Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Effectieve en veilige genafgifte aan de nier van de muis via langzame retrograde injectie van nierbekken van adeno-geassocieerde virusvectoren

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67716

⸱

1 augustus 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit rapport beschrijft de gelokaliseerde injectiemethode van AAV-vectoren via het nierbekken voor effectieve en veilige genoverdracht naar de nier van de muis.

Samenvatting

De ontwikkeling van effectieve in vivo instrumenten en methoden voor genafgifte aan de nier is cruciaal voor het bevorderen van fundamenteel nieronderzoek en gentherapie voor nierziekten. Bovendien onderstreept het groeiende bewustzijn van monogene nierziekten, aangedreven door geavanceerde genetische tests, het potentieel van gentherapie om moeilijk te behandelen genetische nierziekten te behandelen en zelfs te genezen. In dit opzicht hebben adeno-geassocieerde virusvectoren (AAV) steeds meer aandacht gekregen als een robuust platform voor in vivo genafgifte; de meest effectieve en veiligste methode voor AAV-vectorgemedieerde genafgifte aan elk therapeutisch relevant celtype in de nier is echter nog niet volledig vastgesteld. Hier wordt de methode van langzame retrograde nierbekken (RP) injectie van AAV-vectoren gedetailleerd beschreven, en het hoge potentieel om muizennieren te transduceren wordt aangetoond bij gebruik met correct geselecteerde AAV-capsiden. Bovendien is aangetoond dat deze methode niet alleen effectief is met de standaard cesiumchloride ultracentrifugatie-gezuiverde AAV (CsCl AAV) vectoren, maar ook met centrifugaal ultragefilterde AAV (CU AAV) vector minipreps, die snel en eenvoudig kunnen worden bereid met behulp van technieken die geen gespecialiseerde AAV-vectorexpertise vereisen. Deze studie toont bijvoorbeeld aan dat langzame RP-injectie van zowel CsCl- als CU AAV-KP3-vectoren resulteert in robuuste transductie van proximale tubuli in de nier van de muis zonder duidelijke weefselschade, in tegenstelling tot eerder gerapporteerde hydrodynamische benaderingen die onvermijdelijk leiden tot weefselbeschadiging. Deze studie benadrukt dus dat langzame retrograde RP-injectie van geselecteerde AAV-capside-afgeleide vectoren een effectieve en veilige methode is voor genafgifte aan de nier. Deze methode zal toepasbaar zijn op een breed spectrum van nieronderzoek, inclusief gentherapiestudies. Het gebruik van CU AAV-vectorminipreps zal de doorvoer aanzienlijk verhogen en de tijd- en kostenefficiëntie verbeteren die nodig is om voorlopige gegevens te genereren en cruciale inzichten te verkrijgen.

Inleiding

Effectieve en veilige methoden voor genafgifte aan de nier bij kleine en grote proefdieren bieden cruciale kansen om fundamenteel nieronderzoek vooruit te helpen en innovatieve therapeutische benaderingen te verkennen. Het vaststellen van dergelijke methoden is met name relevant voor gentherapie voor verschillende nierziekten. Recente ontwikkelingen op het gebied van klinisch genetisch testen hebben een hogere prevalentie van monogene nieraandoeningen aan het licht gebracht dan eerder werd geschat, waardoor ongeveer 30% van de patiënten met chronische nierziekten (CKD's) voorkomt1. CKD wordt gekenmerkt door progressieve nierbeschadiging, wat uiteindelijk leidt tot nierfalen zonder echt effectieve ziektemodificerende therapieën. Hemodialyse en niertransplantatie zijn momenteel beschikbare behandelingen; ze hebben echter beperkingen die de kwaliteit van leven van patiënten met CKD2 aanzienlijk aantasten. Gentherapie, een klinisch bewezen krachtige benadering voor de behandeling van genetische ziekten, heeft de afgelopen jaren dus veel aandacht gekregen als een nieuwe manier voor de effectieve behandeling van genetische nierziekten die leiden tot CKD 3,4,5,6. Deze aanpak kan de grondoorzaken van de ziekten direct aanpakken en mogelijk een remedie bieden.

Ondanks de gestage vooruitgang in het veld, blijft genafgifte aan de nier een belangrijke uitdaging in zowel onderzoeks- als therapeutische omgevingen. Het efficiënt richten op niercellen met therapeutische genen is moeilijk vanwege de complexe structuur van het orgaan en de unieke fysiologische barrières, waaronder de glomerulaire filtratiebarrière, die is samengesteld uit glomerulaire endotheelcellen, het glomerulaire basaalmembraan en podocytvoetprocessen. Er zijn verschillende strategieën onderzocht voor niergerichte genafgifte, waaronder directe injectie van de nierschors (RC) 7,8, injectie van de nierslagader (RA) 9,10,11, injectie van nierader (RV) 12,13,14, injectie van nierbekken (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 en intraveneuze (IV) injectie 19,26,27,28,29,30 van virale of niet-virale genafgiftevectoren, evenals ultrasone en microbellen-gemedieerde nucleïnezuurafgifte 31,32. Deze benaderingen toonden variabele transductie-efficiënties of functionele resultaten aan, wat vaak inconsistente resultaten opleverde die moeilijk met elkaar te verzoenen zijn (besproken in referenties 3,33,34,35). De afgifte van genen aan de nier is nog onderontwikkeld, waardoor directe vergelijkingen tussen vectorsystemen en -methodologieën een uitdaging zijn. Gelokaliseerde toedieningsmethoden, die de toediening van sterk geconcentreerde middelen rechtstreeks aan de nier vergemakkelijken, hebben echter over het algemeen betere resultaten opgeleverd dan systemische IV-toediening. Bovendien zijn adeno-geassocieerde virusvectoren (AAV), met hun robuuste veiligheidsprofielen en bewezen staat van dienst op het gebied van klinische vertaling36,37, het meest bestudeerd en worden ze beschouwd als de belangrijkste keuze voor renale genoverdracht.

Gemeenschappelijke AAV-serotypen en gemanipuleerde capsiden hebben effectieve transductie van mesangiale en mesenchymale cellen in de nier aangetoond na IV-injectie bij muizen 28,30,38. Recente studies hebben met name aangetoond dat IV-toediening van AAV9 podocyten effectief kan transduceren in muismodellen van nefrotisch syndroom en Alport-syndroom, hoewel dit effect niet wordt waargenomen in gezonde nieren38,39, en dat IV-toediening van een gemanipuleerde AAV2-capside uitsluitend gericht kan zijn op glomerulaire endotheelcellen in zowel gezonde als ontstoken nieren bij muizen40. Historisch gezien waren niertubuli een uitdaging om via de IV-route te transduceren. Recent is echter ontdekt dat RP-injectie van geselecteerde AAV-capsiden, zoals AAV-KP141, transductie van proximale tubuli kan bereiken op niveaus die meer dan een orde van grootte hoger zijn dan die bereikt met de benchmark AAV9 capside38. Hoewel verdere verbeteringen nodig zijn, openen deze ontwikkelingen nieuwe wegen voor fundamenteel nieronderzoek en gentherapie, en bieden ze kansen die voorheen onbereikbaar waren.

In dit artikel wordt langzame retrograde RP-injectie van AAV-vectoren beschreven als een effectieve en veilige methode voor genafgifte aan de muizennier38. Als representatief voorbeeld van deze techniek werd AAV-KP3 gekozen als een voorbeeldige capside op basis van de ontdekking dat het een van de zes capsiden is (d.w.z. AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 en AAV2.7m844) die verbeterde niertransductie vertoonden in vergelijking met AAV9 na RP-injectie bij muizen38. Met name langzaam retrograde RP-geïnjecteerd nierweefsel vertoonde geen duidelijke weefselbeschadiging in tegenstelling tot eerder gerapporteerde hydrodynamische benaderingen 23,24. Bovendien bereikten AAV-miniprepvectoren45 ruw gezuiverd door snelle en eenvoudige centrifugale ultrafiltratie (d.w.z. CU AAV-vectoren) renale transductieniveaus die ongeveer 70% hoger waren dan die welke haalbaar zijn met AAV-vectorpreparaten die zijn gezuiverd door de standaard cesiumchloride (CsCl) gradiënt-ultracentrifugatie (d.w.z. CsCl AAV-vectoren) wanneer deze wordt toegediend aan dezelfde vectorgenoomtiter. De hier gepresenteerde methode en observaties bieden dus een waardevolle en praktische bron voor onderzoekers die de genafgifte aan de nier bij muizen en mogelijk grotere dieren willen verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Oregon Health & Science University (OHSU) en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging bij OHSU. In deze studie werden acht weken oude C57BL/6J mannelijke muizen gebruikt. De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Productie van AAV-vectoren door een adenovirusvrije plasmidetransfectie

  1. Kweek menselijke embryonale nier (HEK) 293 cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-hoge glucose (4,5 g/L) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% Penicilline en Streptomycine Mix, en 1 mM L-glutamine, in een incubator van 37 °C met 5% kooldioxide (CO2).
  2. Op dag -2 (48 uur voorafgaand aan transfectie), plaat 4 x 106 HEK 293 cellen per T225-kolf in 40 ml van het kweekmedium zoals beschreven in stap 1.1. Dit bereikt ~95% samenvloeiing op dag 0.
    OPMERKING: De cultuurschaal kan worden aangepast op basis van de toepassing. Voor een AAV-miniprep (stap 2) moet een geschikt aantal kolven worden voorbereid op basis van de doeltiter en vectorconcentratie, aangezien het zuiveringsproces doorgaans resulteert in een materiaalverlies van ongeveer 50%. Om >6 x 1012 vg/ml AAV9- en AAV-KP3-vectoren voor RP-injectie bij muizen te bereiken in een dosis van 3 x 1011 vg/muis in een vectoroplossing van 50 μl, worden ten minste 2 kolven aanbevolen. Voor de productie van AAV-vectoren op grotere schaal, zoals die voor CsCl-dichtheidsgradiënt-gezuiverde AAV-vectoren (CsCl AAV's), worden doorgaans 25 of meer kolven gebruikt.
  3. Dag 0: Plasmide DNA transfectie
    1. Voorbereiding voor transfectie
      1. Zorg ervoor dat cellen ~95% samenvloeiing hebben bereikt.
      2. Warm DMEM aangevuld met 1% Penicilline en Streptomycine Mix en 1 mM L-glutamine maar zonder FBS (d.w.z. serumvrij medium) op in een waterbad van 37 °C.
      3. Laat de lineaire polyethyleenoplossing (PEI) op kamertemperatuur komen.
    2. Bereiding van plasmide-DNA-mengsel
      1. Meng de plasmiden (15 μg pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap en pHelper) in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder CaCl2 of MgCl2 in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. De totale hoeveelheid DNA is 45 μg/kolf.
        OPMERKING: De volumes van de plasmide-DNA-oplossing kunnen worden genegeerd als ze minimaal zijn. Volumeaanpassing wordt echter geadviseerd als het totale oplossingsvolume ≥225 μL is. De sequenties van de plasmiden die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn beschikbaar in aanvullend bestand 1.
    3. PEI-transfectie
      1. Voeg 90 μl PEI-oplossing (1 mg/ml) toe aan de 1 ml PBS en meng met de PBS-plasmide DNA-mix (bereid zoals hierboven) in een polypropyleen buisje van 50 ml. Het uiteindelijke volume is ongeveer 2 ml (5% volume van het kweekmedium).
      2. Draai de buizen gedurende 5 s en draai de buizen kort rond met een centrifuge om de vloeistof naar de bodem van de buizen te verzamelen.
    4. Bewaar 15 minuten bij kamertemperatuur om plasmide-DNA-PEI-complexen te vormen.
    5. Zodra de incubatie van 15 minuten is voltooid, voegt u de 40 ml voorverwarmd serumvrije medium die in stap 1.3.1.2 is bereid, toe aan de plasmide DNA-PEI-complexen. Het volume is ongeveer 42 ml.
    6. Vervang het kweekmedium van de T225-kolf door plasmide-DNA-PEI-complexen die serumvrij medium bevatten als beschreven in stap 1.3.4.
    7. Handhaaf de cellen in dit transfectiemiddel tot de oogst op Dag 5 (geen middelgrote verandering is vereist).
    8. Op Dag 2, observeer cellen die met het plasmide worden getransfecteerd die fluorescerende proteïnen tot expressie brengen (b.v., pAAV-CAG-tdTomato) onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om de efficiëntie van plasmidetransfectie te beoordelen.
      OPMERKING: De hierboven beschreven omstandigheden resulteren doorgaans in transfectie-efficiënties van meer dan 70%. Er kunnen enkele morfologische veranderingen (bijv. celverlenging) worden waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van de serumvrije omgeving.
    9. Ga op dag 3 tot 5 verder met het kweken van de getransfecteerde cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
    10. Verzamel op dag 5 zowel de cellen als het virusbevattende medium in een polypropyleen tube van 50 ml.
    11. Bewaar de monsters tot gebruik bij -80 °C.

2. Centrifugale ultrafiltratie (CU) zuivering van AAV-vectoren (AAV miniprep)

  1. Ontdooi het bevroren monster uit stap 1.3.11 in een waterbad van 37 °C.
  2. Houd 1 ml ruw lysaat opzij voor de DNA-dot-blot-test (gebruikt als fractie 1).
  3. Voeg 80 μL 1M magnesiumchloride (MgCl2, eindconcentratie van 2 mM), 160 μL 0,1M natriumhydroxide (NaOH, eindconcentratie van 0,4 mM) en 16 μL Serratia marcescens endonuclease (eindconcentratie van 100 eenheden/ml) toe aan een buis van 50 ml. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Draai het monster elke 15 minuten tijdens de incubatie.
  4. Verzamel het met Serratia marcescens endonuclease behandelde monster in een centrifugefles van 250 ml en centrifugeer bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min.
  5. Breng het bovenstaande over in een polypropyleen buisje van 50 ml met behulp van een serologische pipet van 50 ml.
  6. Filtreer het bovenstaande om vuil te verwijderen met behulp van een PVDF-spuitfilter van 0,45 μm. Houd 1 ml 0,45 μm gefilterd monster opzij voor de DNA-dotblot-test (gebruikt als fractie 2).
  7. Voeg 10 ml water van moleculaire kwaliteit toe aan een centrifugale ultrafiltratiebuis van 100 kDa met moleculair gewicht (MWCO) en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g bij 4 °C. Verwijder de doorstroom.
  8. Voeg 15 ml 5% sorbitol in PBS toe aan de centrifugale ultrafiltratiebuis en centrifugeer bij 2.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Verwijder de doorstroom.
  9. Voeg maximaal 15 ml 0,45 μm gefilterd monster toe zoals beschreven in stap 2.6 en centrifugeer bij 2 000 x g bij 4 °C gedurende 15 minuten voor concentratie totdat het doelvolume van ongeveer 500 μl is bereikt. Houd 1 ml doorstroom opzij voor de DNA-dot-blot-test (gebruikt als fractie 3).
    OPMERKING: Suspendeer vóór elke centrifugatie het retentaat opnieuw met een pipet om de concentratiegradiënt te verstoren. Raak het membraan niet aan met de pipetpunt. Als het doelvolume na 15 minuten centrifugeren niet wordt bereikt, verleng dan de centrifugatie indien nodig door de duur aan te passen op basis van het resterende volume in de buis.
  10. Herhaal stap 2.9 totdat het hele monster is gefilterd en het doelvolume van ongeveer 500 μl is bereikt. Houd 1 ml van de doorstroom van de eerste en tweede iteraties van stap 2.10 opzij voor de DNA-dot-blot-test (gebruikt als fractie 4 en fractie 5).
    OPMERKING: Een enkele centrifugale ultrafiltratiebuis kan worden gebruikt om monsters te verwerken die zijn verkregen uit twee of meer kolven.
  11. Voeg 15 ml 5% sorbitol in PBS toe en centrifugeer bij 2.000 x g bij 4°C gedurende 15 minuten tot het doelvolume van ongeveer 500 μl is bereikt. Houd 1 ml doorstroming opzij voor de DNA-dot-blot-test (gebruikt als fractie 6).
  12. Herhaal stap 2.11 (gebruikt als Breuk 7).
    OPMERKING: Als hogere AAV-titers nodig zijn voor stroomafwaartse experimenten, kan het uiteindelijke doelvolume verder worden verlaagd tot 150 μL.
  13. Breng de ultragefilterde AAV-vector over in een buis met schroefdop van 2 ml met een O-ring. Houd 10 μL ultragefilterde AAV-vector opzij voor de DNA-dot-blot-test (gebruikt als fractie 8).
  14. Bepaal AAV-titers door middel van DNA-dot-blot-assay zoals eerder beschreven46.
    OPMERKING: CU-gezuiverde vectoren (CU AAV) bevatten hogere niveaus van lege capsidebesmetting en van gastheercellen afgeleide onzuiverheden in vergelijking met CsCl-gezuiverde vectoren (CsCl AAV). Deze factoren kunnen van invloed zijn op de transductie-efficiëntie en immuunresponsen, en vereisen een zorgvuldige overweging bij de interpretatie van gegevens.

3. CsCl dichtheidsgradiëntzuivering van AAV-vectoren

  1. Ontdooi het bevroren monster uit stap 1.3.11 in een waterbad van 37 °C.
  2. Centrifugeer bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten om de celresten te verwijderen.
  3. Verzamel het bovenstaande en precipiteer AAV-vectoren in het supernatans door polyethyleenglycol 8000 (PEG, eindconcentratie van 8%) en natriumchloride (eindconcentratie van 500 mM) toe te voegen.
  4. Incubeer 3 uur op ijs.
  5. Centrifugeer bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten om de pellets met AAV te verkrijgen.
  6. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de pellets opnieuw met 10 ml Sarkosyl met resuspensiebuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl, pH 8,0).
  7. Breng de pelletsuspensie over in een polypropyleen buis van 15 ml en houd deze een nacht op 4 °C.
  8. Behandel de pelletsuspensie de volgende dag met Serratia marcescens endonuclease (eindconcentratie van 200 eenheden/ml) en MgCl2 (eindconcentratie van 2 mM).
  9. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  10. Centrifugeren bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min.
  11. Verzamel het bovenstaande en voeg cesiumchloride (CsCl, eindconcentratie van brekingsindex (RI) = 1,3710 +/- 0,0005) en EDTA (eindconcentratie van 20 mM) toe.
  12. Laad het monster in een ultracentrifugebuis van 29,9 ml en voeg topoplossing toe (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) totdat het vol is.
  13. Centrifugeren bij 41.000 x g bij 12 °C gedurende 22 uur.
  14. Maak gaten in de bodem en zijkant van de ultracentrifugebuis om in totaal 15 fracties van elk 2 ml te verzamelen.
  15. Gebruik 10 μL van elke fractie om RI te controleren en voer de DNA-dot-blot-test46 uit.
  16. Bepaal op basis van de resultaten van de RI- en DNA-dotblot-test de beste 5 fracties die AAV-vectoren bevatten.
  17. Combineer de beste 5 fracties (totaal ongeveer 10 ml) en pas RI aan op 1.3710 +/- 0.0005.
  18. Doe het monster in een ultracentrifugebuis van 11,2 ml en voeg de topping-oplossing toe tot deze vol is.
  19. Centrifugeren bij 65.000 x g bij 12 °C gedurende 12 uur.
  20. Maak gaten in de bodem en zijkant van de ultracentrifugebuis van 11,2 ml om in totaal 18 fracties van elk 0,5 ml te verzamelen.
  21. Gebruik 10 μL van elke fractie om RI te controleren en voer de DNA-dot-blot-test46 uit.
  22. Bepaal op basis van de resultaten van de RI- en DNA-dotblot-test de beste 6 fracties die AAV-vectoren bevatten.
  23. Combineer de beste 6 fracties (totaal ongeveer 3 ml) en laad ze in een dialysecassette.
  24. Drijf de dialysecassette gedurende 2 uur in 1,3 L dialysebuffer (PBS-buffer aangevuld met 0,001% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) met een roerstaaf om de CsCl te verwijderen.
  25. Herhaal stap 3.24 twee keer (totaal 6 uur dialyse).
  26. Breng de cassette over op 500 ml 5% sorbitol in PBS-buffer aangevuld met 0,001% oppervlakteactieve stof gedurende 2 uur voor bufferuitwisseling.
  27. Verzamel het monster uit de dialysecassette met een spuit en filtreer het verzamelde monster met behulp van een PVDF-spuitfilter van 0.22 μm.
  28. Bepaalde AAV-titers door een kwantitatieve dot blot-assay46.

4. Kwaliteitsbeoordeling van AAV-vectorpreparaten door SDS-PAGE gevolgd door zilverkleuring

  1. Meng vectorpreparaten, 1 x 1010 vg voor CsCl AAV-vectoren, en 1 x 109 en 1 x 1010 vg voor CU AAV-vectoren, met 6x Laemmli-buffer in een totaal van 18 μL (vectorpreparaat: 6x Laemmli = 15:3) en verwarm ze gedurende 5 minuten op 100 °C.
  2. Laad de warmtebehandelde AAV-vectorpreparaten op een 7,5% SDS-PAGE-gel en elektrofores de monsters bij 20 mA met behulp van Tris-glycine-SDS-gel loopbuffer.
  3. Verwijder de gel van de gelcassette, spoel deze af met ultrapuur water en beits deze met een zilverkleuringsset volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Incubeer de gel geladen met CsCl AAV-vectoren in de ontwikkelaarsoplossing gedurende 7 minuten, terwijl u de gel geladen met CU AAV-vectoren gedurende 2 minuten incubeer om signaalverzadiging te voorkomen.
    OPMERKING: CU AAV-vectorpreparaten bevatten hogere niveaus van eiwitonzuiverheden in vergelijking met CsCl AAV-vectoren. Daarom werden gels geladen met CsCl AAV- en CU AAV-vectoren gescheiden na het lopen van de gel en afzonderlijk met zilver gekleurd om signaalverzadiging te voorkomen vanwege de hoge gevoeligheid van de kleuringsmethode.

5. Identificatie van AAV VP eiwitten in CU AAV vector preparaten door western blot

  1. Meng 1 x 109 vg CU AAV vectorpreparaten met 6x Laemmli buffer in een totaal van 18 μL (vectorpreparaat: 6x Laemmli = 15:3) en verwarm ze gedurende 5 minuten op 100 °C.
  2. Laad de warmtebehandelde AAV-vectorpreparaten op een 7,5% SDS-PAGE-gel en elektrofores de monsters bij 20 mA met behulp van Tris-glycine-SDS-gel loopbuffer.
  3. Elektrotransfereer eiwitten in de gel op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan, geactiveerd in methanol, met behulp van een semi-droog overdrachtssysteem.
  4. Blokkeer het membraan met 5% magere melk in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  5. Incubeer het geblokkeerde membraan 's nachts bij 4 °C met een primaire antilichaamoplossing (polyklonaal anti-VP-antilichaam bij konijnen, verdund tot 1:1000 met 5% magere melk in 1x TBST) bij 4 °C.
  6. Was het membraan met 1x TBST gedurende 10 min, 3 keer.
  7. Incubeer het membraan met secundaire antilichaamoplossing (geitenanti-konijn IgG-antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase, verdund tot 1:5000 met 5% magere melk in 1x TBST) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  8. Was het membraan met 1x TBST gedurende 10 min, 3 keer.
  9. Visualiseer signalen op het membraan met behulp van een western blot-beeldvormingssysteem.

6. Injectie van het nierbekken (RP)

  1. Preoperatieve opstelling en anesthesie
    1. Meet het lichaamsgewicht van elke muis in een plastic beker op een gewichtsschaal die tot op 0,1 g nauwkeurig is.
    2. Dien meloxicam (5 mg/kg) subcutaan toe op basis van het lichaamsgewicht om preoperatieve analgesie te verkrijgen.
    3. Verdun de AAV-vectoroplossing tot een concentratie van 6,0 x 1012 vg/ml met 5% sorbitol in PBS en bewaar het op ijs.
      OPMERKING: Bereid 40 μl meer AAV-oplossing dan het totale injectievolume (50 μl x aantal te injecteren muizen) om rekening te houden met dode ruimte in een gasdichte glazen spuit en een PE-10 polyethyleen buis.
    4. Buig en breek alleen de naaldpunt van een naald van 30 G af met behulp van een naaldhouder.
    5. Sluit onder een stereomicroscoop de punt van de naald van 30 G, de 15 cm PE-10-buis, een naald van 30 G en een gasdichte glazen spuit in deze volgorde vanaf de punt aan (Figuur 1D).
    6. Plaats de aangesloten gasdichte glazen spuit op een infuusspuitpomp.
    7. Zuig 90 μl AAV-vectoroplossing bereid in stap 6.1.3 op in de gasdichte glazen spuit met behulp van een infuusspuitpomp.
    8. Stel de infusiemodus van de spuitpomp als volgt in: het doelvolume van 50 μl en een debiet van 50 μl/min.
    9. Plaats een muis in een plastic kamer gevuld met 4% isofluraan toegediend in 100% zuurstof met een debiet van 1,5 tot 3,0 l/min totdat hij volledig verdoofd is.
    10. Plaats de snuit van de muis in een neuskegel met 1,5% tot 3,0% isofluraanstroom. Bewaak de diepte van de anesthesie door middel van een teenknijpreflex tijdens de chirurgische ingreep.
    11. Bedek de ogen met oogzalf met behulp van een applicator met wattenstaafjes om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    12. Verwijder de vacht van de linkerachterkant van de muis met een ontharingsmiddel met behulp van een applicator met wattenstaafje.
      OPMERKING: Ontharingscrème moet volledig worden verwijderd door te spoelen om huidirritatie te voorkomen.
    13. Plaats de muis in een zijwaartse positie op een gesloten warmtekussen dat is aangesloten op een warmtetherapiepomp om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden (u hoeft deze niet met plakband vast te zetten).
    14. Desinfecteer het geschoren gebied met drie afwisselende toepassingen van povidon-jodium en 70% ethanol met behulp van een applicator met wattenstaafje in een cirkelvormige beweging die begint bij de incisieplaats.
    15. Bedek de muis met een steriel chirurgisch laken.
  2. RP-injectie in de linkernier
    1. Knijp met een weefseltang in de huid en maak met een chirurgische schaar een incisie van ongeveer 1 cm in de huidlaag ter hoogte van de costovertebrale hoek op de locatie van de linkernier.
    2. Snijd na het maken van een incisie in de huid de spierlaag op dezelfde lengte door.
      OPMERKING: Als de lengte van de incisie te kort is, kan de nier niet worden blootgesteld en kan in plaats daarvan de milt, die kleiner is, per ongeluk worden blootgesteld. Aan de andere kant, als de lengte van de incisie te lang is, wordt de nier niet op zijn plaats gehouden door de incisie zelf en zal deze via de incisie voortdurend terugglijden in de buik.
    3. Druk voorzichtig met de vingers op de buik, niet direct tegen de nier, zodat de nier via de incisieplaats wordt blootgesteld (Figuur 1A).
    4. Verwijder minimaal het omringende vet zodat het nierbekken zichtbaar is als een klein wit gebied.
    5. Klem eerst de urineleider vast met een rechte microvatclip en vervolgens de nierslagader en nierader samen met een gebogen microvatclip.
      OPMERKING: De nierkleur wordt donkerrood, wat de succesvolle blokkade van de bloedstroom in en uit de nier bevestigt (Figuur 1B).
    6. Steek de 30 G-naald die is aangesloten op de spuitpomp ongeveer 3 mm met een gebogen tang in de bekkenholte en begin met een injectie van 50 μl AAV-vectoroplossing met behulp van een infuusspuitpomp met een debiet van 50 μl/min gedurende 1 minuut (figuur 1C).
    7. Houd de naald en klem 5 minuten vast om de blootstelling van de geïnjecteerde nier aan de AAV-vector te vergroten.
      OPMERKING: De juiste verblijftijd kan variëren en is afhankelijk van de AAV-capsiden. Een verblijftijd van 5 minuten is voldoende gebleken voor transductie met AAV-KP1- of AAV-KP3-vector.
    8. Zodra de incubatie van 5 minuten is voltooid, verwijdert u de klemmen.
      OPMERKING: De nierkleur verandert onmiddellijk van donkerrood naar bloedrood, wat het herstel van de bloedstroom in de nier bevestigt.
    9. Trek de injectienaald voorzichtig en langzaam terug en plaats tegelijkertijd een applicator met wattenstaafje onder druk op de injectieplaats. Zorg ervoor dat er geen bloeding uit de injectieplaats komt. Het aanbrengen van een hemostatische pleister is niet nodig.
    10. Plaats de nier voorzichtig terug in de peritoneale holte.
    11. Hecht de spierlaag met 6-0 resorbeerbare hechtdraad en de huid met 5-0 monofilament hechtdraad.
    12. Dien 1 ml zoutoplossing subcutaan toe in de rug van muizen voor vloeistofondersteuning.
    13. Vervang de gebruikte naaldpunt van 30 G door een nieuw geprepareerde punt, gooi de gebruikte naald van 30 G weg volgens de richtlijnen van de instelling voor het beheer van gevaarlijk chemisch afval en laad 50 μl van de AAV-vectoroplossing met behulp van een infuusspuitpomp voor toediening aan de volgende muis.
    14. Herhaal stap 6.2.12-6.2.13 voor alle muizen in de groep, behalve de laatste, waarvoor stap 6.2.13 niet vereist is.
    15. Na voltooiing van alle geplande injecties worden de verontreinigde naalden en polyethyleenbuizen weggegooid volgens de richtlijnen van de instelling voor het beheer van gevaarlijk chemisch afval.
  3. Postoperatieve monitoring en zorg
    1. Dien meloxicam (5 mg/kg) subcutaan toe in de rug van muizen voor postoperatieve analgesie 24 uur en 48 uur na RP-injectie.
    2. Dien 1 ml zoutoplossing subcutaan toe in de rug van muizen voor vloeistofondersteuning 24 uur na RP-injectie.
    3. Controleer dagelijks het lichaamsgewicht en het algemene uiterlijk van geïnjecteerde muizen gedurende 1 week na de operatie. Als er een gewichtsverlies van 10% optreedt, dien dan drie keer per week gedurende een week 1 ml zoutoplossing subcutaan toe in de rug van muizen. Als er geen verbetering wordt waargenomen, worden de aangetaste muizen geëuthanaseerd.

7. Weefseloogst en cryosectie

  1. Bereiding van fixatie en cryoprotectie-oplossing.
    1. 0,2 M fosfaatbuffer (totaal 1 L)
      1. Bereid 800 ml ultrapuur water in een glazen bekerglas van 1 l.
      2. Voeg 6,4 g monobasisch natriumfosfaat (NaH2PO4) en 21,8 g natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4) toe aan de oplossing.
      3. Stel de pH in op 7,4 met zoutzuur.
      4. Vul met ultrapuur water tot 1 L.
      5. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
    2. 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing (totaal 40 ml)
      1. Meng 10 ml 16% PFA, 20 ml 0,2 ml fosfaatbuffer bereid in stap 7.1.1 en 10 ml ultrapuur water.
      2. Verdun 10 ml in een polypropyleen buis van 15 ml.
        OPMERKING: Maak vlak voor gebruik een 4% PFA-oplossing voor perfusiefixatie.
    3. 30% sucrose-oplossing (totaal 40 ml).
      1. Meng 30 ml PBS met 12 g sucrose.
      2. Nadat het volledig is opgelost, vult u met PBS tot 40 ml.
  2. Perfusiefixatie en weefseloogst.
    LET OP: Perfusiefixatie moet worden uitgevoerd in een zuurkast, aangezien 4% PFA-oplossing een krachtige schadelijke chemische stof is bij inademing.
    1. Verdoof de muis met isofluraan, plaats hem in rugligging en bevestig de volledige afwezigheid van responsiviteit door zachtjes in de ledematen te knijpen.
    2. Zodra de muis is verdoofd, maakt u met een chirurgische schaar een incisie van de staartbuik naar de xiphoid. Maak vervolgens twee laterale incisies langs weerszijden van het borstbeen en trek de borstwand naar voren in om het hart en de belangrijkste bloedvaten bloot te leggen.
    3. Open het rechter atrium via scherpe dissectie om de bloedsomloop te decomprimeren. Steek een vlindernaald van 25 G in de linkerventrikel en infuseren 50 ml PBS met een snelheid van ongeveer 10 ml/min, waarbij de stroom naar de stijgende aorta wordt geleid.
      OPMERKING: Verbloeden is belangrijk om immunofluorescentiebeelden (IF) van hoge kwaliteit te verkrijgen, omdat bloed autofluorescentie vertoont. Om volledige verwijdering van bloed te garanderen, werd in deze studie 50 ml PBS gebruikt, hoewel 20-30 ml vaak wordt gebruikt.
    4. Laat 20 ml 4% PFA-oplossing bereid in stap 7.1.2 met dezelfde snelheid infuseren en zorg ervoor dat er geen lucht wordt geïntroduceerd tijdens het wisselen van oplossingen.
    5. Oogst tissues en bewaar ze een nacht bij 4 °C in een polypropyleen tube van 15 ml gevuld met 4% PFA-oplossing voor nafixatie. Wanneer fluorescerend eiwit tot expressie wordt gebracht in het verzamelde weefsel, bedek de buis dan met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.
  3. Cryo-inbedding
    1. Breng het weefsel over naar een polypropyleen tube van 15 ml gevuld met 30% sucrose-oplossing die in stap 7.1.3 is bereid voor cryoprotectie.
    2. Houd bij 4 °C totdat het weefsel volledig naar de bodem van de buisjes zakt.
    3. Breng het weefsel over naar een plastic cryomold met een standaard patroontang.
    4. Plaats de OCT-verbinding over het weefsel en zorg ervoor dat het weefsel correct is georiënteerd en gelijk ligt met de bodem van de cryomold.
    5. Vul de bovenkant met OCT-massa. Verwijder eventuele luchtbellen met een pipetpunt.
    6. Plaats de plastic cryomold in een cryogeen bad met 2-methylbutaan, gekoeld met gemalen droogijs in een ijsemmer, totdat de OCT-verbinding volledig is bevroren (de OCT-verbinding wordt wit).
    7. Bewaar de tissueblokken bij -80 °C tot gebruik.
  4. Cryosectie
    1. Breng de bevroren weefselblokken vóór het doorsnijden over naar een cryostaatmicrotoom bij -20 °C en laat de temperatuur van de bevroren weefselblokken in evenwicht zijn.
    2. Snijd elk bevroren weefselblok in een gewenste dikte (meestal 5 μm) met behulp van de cryostaatmicrotoom. Plaats de weefselsecties op een microscoopglasplaatje voor immunofluorescentiekleuring.
    3. Secties kunnen worden opgeslagen bij -80 °C voor later gebruik.

8. Immunofluorescentie kleuring

  1. Droog bevroren dia's 30 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Isoleer het gedeelte met een liquid blocker-pen en droog het 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Rehydrateer secties met 150 μL PBS gedurende 10 minuten.
  4. Plaats de objectglaasjes op een vlakke ondergrond en voeg 150 μL 1% runderserumalbumine (BSA) verdund met PBS per sectie toe aan de objectglaasjes. Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur om te blokkeren.
  5. Voeg 150 μL primaire antilichaamoplossing (anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antilichaam, verdund tot 1:100 met 1% BSA; anti-Na-K-2Cl cotransporter 2 (NKCC2) antilichaam, verdund tot 1:100 met 1% BSA; of anti-aquaporine 2 (AQP2) antilichaam, verdund tot 1:100 met 1% BSA) toe en incubeer bij 4 °C een nacht onder een vochtige kamer.
  6. Was de secties met PBS op kamertemperatuur gedurende 5 minuten, 3 keer.
  7. Voeg 150 μL secundair antilichaam (anti-konijn IgG Alexa Fluor 647 antilichaam, verdund tot 1:500 met 1% BSA) en Lotus tetragonolobus lectine (LTL)-fluoresceïne (verdund tot 1:200 met 1% BSA) toe, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 min.
  8. Was de secties met PBS gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  9. Plaats de objectglaasjes op een vlakke ondergrond en voeg 150 μL Hoechst 33342 toe (verdund tot 1:10.000 met PBS) voor nucleaire kleuring. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht.
  10. Was de secties met PBS gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  11. Monteer de dia's met 20 μL van het montagemedium en een afdekglas. Houd de objectglaasjes in het donker bij 4 °C totdat de beeldvorming is uitgevoerd.

9. DNA-extractie uit weefsel

  1. DNA-extractie uit weefsels met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie materiaaltabel).
    1. Breng het weefsel over in een keramische kralenbuis en voeg 400 μL DNA-extractiebuffer toe (100 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% SDS en 50 mM Tris-HCl, pH 8,0).
    2. Homogeniseer het weefsel met een snelheid van 5 m/s gedurende 20 s in 3 cycli met behulp van een homogenisator.
    3. Centrifugeer bij 2.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    4. Verzamel 200 μl van het bovenstaande met behulp van een P200-pipet en voeg 10 μl proteïnase K-oplossing toe (eindconcentratie van 1 mg/ml).
    5. Meng door 15 s te vortexen en incubeer gedurende 1 uur bij 55 °C.
    6. Voeg 200 μL lysisbuffer toe uit de DNA-extractiekit.
    7. Meng door 15 s te vortexen en incubeer gedurende 15 minuten bij 55 °C.
    8. Voeg 250 μL 100% ethanol toe.
    9. Meng door 15 s te vortexen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    10. Breng het lysaat aan op de spinkolom van de DNA-extractie.
    11. Centrifugeer op 6.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    12. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml. Voeg 500 μL van de eerste wasbuffer uit de DNA-extractiekit toe.
    13. Centrifugeer op 6.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    14. Plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis. Voeg 500 μL van de tweede wasbuffer uit de DNA-extractiekit toe.
    15. Centrifugeer op 6.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    16. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml. Voeg 500 μL 100% ethanol toe.
    17. Centrifugeer op 6.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    18. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 20.000 x g bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Deze stap zorgt voor volledige droging van het membraan van de spinkolom, aangezien overdracht van ethanol naar het eluaat de stroomafwaartse toepassingen kan verstoren.
    19. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 35 μL elutiebuffer uit de DNA-extractiekit toe aan de spinkolom.
      OPMERKING: Het volume teruggewonnen eluaat is doorgaans ongeveer 5 μL minder dan het volume elutiebuffer dat oorspronkelijk op de kolom werd toegepast.
    20. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    21. Centrifugeer op 20.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    22. Meet de DNA-concentratie.
  2. Kwantificering van het aantal vectorgenoomkopieën door kwantitatieve PCR (qPCR)
    1. Verdun het geëxtraheerde DNA dat in stap 9.1 is bereid tot een concentratie van 25 ng/μl met water van moleculaire kwaliteit.
    2. Ontwerp een qPCR-primerpaar voor de kwantificering van het vectorgenoom (tdTomato werd in deze studie gebruikt) en een qPCR-primerpaar voor het muisreferentiegen dat zal worden gebruikt om de diploïde genomen in de geëxtraheerde DNA-monsters te kwantificeren (het agouti-gen van de muis werd in deze studie gebruikt).
      OPMERKING: De primersequenties die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn als volgt;
      tdTomaat vooruit: 5'-TATGAACGGAGAGCGAGGGGAG-3'
      tdTomaat omgekeerd: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      muis agouti vooruit: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      muis agouti omgekeerd: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. Meng voor een qPCR-reactie van 25 μl 4 μl verdund DNA-monster in stap 9.2.1 (in totaal 100 ng DNA in een reactiemengsel van 25 μl), 12,5 μl 2x qPCR-reactiebuffer, 0,5 μl van zowel 20 μM voorwaartse als achterwaartse primes bereid in stap 9.2.2 (eindconcentratie van 400 nM van elke primer), en 7,5 μL water van moleculaire kwaliteit.
    4. Meet vier keer de DNA-concentratie van plasmidestandaarden voor qPCR en bepaal de gemiddelde waarde van de DNA-concentratie.
      OPMERKING: Supercoiled circular pAAV-CAG-tdTomato-plasmide en een supercoiled circulair plasmide met de PCR-doelsequentie afgeleid van het agouti-gen van de muis werden in deze studie gebruikt voor respectievelijk kwantificering en normalisatie van het vectorgenoom.
    5. Bereid een reeks 1:10 seriële verdunningen van plasmide-DNA-standaarden voor met een dynamisch bereik van 106.
      OPMERKING: Elk monster en elke norm moet ten minste in tweevoud worden geanalyseerd.
    6. Voer qPCR uit met behulp van de volgende thermische cyclusomstandigheden: een eerste warmteactiveringsstap bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s, en gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 30 s.
    7. Na het voltooien van de qPCR-reactie en het verkrijgen van de dubbelstrengs (ds) kopienummerwaarden van vectorgenomen en het muisreferentiegen in de monsters, bepaalt u het aantal ds-vectorgenoomkopienummers per diploïde genomisch equivalent (ds-vg/dge) door de ds-vectorgenoomkopienummers te normaliseren naar het referentiegenkopienummer in elk monster op basis van standaardcurven die zijn gegenereerd op basis van bekende concentraties van zowel het vectorgenoom als het referentiegen.
      OPMERKING: Ds-vg/dge kan worden bepaald op basis van de volgende benadering dat 100 ng genomisch DNA van muizen 16.900 diploïde (2N) muizencellen vertegenwoordigt (d.w.z. 5,92 pg DNA per diploïde muiscel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een recente studie heeft een kleine subset van AAV-capsiden geïdentificeerd die een opmerkelijke verbetering van de niertransductie vertoont in vergelijking met AAV9 na RP-injectie38. De geïdentificeerde subset omvat AAV-KP3, een chimere AAV-capside gegenereerd door DNA-shuffling41. Daarom werd in deze studie gekozen voor AAV-KP3 voor RP-injectie, samen met AAV9 als benchmark. AAV9-CAG-tdTomato-vector (AAV9) en AAV-KP3-CAG-tdTomato-vector (...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit rapport bevat gedetailleerde langzame retrograde RP-injectie van AAV-vectoren als een lokale toedieningsmethode voor genafgifte aan de nier van de muis. Een cruciale stap voor het veilig uitvoeren van RP-injectie is de aanpassing van de injectiesnelheid van AAV-vectoren om parenchymale schade aan de geïnjecteerde nieren te voorkomen. In een eerder rapport over hydrodynamische injectie van het nierbekken werd 100 μL plasmide-DNA-oplossing in slechts 3 s24 in de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

H.N. ontvangt een royalty van AAV-gerelateerde technologieën in licentie gegeven door Takara Bio Inc. en Capsigen Inc., fungeert als consultant voor biotechbedrijven, is mede-oprichter van Capsigen Inc. en bezit aandelen van Capsigen Inc. en Sphere Gene Therapeutics.

Dankbetuigingen

We danken Guangping Gao en James M. Wilson voor het verstrekken van het helperplasmide van AAV9 en Katja Pekrun en Mark A. Kay voor het helperplasmide van AAV-KP3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm PVDF spuitfilterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL microcentrifugebuisFisher Scientific05-408-129
15 mL polypropyleenbuisCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifugeflesFisher Scientific055641S24
2F Silicone slangSai Infusion TechnologiesSIL-2-50
25G vlindernaaldMedex Supply26708
2-methylbutaanMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR-reactiebufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G naaldBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropyleenbuisCorning430291
5-0 monofilament naaldEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorberbare naaldEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL buisMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antilichaamAbcamab199975Een marker voor verzamelbuisjes
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antilichaam		StressMarq BiosciencesSPC-401Een marker voor dikke opstijgende limbus
cellen
Anti-konijn IgG Alexa Fluor 647
antilichaam		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antilichaamAbcamab89901Een marker voor podocyten
Beckman Coulter OptiSeal buis,
Polypropyleen, 29,9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL BUIZENFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumine (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugale ultrafiltratiebuisMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Keramische kralenbuisFisher Scientific15-340-154
CesiumchlorideSigma-AldrichC3032-1KG
KlemtangFine Science Tools00071-14
Geverfde verwarmingspadStryker Medical8002-062-012
WattenstaafjePuritan806-WC
DekglasFisher Scientific12-541B
Cryostat microtoomTanner ScientificTN50
Gebogen tangFine Science Tools11052-10
Gebogen type microvat clipKleinert-Kutz65145Klem voor de nierarterie en nier
ader
DialysecassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extractiekitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
hoge glucose		Corning15-013-CVDMEM-hoge glucose (4,5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetaal bovien serum (FBS)VWR89510-186
Gasdichte glazen spuitHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde-oplossingSigma-AldrichG6257
TherapiepompKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenisatorFisher Scientific15-340-163
Menselijke embryonale nier (HEK) 293
cellen		Agilent240073
IJsemmerFisher Scientific07-210-104
InfusiespuitpompHarvard Apparatus70-4507
IsofluraanPiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Vloeibare blokkeerpenTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2Een marker voor proximale tubuli
Magnesiumchloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgeticum
MicroscoopglasplaatjeFisher Scientific12-550-15
MontagemediumSouthernBiotech0100-01
NaaldhouderFine Science Tools12501-13
OCT-compoundSakura Finetek4583
Oftalmische zalfBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethyleenbuisBD427401Binnendiameter: 0,28 mm
Penicilline & Streptomycine MixFisher Scientific15140-122
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)

Referenties

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

AAV-vectorenretrograde renale injectiegentherapie voor de niertransductie van de proximale tubulusCsCl AAVCU AAVmodellen voor nierziektenin vivo transductie
Effectieve en veilige genafgifte aan de nier van de muis via langzame retrograde injectie van nierbekken van adeno-geassocieerde virusvectoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.