om het begrip van CH4-cycli en microbiële dynamiek in diverse kustecosystemen te vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Afname van monsters

  1. Verzamel sedimentmonsters met behulp van een sedimentgrijper, monsternemer of schop.
    OPMERKING: Monsters werden verzameld uit twee stations van drie verschillende wetlands aan de kust tijdens koele (oktober-februari, de gemiddelde temperatuur is 20 °C) en warme (april-juni, gemiddelde temperatuur is 27 °C) seizoenen van 2023 en 2024. Een monsternemer voor het grijpen van sediment werd gebruikt bij het verzamelen van monsters uit zoetwatermoerassen aan de kust (Figuur 2) en een schop werd gebruikt voor door getijden beïnvloede zoutwatermoerassen aan de kust.
  2. Laat de monsternemer eerst in het ondiepe waterlichaam zakken en laat deze onder zijn eigen gewicht naar het sedimentoppervlak (binnen de bovenste 50 cm) zinken, zodat de sedimentstructuur zo min mogelijk wordt verstoord, zoals weergegeven in figuur 2.
  3. Trek het uit de waterkolom waar de diepte doorgaans 60 cm tot 215 cm30 was, breng de sedimentmonsters over in gripzakken en bewaar ze onmiddellijk in een ijskast.
    OPMERKING: Reinig en was de grijpermonsternemer met gedeïoniseerd (DI) water voordat u naar de volgende stations gaat.
  4. Bewaar alle monsters bij -20 °C direct in het laboratorium.
  5. Meet op elke bemonsteringslocatie parameters voor de oppervlaktewaterkwaliteit, zoals zoutgehalte en temperatuur ter plaatse , met behulp van een waterkwaliteitsmeter met meerdere parameters.
    OPMERKING: De sondes werden na gebruik in elk station gespoeld met gedeïoniseerd water (DI-water).

2. Genomische DNA-extractie

  1. Ontdooi de monsters bij kamertemperatuur voordat u begint met de procedure voor genomische DNA-extractie.
  2. Breng ongeveer 500 mg sedimentmonsters over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 4.250 × g om al het water te verwijderen.
  3. Extraheer genomisch DNA met behulp van een DNA-extractiekit voor aarde volgens protocol31 van de fabrikant met een kleine aanpassing en bewaar onmiddellijk bij -20 °C.
    OPMERKING: De wijzigingen zijn aangebracht om redundantie te verminderen en een efficiënte workflow te realiseren.
    1. Voeg tot 500 mg grondmonster toe aan een buis met glazen kralen/keramische bol.
    2. Voeg 978 μL natriumfosfaatbuffer toe aan het monster in de druppel/bol bevattende buis.
    3. Voeg 122 μL bufferlysisoplossing toe aan het monster in de kraal-/bol-bevattende buis om externe verontreinigingen op te lossen.
    4. Homogeniseer met behulp van een homogenisator van een parelmolen op 5x het snelheidsniveau gedurende 20 s en herhaal 2x.
      LET OP: In dit onderzoek is gebruik gemaakt van een parelmolenhomogenisator, daarom is het toerental aangepast.
    5. Centrifugeer het mengsel gedurende 10 minuten op 14.000 × g.
    6. Breng het bovenstaande over in een schone microcentrifugebuis van 2,0 ml.
    7. Voeg 250 μL eiwitprecipitatieoplossing (PPS) toe om de opgeloste nucleïnezuren te scheiden van het cellulair puin en de lysingmatrix. Meng door de tube 10x om te keren.
    8. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 14.000 × g om de pellet neer te slaan en de celresten en lysingmatrix te verwijderen.
    9. Breng het bovenstaande over in een schone microcentrifugebuis van 15 ml.
    10. Voeg 1,0 ml van de Binding Matrix-suspensie toe aan het bovenstaande in de tube van 15 ml.
      OPMERKING: Schud de Binding Matrix-suspensie om opnieuw te suspenderen voordat u deze toevoegt.
    11. Laat de binding van DNA aan de bindingsmatrix toe door de buisjes 2 minuten op een rotator te plaatsen.
    12. Plaats alle buizen op een rek en incubeer gedurende 3 minuten om de bindmatrix te laten bezinken.
    13. Gooi na 3 minuten 750 μL weg en meng voorzichtig het resterende bovenstaande met de pellet met behulp van een pipet.
    14. Breng 750 μL van het mengsel over in een SPIN-filter en centrifugeer op 14.000 × g gedurende 1 minuut. Leeg de vangbuis en hergebruik deze opnieuw. Herhaal met het resterende mengsel.
    15. Voeg 500 μL van de bereide wasoplossing toe (met de juiste hoeveelheid ethanol toegevoegd) om onzuiverheden verder op te lossen. Resuspendeer de pellet voorzichtig met behulp van de kracht van de vloeistof uit de pipetpunt.
    16. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14.000 × g om onzuiverheden te verwijderen. Leeg de vangbuis en hergebruik deze opnieuw.
    17. Centrifugeer opnieuw op 14.000 × g gedurende 2 minuten zonder iets toe te voegen.
    18. Vervang de vangbuis door een nieuwe, schone vangbuis en laat het SPIN-filter 5 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur.
    19. Voeg 50 μL DNAse-vrij water (DES) toe en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14.000 × g .
      OPMERKING: In dit protocol werd 50 μL DES gebruikt voor DNA-elutie om een optimaal herstel en stabiliteit van het geëxtraheerde omgevings-DNA (eDNA) te garanderen.

3. Kwantificering van DNA

  1. Voeg 1 μl geëxtraheerd DNA met 200 μl fluorescerende kleurstof toe in een tube van 0,5 ml en meng grondig door pipetteren.
  2. Wikkel de buis onmiddellijk in aluminiumfolie zodat het licht niet kan doordringen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Meet de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer in ÉÉN DNA-concentratiemodus volgens het protocol van de fabrikant.

4. Detectie van 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX en mcrA door conventionele PCR

  1. Voordat u conventionele PCR (cPCR) uitvoert, ontdooit u alle monsters en reagentia in een ijsemmer.
  2. Verdun alle geëxtraheerde eDNA-monsters tot 10 ng/μL.
    OPMERKING: Een lijst van primers wordt gegeven in Tabel 1.
  3. Bereid een cPCR-reactiemengsel van 25 μl voor elk monster, inclusief 12.5 μl 2x PCR Master-mix, 0.5 μl voorwaartse en achterwaartse primers (10 μM) (zie tabel 1 voor de primerlijst), 1 μl 10 ng/μl eDNA en 10.5 μl nucleasevrij water.
    OPMERKING: Bereid de mastermix voor met voldoende volume voor één extra monster om pipetteerfouten te minimaliseren.
  4. Voer een cPCR-reactie uit volgens het protocol dat bestaat uit een eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 45 s, verlenging bij 72 °C gedurende 30 s en laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 m, met variërende gloeitemperatuur voor verschillende primers (zie tabel 1 voor gloeitemperaturen van verschillende primers die voor verschillende genen worden gebruikt).
    OPMERKING: Voor het mcrA-gen toonden ML-primers de gewenste band met een langzame hellingssnelheid van 0,1 °C/s tussen de gloei- en verlengingsstappen gedurende de eerste vijf cycli32.
  5. Visualiseer cPCR-producten in een agarosegel die is voorgekleurd met ethidiumbromide (EtBr).
    OPMERKING: Gebruik 2,5% agarosegel voor een ladder van 50 bp en 0,9% gel voor een ladder van 1 kb. Gebruik 1x TAE-buffer voor een 2,5% agarosegel en 0,5x TAE-buffer voor een 0,9% agarosegel.

5. Detectie van pmoA1 , pmoA2 , mmoX en mcrA door kwantitatieve real-time PCR

OPMERKING: Methanogene en methanotrofe gerichte genen zoals pmoA1, pmoA2, mmoX en mcrA-overvloed werden waargenomen door qPCR met behulp van een real-time PCR-systeem.

  1. Bereid de standaarden voor elk gen afzonderlijk voor om de standaardcurve voor elk gen te verkrijgen.
    1. Amplificeer het beoogde gen met cPCR, met behulp van de monsters die de helderste band hebben geproduceerd tijdens de gelelektroforese van elk gen. Volg de methode en primers beschreven in sectie 4.
    2. Zuiver de geamplificeerde producten met behulp van een gelextractiekit en meet de DNA-concentratie volgens de in rubriek 3 beschreven methode en bewaar ze bij -20 °C.
      OPMERKING: Verdeel de gezuiverde standaarden in afzonderlijke buizen voor verder gebruik.
    3. Bereken genkopieën op basis van de gemeten DNA-concentratie met behulp van de website voor het berekenen van het aantal kopieën voor qPCR.
    4. Verdun het berekende kopienummer van de standaard met nucleasevrij water om elke standaard te bereiden, variërend van 108 tot 102 kopieën/μL, voordat de qPCR wordt uitgevoerd.
    5. Bereid de standaardcurve voor met behulp van drie replicaten van elk kopienummer, inclusief een negatieve controle (NTC, geen sjabloon-DNA).
      OPMERKING: De R2-waarde van elke standaardcurve was groter dan 0,99.
  2. Bereid een qPCR-reactiemengsel van 20 μl voor alle monsters, standaarden en NTC. Voer de qPCR-analyse uit in drievoud voor alle monsters.
    1. Plaats alle reactiecomponenten, inclusief qPCR-mastermix, primers, nucleasevrij water, standaarden en monsters, op een ijsrek voordat u begint.
    2. Bereid een qPCR-reactiemengsel van 20 μl voor elk monster, standaard en NTC, met 10 μl SYBR Green-mastermix, 0.5 μl van elke 10 μM voorwaartse en achterwaartse primers, 8 μl nucleasevrij water en 1 μl van respectievelijk 10 ng/μl sjabloon-DNA, standaard of DI-water.
      OPMERKING: Gebruik de getoonde primersets om optimale resultaten te verkrijgen voor pmoA1 - en mcrA-genen in conventionele PCR voor qPCR (zie tabel 1). Om de nauwkeurigheid te verbeteren, voert u elke steekproef in drievoud uit. De volgende stappen bieden een efficiënte methode voor het bereiden van drievoudsmonsters met een gecombineerd volume van 60 μL per monster.
      1. Bereid het reactiemengsel voor om het mastermengsel, voorwaartse en achterwaartse primers voor het specifieke gen en nucleasevrij water te combineren in een buis van 2 ml, behalve het sjabloon-DNA.
        OPMERKING: Bereid het volume van het reactiemengsel voor, rekening houdend met een pipetteerfout. Als er bijvoorbeeld 24 monsters en 8 standaarden zijn, bereken dan het totale volume voor 33 reacties in plaats van 32 reacties om pipetteerfouten te minimaliseren. In dit geval zou het totale volume dat nodig is voor drievoudige reacties als volgt zijn: 990 μL mastermix (33 monsters x 3 replicaten x 10 μL), 49,5 μL voorwaartse primers (33 monsters x 3 replicaten x 0,5 μL), 49,5 μL omgekeerde primers (33 monsters x 3 replicaten x 0,5 μL) en 792 μL nucleasevrij water (33 monsters x 3 replicaten x 8 μL).
      2. Bereid PCR-buisjes voor op basis van het aantal monsters en de normen.
      3. Doseer 57 μl van het bereide reactiemengsel in elk PCR-buisje.
        OPMERKING: Om qPCR uit te voeren voor elk monster in drievoud, bereidt u een totaal reactiemengselvolume van 57 μL per monster voor (exclusief sjabloon-DNA, standaard of water). Dit volume wordt gelijkelijk verdeeld in drie putjes voor één monster, waarbij 19 μL aan elke put wordt toegewezen.
      4. Voeg 3 μL sjabloon-DNA-, standaard- of nucleasevrij water toe aan elke buis en meng door zachtjes op de bodem van de buis te tikken.
        OPMERKING: Het totale volume van het reactiemengsel dat voor één monster wordt bereid, zou nu 60 μL in elke buis zijn.
    3. 20 μl van het bereide reactiemengsel uit elke buis in de daarvoor bestemde putjes van een qPCR-plaat met 96 putjes. Sluit de PCR-plaat af met zelfklevende PCR-afdichtingsfilm met behulp van een applicator.
    4. Centrifugeer de verzegelde plaat gedurende 1 minuut bij 1.000 × g om een goede menging te garanderen en eventuele luchtbellen in de putjes te verwijderen.
  3. Plaats de PCR-plaat in de thermische cycler. Schakel de qPCR-machine in en open vervolgens de bijbehorende software om het protocol in te stellen.
    1. Stel het protocol in volgens de qPCR master mix richtlijnen. Gebruik het volgende protocol: 95 °C gedurende 10 min, gevolgd door 95 °C gedurende 15 s en een verlengstap bij 72 °C gedurende 30 s. Voer de gloeistap uit bij de gloeitemperatuur die in tabel 1 voor de relevante primers is gespecificeerd gedurende 45 s. Voer alle qPCR-runs uit gedurende 35 cycli.
    2. Stel de qPCR-plaat met 96 putjes in met standaarden en NTC's in dezelfde configuratie als de monsterbevattende plaat.
  4. Gebruik de standaardcurvemethode voor absolute kwantificering om het geamplificeerde product en het nummer van de genkopie in elk monster te kwantificeren33.

6. Visualisatie van methaan-cyclische genen op de kaart van de wetlands aan de kust van Zuid-Texas

  1. Open geografische informatiesysteem (GIS) software ArcGIS Pro en sla het projectbestand met de naam Study Area op in de daarvoor bestemde map op de computer.
  2. Klik op Kaart linksboven | Basiskaart en selecteer Terrein met labels als basiskaart.
  3. Klik op Lokaliseren | Zoek en wanneer de zoekbalk wordt geopend, zoekt u het studiegebied door de naam van het gebied te typen; Het gebied zal verschijnen.
  4. Teken het specifieke gebied met behulp van georefereren.
    1. Klik op Beeld | Catalogusvenster vanaf de bovenste laag.
    2. Dubbelklik op Map uit de catalogus | Bestandsnaam.
    3. Klik met de rechtermuisknop op het bestand van de geodatabase (.gdb) en klik vervolgens op Nieuw | Functieklasse en Functieklasse maken worden weergegeven.
    4. Typ het vak Naam en alias en klik onderaan op Voltooien .
    5. Klik op Beeld | Inhoud. De naam van de alias wordt weergegeven in het inhoudsvenster.
    6. Klik op Bewerken van de bovenste laag | Creëren. Het deelvenster Functies maken wordt geopend. Dubbelklik op de alias in het deelvenster Functies maken en de feedbackopties voor hulpprogramma's configureren worden weergegeven.
    7. Selecteer Lijnen en schets vervolgens lijnen op de kaart om een buitengrens van het studiegebied te maken. Dubbelklik op de kaart als u klaar bent.
  5. Minimaliseer GIS-software en open vervolgens een spreadsheet. Typ de voorbeeldnaam in de eerste kolom, voer de breedtegraad in de tweede kolom en de lengtegraad in de derde kolom in. Gebruik de volgende vier kolommen voor de qPCR-gegevens van pmoA1, pmoA2, mmoX en mcrA.
  6. Sla het bestand op in CSV-indeling in een specifieke map van de computer.
  7. Open de GIS-software opnieuw en klik op Gegevens toevoegen | XY-puntgegevens.
  8. Selecteer het CSV-bestand in de map op de computer in het vak Invoertabel . Wijzig de naam van het bestand in de Output Feature Class en klik vervolgens op Uitvoeren om de steekproefpunten op de kaart weer te geven.
  9. Klik bovenaan op de zoekbalk en zoek op Kriging.
  10. Selecteer het bestand van het bemonsteringsstation en selecteer vervolgens pmoA1.
  11. Klik op de knop Omgeving | selecteer het bemonsteringsstation in laag en masker | klik op Uitvoeren.
  12. Volg de protocollen die worden genoemd in stap 6.9, 6.10 en 6.11 om Kriging te maken voor pmoA2, mmoX en mcrA voor het hele studiegebied.
  13. Maak een lay-out van de kaart.
    1. Klik op Invoegen vanuit de bovenste laag | Nieuwe lay-out en selecteer ANSI - Liggend.
    2. Klik op Map Frame, selecteer de kaart met de Kriging, en plaats alle kaarten in de lay-out door een rechthoek te tekenen. Hierdoor wordt de kaart zichtbaar in de lay-out.
    3. Selecteer de noordpijl en plaats deze in de lay-out om de noordrichting aan te geven.
    4. Selecteer Schaalbalk om de schaal van het gebied op de kaart weer te geven.
    5. Klik op Legenda om de legenda's weer te geven en plaats deze vervolgens in de lay-out.
    6. Klik op Raster en selecteer een van de opties voor zwarte graticule. Hiermee wordt het raster met lengte- en breedtegraad gemaakt en wordt dit weergegeven in het inhoudsvenster met het label Black Horizontal Label Graticule.
    7. Dubbelklik op Black Horizontal Label Graticule en selecteer vervolgens Componenten. Klik op Ticks 1 en Grid en verwijder deze componenten door op het kruisteken rechts ervan te klikken.
  14. Klik op Delen in de bovenste laag en klik vervolgens op Lay-out exporteren. Selecteer het bestandstype als PDF, sla het bestand op de computer op met behulp van het naamvak, stel de verticale resolutie in op 500 DPI en klik op Exporteren om het PDF-bestand van de kaart te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de distributie en overvloed van CH4-cyclusgerelateerde genen (mcrA, pmoA1, pmoA2 en mmoX) in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas te begrijpen, werd het geëxtraheerde eDNA van elk monster geanalyseerd met cPCR en qPCR. Universele primers voor elke biomarker werden geselecteerd om cPCR uit eerdere studies uit te voeren (Tabel 1)22,34,35,36,37, en er werden wijzigingen aangebracht om de gloeitemper...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wetlands aan de kust worden erkend als belangrijke bijdragers aan atmosferisch methaan, een belangrijk broeikasgas40. Hoewel er studies zijn gedaan naar methaanflux en methanogenen in wetlands 41,42,43, is er weinig bekend over hoe methanotrofen werken in verschillende omgevingen of onder verschillende beheerpraktijken, vooral in wetlands met fluctuerende waterstanden44.<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn de leden van C-REAL dankbaar voor hun hulp bij veldobservatie en laboratoriumanalyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL PCR tubesThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR TubesPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 10μL; | Fisher Scientific
15 mL centrifuge tubeThermoFisher Scientific14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL tipsThermoFisher Scientific05-408-190Fisherbrand SureGrip Pipet Tip Racked or Reload System Tips Natural; 200μL; | Fisher Scientific
1000 μL tipsThermoFisher Scientific02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kUsQ9Lu0YIq5i4vWege
17qPdtxIYZyvmJH1cDo
ARuwereO1V4GLz9UaA
lDREALw_wcB&ef_id=C
j0KCQiApNW6BhD5ARI
sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i
4vWege17qPdtxIYZyvmJ
H1cDoARuwereO1V4GLz
9UaAlDREALw_wcB:G:s
&ppc_id=PLA_goog_2175
7693617_171052169911_02
707402__715434303113_1555
377385658230343&ev_chn=sh
op&s_kwcid=AL!4428!3!71543430
3113!!!g!2366517300713!&gad_source=1
Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher Scientific4368577https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro esrihttps://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4
JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5
vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
CFX Duet Real-Time PCR system Bio-Rad12016265https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus single channel pipettor
volume 0.5-10 μL		Sigma-AldrichCLS4071-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 100-1000 μLSigma-AldrichCLS4075-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
Corning Lambda plus single channel pipettor volume 20-200 μLSigma-AldrichCLS4074-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
FastDNA spin kit for soilMP Biomedical116560200-CFhttps://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR
ajegGTr9MoX1oMZUh
3dcbJqe0UvvukY128
Gene copy  calculatorScience Primerhttps://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
High speed benchtop centrifugeThermoFisher Scientific75004241https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?gad_source=1&gclid=Cj0KCQiApN
W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j
20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN
OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv
enEALw_wcB
High speed microcentrifugeVWR75838-336https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Lysing Matrix E tube glass bead/ceramic sphere-containing tube
Microcentrifuge tubeThermoFisher Scientific02-681-320https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACm
EbkWbG4_o3oUiGk
HJPU-_31-CuexDwQ
fmWPnfyhBOf2BHXsy
K3fFW1toaAgJbEALw_
wcB&ef_id=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kWbG4_o3oUiGkHJPU-
_31-CuexDwQfmWPnfy
hBOf2BHXsyK3fFW1toa
AgJbEALw_wcB:G:s&ppc
_id=PLA_goog_21757693
617_171052169911_0268
1320__715434303113_10
349826094968484711&ev

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, T., et al. Wetlands of international importance: Status, threats, and future protection. Int J Environ Res Public Health. 16 (10), 1818(2019).
  2. Corn, M. L. Deepwater Horizon oil spill: coastal wetland and wildlife impacts and response. , DIANE Publishing. (2010).
  3. Hendriks, I. E., Sintes, T., Bouma, T. J., Duarte, C. M. Experimental assessment and modeling evaluation of the effects of the seagrass Posidonia oceanica on flow and particle trapping. Marine Ecology Progress Series. 356, 163-173 (2008).
  4. Krause, S. J. E., Treude, T. Deciphering cryptic methane cycling: Coupling of methylotrophic methanogenesis and anaerobic oxidation of methane in hypersaline coastal wetland sediment. Geochimica et Cosmochimica Acta. 302, 160-174 (2021).
  5. Reddy, K. R., DeLaune, R. D., Inglett, P. W. Biogeochemistry of Wetlands: Science and Applications. , 2nd ed, CRC Press. (2022).
  6. La, W., et al. Sulfate concentrations affect sulfate reduction pathways and methane consumption in coastal wetlands. Water Research. 217, 118441(2022).
  7. Derwent, R. G. Global warming potential (GWP) for methane: Monte Carlo analysis of the uncertainties in Global Tropospheric Model predictions. Atmosphere. 11 (5), 486(2020).
  8. Potter, C., et al. Methane emissions from natural wetlands in the United States: Satellite-derived estimation based on ecosystem carbon cycling. Earth Interactions. 10 (22), 1-12 (2006).
  9. Understanding global warming potentials. , U.S. Environmental Protection Agency. https://www.epa.gov/ghgemissions/understanding-global-warming-potentials (2024).
  10. Wallenius, A. J., Dalcin Martins, P., Slomp, C. P., Jetten, M. S. M. Anthropogenic and environmental constraints on the microbial methane cycle in coastal sediments. Front Microbiol. 12, 631621(2021).
  11. Qu, Y., et al. Salinity causes differences in stratigraphic methane sources and sinks. Environmental Science and Ecotechnology. 19, 100334(2024).
  12. Vizza, C., West, W. E., Jones, S. E., Hart, J. A., Lamberti, G. A. Regulators of coastal wetland methane production and responses to simulated global change. Biogeosciences. 14 (2), 431-446 (2017).
  13. van Dijk, G., et al. Salinization lowers nutrient availability in formerly brackish freshwater wetlands; unexpected results from a long-term field experiment. Biogeochemistry. 143 (1), 67-83 (2019).
  14. Aronson, E., Allison, S., Helliker, B. R. Environmental impacts on the diversity of methane-cycling microbes and their resultant function. Front Microbiol. 4, 225(2013).
  15. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  16. Thauer, R. K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology (Reading). 144 (Pt 9), 2377-2406 (1998).
  17. Thauer, R. K. Anaerobic oxidation of methane with sulfate: on the reversibility of the reactions that are catalyzed by enzymes also involved in methanogenesis from CO2. Curr Opin Microbiol. 14 (3), 292-299 (2011).
  18. Friedrich, M. W. Methyl-coenzyme M reductase genes: Unique functional markers for methanogenic and anaerobic methane-oxidizing Archaea. Methods in Enzymology. 397, 428-442 (2005).
  19. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  20. Rasigraf, O., Schmitt, J., Jetten, M. S. M., Lüke, C. Metagenomic potential for and diversity of N-cycle driving microorganisms in the Bothnian Sea sediment. Microbiologyopen. 6 (4), e00475(2017).
  21. McDonald, I. R., Bodrossy, L., Chen, Y., Murrell, J. C. Molecular ecology techniques for the study of aerobic methanotrophs. Appl Environ Microbiol. 74 (5), 1305-1315 (2008).
  22. Tchawa Yimga, M., Dunfield, P. F., Ricke, P., Heyer, J., Liesack, W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl Environ Microbiol. 69 (9), 5593-5602 (2003).
  23. Knief, C. Diversity and habitat preferences of cultivated and uncultivated aerobic methanotrophic bacteria evaluated based on pmoA as molecular marker. Front Microbiol. 6, 1346(2015).
  24. Huang, I. -S., et al. Preliminary assessment of microbial community structure of Wind-Tidal Flats in the Laguna Madre, Texas, USA. Biology. 9 (8), 183(2020).
  25. Wilding, T. K., Brown, E., Collier, K. J. Identifying dissolved oxygen variability and stress in tidal freshwater streams of northern New Zealand. Environ Monit Assess. 184 (10), 6045-6060 (2012).
  26. Roy Chowdhury, T., Mitsch, W. J., Dick, R. P. Seasonal methanotrophy across a hydrological gradient in a freshwater wetland. Ecological Engineering. 72, 116-124 (2014).
  27. Sun, Q. -Q., et al. Carbon dioxide and methane fluxes: Seasonal dynamics from inland riparian ecosystems, northeast China. Sci Total Environ. 465, 48-55 (2013).
  28. Lee, S., et al. Comparison and selection of conventional PCR primer sets for studies associated with nitrogen cycle microorganisms in surface soil. Appl Sci. 12 (20), 10314(2022).
  29. Bae, K. -S., et al. Development of diagnostic systems for wide range and highly sensitive detection of two waterborne hepatitis viruses from groundwater using the conventional reverse transcription nested PCR assay. J Virol Methods. 299, 114344(2022).
  30. Lecusay, D. Jr Assessment and Monitoring of Deltaic Wetlands and Fluvial Systems: Refining and Validating a Multimetric Index of Resaca Ecosystem Health. , The University of Texas Rio Grande Valley. (2021).
  31. FastDNA SPIN Kit for Soil (Cat No. 116560200). , MP Biomedicals. https://www.mpbio.com/media/productattachment/LS082019-EN-FastDNA-SPIN-Kit-for-Soil-116560200-Manual.pdf (2025).
  32. Luton, P. E., Wayne, J. M., Sharp, R. J., Riley, P. W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill. Microbiology (Reading, England). 148 (Pt 11), 3521-3530 (2002).
  33. Changsoo, L., Jaai, K., Seung Gu, S., Seokhwan, H. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol. 123 (3), 273-280 (2006).
  34. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environ Sci Technol. 37 (2), 343-351 (2003).
  35. Holmes, A. J., Costello, A., Lidstrom, M. E., Murrell, J. C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol Lett. 132 (3), 203-208 (1995).
  36. Fuse, H., et al. Oxidation of trichloroethylene and dimethyl sulfide by a marine Methylomicrobium strain containing soluble methane monooxygenase. Biosci Biotechnol Biochem. 62 (10), 1925-1931 (1998).
  37. Springer, E., Sachs, M. S., Woese, C. R., Boone, D. R. Partial gene sequences for the A subunit of methyl-coenzyme M reductase (mcrI) as a phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae. Int J Syst Bacteriol. 45 (3), 554-559 (1995).
  38. Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments. Appl Environ Microbiol. 65 (11), 5066-5074 (1999).
  39. Flores, E. A. Effects of Nutrient Enrichment on Mangrove and Saltmarsh Habitats. , The University of texas Rio Grande Valley. (2022).
  40. Minjie, H., Jordi, S., Xianyu, Y., Josep, P., Chuan, T. Patterns and environmental drivers of greenhouse gas fluxes in the coastal wetlands of China: A systematic review and synthesis. Environ Res. 186, 109576(2020).
  41. Bridgham, S. D., Cadillo-Quiroz, H., Keller, J. K., Zhuang, Q. Methane emissions from wetlands: biogeochemical, microbial, and modeling perspectives from local to global scales. Glob Chang Biol. 19 (5), 1325-1346 (2013).
  42. Liu, D. Y., Ding, W. X., Jia, Z. J., Cai, Z. C. Relation between methanogenic archaea and methane production potential in selected natural wetland ecosystems across China. Biogeosciences. 8 (2), 329-338 (2011).
  43. Ke, Z., et al. Methane emissions and methanogenic community investigation from constructed wetlands in Chengdu City. Urban Climate. 39, 100956(2021).
  44. Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Ecology of aerobic methanotrophs in controlling methane fluxes from wetlands. Applied Soil Ecology. 65, 8-22 (2013).
  45. Maja, S., et al. Humic substances cause fluorescence inhibition in real-time polymerase chain reaction. Anal Biochem. 487, 30-37 (2015).
  46. Sanches, T. M., Schreier, A. D. Optimizing an eDNA protocol for estuarine environments: Balancing sensitivity, cost and time. PLOS ONE. 15 (5), e0233522(2020).
  47. Xia, Z., et al. Conventional versus real-time quantitative PCR for rare species detection. Ecol Evol. 8 (23), 11799-11807 (2018).
  48. Bourne, D. G., McDonald, I. R., Murrell, J. C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils. Appl Environ Microbiol. 67 (9), 3802-3809 (2001).
  49. Juottonen, H., Galand, P. E., Yrjala, K. Detection of methanogenic Archaea in peat: comparison of PCR primers targeting the mcrA gene. Res Microbiol. 157 (10), 914-921 (2006).
  50. Lueders, T., Friedrich, M. W. Evaluation of PCR amplification bias by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of small-subunit rRNA and mcrA genes by using defined template mixtures of methanogenic pure cultures and soil DNA extracts. Appl Environ Microbiol. 69 (1), 320-326 (2003).
  51. Vaksmaa, A., Jetten, M. S., Ettwig, K. F., Luke, C. McrA primers for the detection and quantification of the anaerobic archaeal methanotroph 'Candidatus Methanoperedens nitroreducens'. Appl Microbiol Biotechnol. 101 (4), 1631-1641 (2017).
  52. Ren, G., et al. Electron acceptors for anaerobic oxidation of methane drive microbial community structure and diversity in mud volcanoes. Environ Microbiol. 20 (7), 2370-2385 (2018).
  53. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  54. McKee, A. M., Spear, S. F., Pierson, T. W. The effect of dilution and the use of a post-extraction nucleic acid purification column on the accuracy, precision, and inhibition of environmental DNA samples. Biological Conservation. 183, 70-76 (2015).
  55. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nat Biotechnol. 34 (9), 942-949 (2016).
  56. Ballarini, A., Segata, N., Huttenhower, C., Jousson, O. Simultaneous quantification of multiple bacteria by the BactoChip microarray designed to target species-specific marker genes. PLOS ONE. 8 (2), e55764(2013).
  57. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: A review. Eur J Soil Biol. 37 (1), 25-50 (2001).
  58. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Overvloed aan methanogenenovervloed aan methanotrofenruimtelijke distributieqPCR analysecPCR detectieArcGIS PromcrA genpmoA1 gen

Gerelateerde artikelen