Laminopathiestoornissen leiden vaak tot veranderingen in de nucleaire envelop, wat nucleaire blebbing en lekkage kan veroorzaken. Deze studie presenteert een immunofluorescentiemethode om de nucleaire lamina samen met dubbelstrengs DNA (dsDNA) te visualiseren, wat een middel biedt om de nucleaire structuur en integriteit in zoogdiercellen te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van nucleaire bloedingen en DNA-lekkage in zoogdiercellen door immunofluorescentie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De nucleaire lamina is een netwerk van filamenten onder het nucleaire membraan, samengesteld uit lamines en lamine-geassocieerde eiwitten. Het speelt een cruciale rol in nucleaire architectuur, positionering van nucleaire poriën, regulering van genexpressie, chromatine-organisatie, DNA-replicatie en DNA-reparatie. Mutaties in genen die betrokken zijn bij de expressie of posttranslationele verwerking van lamin-eiwitten resulteren in genetische aandoeningen die bekend staan als laminopathieën. In het bijzonder kunnen mutaties in de LMNA - of ZMPSTE24-genen leiden tot de accumulatie van onvolledig bewerkte vormen van lamin A die farnesyl- en methylgroepen behouden, die afwezig zijn in volledig verwerkt lamin A. Deze onvolledig verwerkte lamin A-eiwitten lokaliseren zich in het binnenste kernmembraan in plaats van de nucleaire lamina, waar rijpe lamin A zich bevindt. Verkeerd gelokaliseerde lamin-eiwitten verstoren de nucleaire functie en structuur ingrijpend, wat vaak resulteert in nucleaire blebbing. In ernstige gevallen kan een nucleaire ruptuur optreden, waardoor de compartimentering verloren gaat en het DNA in het cytosol lekt. Abnormale nucleaire structuur en compartimentalisatieverlies kunnen worden geïdentificeerd door indirecte immunofluorescentie (IF) op gefixeerde cellen. Deze studie schetst een dergelijke methode, waarbij specifieke antilichamen tegen een laminaat-eiwit en dubbelstrengs DNA (dsDNA) worden gebruikt om tegelijkertijd de nucleaire envelop en DNA te visualiseren. Deze aanpak maakt een snelle beoordeling mogelijk van de nucleaire structurele integriteit en de mogelijke lekkage van nucleair DNA in het cytosol.
Inleiding
De nucleaire lamina is een netwerk van filamenten dat ten grondslag ligt aan het kernmembraan en bestaat uit eiwitten die lamines worden genoemd. De nucleaire lamina speelt een essentiële rol in de nucleaire architectuur, de positionering van nucleaire poriën, de regulatie van genexpressie, de organisatie van chromatine, DNA-replicatie en DNA-reparatie 1,2,3. Mutaties in genen die een rol spelen bij de expressie van de lamin-eiwitten leiden tot genetische aandoeningen die laminopathieën worden genoemd3.
Restrictieve dermopathie (RD) is een ernstige laminopathieaandoening die voornamelijk wordt veroorzaakt door samengestelde heterozygote mutaties die voortijdige terminatiecodons creëren in het ZMPSTE24 gen4, wat leidt tot afwezigheid van het metalloprotease-ZMPSTE24. Deze laminopathie wordt gekenmerkt door intra-uteriene groeiachterstand, strakke, stijve huid, kleine mond, dun haar en botmineralisatiedefecten1. RD-patiënten leven meestal niet langer dan hun eerste levensweek als gevolg van longinsufficiëntie1. Twee andere laminopathiestoornissen die bekend staan als atypisch Hutchinson-Gilford Progeria-syndroom (AT-HGPS) en mandibuloacrale dysplasie type B (MAD-B) hebben betrekking op verminderde ZMPSTE24-expressie en worden geassocieerd met een kortere levensduur en vertonen overeenkomsten met vroegtijdige verouderingsstoornissen5. De ZMPSTE24 protease die bij deze laminopathieën wordt beïnvloed, is van vitaal belang bij de posttranslationele modificatie van lamin A, dat een cruciaal onderdeel is van de nucleaire lamina. ZMPSTE24 deficiëntie resulteert in de accumulatie van een onvolledig verwerkte gefarnesyleerde vorm van lamin A, bekend als prelamine A2.
Figuur 1: Lamin A-verwerking in normaal vs. RD-cellen. Lamin A-verwerkingsroute in normale cellen (links) en gewijzigde lamin A-verwerking in RD- of ZMPSTE-deficiënte cellen (rechts). Farnesyl (Fa) en methyl (Me) groepen zijn geïndiceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zoals te zien is in figuur 1, wordt bij normale lamin A-verwerking een farnesyl (lipide) groep gehecht aan een cysteïneresidu nabij de C-terminus, gevolgd door proteolytische splitsing van drie C-terminale aminozuren 3,6. Het cysteïneresidu wordt vervolgens gemethyleerd. Met deze twee modificaties kan prelamine A worden gericht op het binnenste kernmembraan2. ZMPSTE24 voert vervolgens een splitsingsreactie uit waarbij de laatste 15 C-terminale aminozuren, samen met de farnesyl- en methylgroepen, worden verwijderd om rijp Lamin A-eiwit te produceren, dat wordt afgeleverd aan de nucleaire lamina 6,7,8. In RD, AT-HGPS en MAD-B vindt de laatste stap van de verwerking niet effectief plaats omdat de ZMPSTE24 metalloproteïnase ontbreekt of niet volledig functioneert 8,9. Dit resulteert in de ophoping van prelamine A, dat permanent gefarnesyleerden gemethyleerd 9 blijft. Deze laatste groepen zorgen ervoor dat de prelamine A aan het binnenste kernmembraan blijft plakken in plaats van zich te lokaliseren naar de nucleaire lamina, waar volwassen laminaat A uiteindelijk zou moeten verblijven, zoals te zien is in figuur 1. ZMPSTE-deficiëntie heeft dus diepgaande effecten op een verscheidenheid aan nucleaire functies, samen met de nucleaire structuur10,11,12,13,14,15. Deze veranderingen in de nucleaire structuur kunnen nucleaire blebbing en zelfs nucleaire ruptie omvatten, wat kan resulteren in het lekken van DNA in het cytosol en het binnendringen van cytosol in de kern. Afwijkend gevormde kernen zijn inderdaad een kenmerk van laminopathiestoornissen, samen met tal van andere fenotypes die worden veroorzaakt door defecte prelamine A-verwerking 16,17. Defecten in de nucleaire lamina leiden tot een groot aantal schadelijke effecten, waaronder de verkeerde lokalisatie van de kwaliteitscontrole van nucleaire eiwitten en DNA-reparatie-eiwitten in het nucleoplasma, wat op zijn beurt resulteert in talrijke defecten in de nucleaire functie18. Het is belangrijk om een eenvoudige techniek te hebben die kan helpen bij het identificeren en monitoren van deze kenmerken van laminopathieën om onderzoek naar de ontwikkeling van therapeutische benaderingen gericht op het verbeteren van laminopathiefenotypes te vergemakkelijken. Voor muizen met laminopathieën is aangetoond dat de eliminatie van nucleaire blebbing correleert met de gegeneraliseerde eliminatie van laminopathiefenotypes16. Een techniek die het mogelijk maakt om de nucleaire integriteit in menselijke cellen te monitoren, zou de studie van mogelijke behandelingen voor het elimineren of aanzienlijk verbeteren van ziektefenotypes kunnen verbeteren.
Indirecte immunofluorescentie (IF) is een gevoelige en veelgebruikte techniek die zowel een primair niet-gelabeld antilichaam als een fluorofoor-gelabeld secundair antilichaam gebruikt dat het primaire antilichaam herkent om een interessant doelwit te detecteren19. IF-methoden kunnen een krachtig middel zijn voor het visualiseren van specifieke intracellulaire componenten en structuren. Het is ook mogelijk dat meer dan één secundair antilichaammolecuul een wisselwerking heeft met het primaire antilichaam, wat resulteert in versterking van het signaal19. Indirecte IF is een veelzijdige techniek die ook de detectie van meerdere primaire antilichamen met een relatief kleine set secundaire antilichamen mogelijk maakt, aangezien secundaire antilichamen worden verhoogd tegen het Fc-domein van het primaire antilichaam, dat geconserveerd is binnen soort19.
Dit artikel beschrijft een indirecte (IF) methode om nucleaire blebbing en DNA-lekkage te beoordelen in cellen met een tekort aan ZMPSTE24, waarbij antilichamen tegen dubbelstrengs DNA (dsDNA) en lamin B1 worden gebruikt om respectievelijk DNA en de nucleaire lamina te detecteren. Om het nut van deze aanpak aan te tonen, werd de procedure toegepast op een HeLa-cellijn met knock-out ZMPSTE24-expressie, evenals een HeLa-cellijn die ZMPSTE24 tot expressie brengt, en de resultaten voor de twee cellijnen werden vergeleken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Nadere gegevens over de gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van materialen
- Autoclaaf ten minste tien vierkante glazen dekglaasjes en pincet van 22 mm x 22 mm voordat de cellen op de dekglaasjes worden geplateerd.
2. Bereiding van de oplossingen
- Aangevulde media: Bereid 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine.
- Antilichaamverdunningsbuffer (ADB): Los 2 g runderserumalbumine (BSA) en 1 g visgelatine op in 80 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng tot 100 ml met PBS zodra BSA en visgelatine zijn opgelost.
- 1x PBS-Tween (PBS-T): Bereid 500 ml PBS en 0,5 ml tween voor. Plaats in een waterbad van 37 °C totdat Tween gemakkelijk in de oplossing kan worden gemengd.
3. Het kweken van de gewenste cellen
OPMERKING: HeLa-cellen werden in dit protocol gekweekt tot confluentie in een T75-kolf.
- Spuit zes dekglaasjes in met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen op een pluisvrij doekje. Plaats dekglaasjes in een steriele plaat met 6 putjes met behulp van een tang, één dekglaasje per putje.
- Voeg 2 ml gesupplementeerde DMEM toe aan elk putje in de plaat met 6 putjes.
- Zuig media uit de cellen en was de cellen door 15 ml PBS aan de kolf toe te voegen en zachtjes rond te draaien. Aspireer de PBS en voeg 2 ml trypsine-EDTA (trypsine) toe.
- Smeer de cellen in met trypsine en plaats de kolf gedurende 2 minuten terug in een bevochtigde incubator met 37 °C en 5 % CO2 , zodat de cellen van de kolf kunnen loskomen.
- Voeg 8 ml gesupplementeerde DMEM toe aan de kolf om de getrypsiniseerde cellen te verzamelen. Pipetteer een paar keer op en neer om klonterende cellen te scheiden. Vang de celsuspensie op in de kolf en plaats deze in een polystyreenbuis van 15 ml.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Voeg 500.000 cellen druppel voor druppel toe op elk van de dekglaasjes in de plaat met 6 putjes. Laat de cellen een nacht groeien bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde broedstoof.
4. Celfixatie en permeabilisatie
- Bereid de 4% formaldehyde-oplossing vers voor gebruik: Voeg 2 ml 37,5% formaldehyde-oplossing toe aan 18 ml PBS. Meng.
- Bereid de permeabilisatieoplossing vers voor gebruik: Voeg 100 μL Triton-X toe aan 20 ml PBS. Laat enkele minuten in een waterbad van 37 °C incuberen tot de Triton-X in de oplossing is opgelost. Meng.
- Zuig de media in de putjes van de plaat op. Was de cellen eenmaal met 2 ml PBS. Zuig alle PBS uit de putten.
- Voeg 2 ml 4% formaldehyde-oplossing toe aan elk putje. Laat 10 minuten staan bij kamertemperatuur (RT). Zuig 4% formaldehyde volledig uit de putten.
- Was de cellen 3 keer met 2 ml PBS. Verwijder PBS na elke wasbeurt volledig uit de putjes.
- Voeg 2 ml permeabilisatieoplossing toe aan elk putje. Laat 10 minuten zitten bij RT. Aspireer de permeabilisatieoplossing volledig aan.
- Was de cellen 3 keer met 2 ml PBS. Zuig PBS volledig op na de eerste twee wasbeurten en laat de PBS na de derde wasbeurt in de putjes zitten.
OPMERKING: Cellen kunnen na deze stap enkele weken in de laatste PBS-wasbeurt bij 4 °C worden bewaard, waarbij u ervoor zorgt dat de plaat is afgesloten met paraffinefilm om verdamping van vloeistof te voorkomen. Als de procedure kan worden voortgezet, kan deze stap worden overgeslagen.
5. Immunofluorescentie kleuring
- Verwijder alle PBS uit putten. Blokkeer cellen door 2 ml ADB aan elk putje toe te voegen en incubeer bij RT, schommelend gedurende 30 minuten.
- Tegen het einde van de blokkeringstijd van 30 minuten mengt u de primaire antilichaamverdunning in ADB (verdunning 1:1.000 voor zowel Lamin B1- als dsDNA-antilichamen, tabel 1). Voor elk dekglaasje is 75 μL nodig, daarom moet 600 μL ADB, 0,6 μL Lamin B primair antilichaam en 0,6 μL dsDNA-antilichaam worden gemengd voor zes dekglaasjes. Vortex grondig.
- Verwijder ADB uit de putjes. Plak op een plat oppervlak een stuk paraffinefilm af dat groot genoeg is om alle dekglaasjes die worden verwerkt neer te leggen.
- Voeg voor elk dekglaasje 75 μl primaire antilichaamverdunning toe aan de paraffinefilm en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de ADB worden gepipetteerd. Plaats vervolgens de dekglaasjes met de celzijde naar beneden met een tang op de druppel ADB.
- Dek de broeddekglaasjes af met het deksel van de putplaat en laat ze 1 uur incuberen bij RT.
- Verwijder de dekglaasjes met een tang van de paraffinefilm en plaats de dekglaasjes terug in de plaat met 6 putjes, met de celzijde naar boven.
- Was de dekglaasjes 3 keer met 2 ml PBS-T, elke keer 3-5 minuten schommelen. Verwijder alle PBS-T na elke wasbeurt uit de putjes.
- Bereid tijdens de laatste wasbeurt de verdunning van secundaire antilichamen voor (1:1.000 voor beide respectievelijke secundaire antilichamen, tabel 1). Voor elk dekglaasje is 75 μL nodig, daarom moet 600 μL ADB en 0,6 μL van beide secundaire Alexa Fluor-gelabelde antilichamen worden gemengd voor zes dekglaasjes. Vortex grondig. Bedek de verdunning van secundaire antilichamen zoveel mogelijk met licht.
| Antistof | Bron | Bedrijf | Referentie | ||
| dsDNA-marker antilichaam (HYB331-01) | Monoklonaal van de muis | Santa Cruz | SC-58749 | ||
| Geit anti-muis IgG (H+L) sterk gekruist geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor Plus 488 | Geit | ThermoFisher | A32723 | ||
| Geit anti-muis IgG (H+L) sterk gekruist geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor Plus 405 | Geit | Invitrogen | A31553 | ||
| Lamin B1 Polyklonaal Antilichaam | Konijn | Eiwit tech | 12987-1-AP | ||
| Geit anti-konijn IgG (H+L) sterk gekruist geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 594 | Geit | Invitrogen | A11037 | ||
Tabel 1: Antilichamen. Lijst van alle antilichamen die in dit protocol worden gebruikt.
- Verwijder alle PBS-T van de laatste wasbeurt. Incubeer de dekglaasjes in de secundaire antilichaamverdunning op de paraffinefilm, zoals in stap 5, gedurende 30 minuten bij RT. Bescherm tegen licht voor deze stap en alle resterende stappen. Een klein doosje kan worden gebruikt om licht af te schermen. Zorg ervoor dat u snel werkt wanneer dat nodig is om oplossingen uit de putten toe te voegen of te verwijderen.
- Verwijder de dekglaasjes met een tang van de paraffinefilm en plaats de dekglaasjes terug in de plaat met 6 putjes met de celzijde naar boven.
- Was de dekglaasjes 3 keer met 2 ml PBS-T. Verwijder alle PBS-T na elke wasbeurt uit de putjes.
- Dehydrateer de glaasjes met een ethanolserie (70%, 90%, 100%). Begin met het toevoegen van 2 ml 70% ethanol aan elk putje. Laat 1-2 minuten staan en verwijder alle ethanol uit de putjes. Herhaal met de overige ethanolpercentages.
- Verwijder de dekglaasjes met een tang uit de putjes en laat ze aan de lucht, beschermd tegen licht, drogen op een pluisvrij doekje.
- Monteer de celzijde van het dekglaasje naar beneden op glazen microscoopglaasjes met 20 μL montagemedium per dekglaasje. Laat een nacht drogen, beschermd tegen licht.
6. Beeldacquisitie
- Smeer voor het maken van de beeldvorming de randen van dekglaasjes in met een dun laagje doorzichtige nagellak (elk merk of type is voldoende). Laat aan de lucht drogen, beschermd tegen licht.
OPMERKING: De instructies voor het gebruik van een microscoop om een beeld te maken, zijn afhankelijk van de gebruikte microscoop. De resolutie van de camera op de microscoop die hier wordt gebruikt is 1280 x 960 pixels. Een vergelijkbare of betere resolutie is voldoende. - Voordat een objectglaasje op de microscooptafel wordt geplaatst, moeten de instellingen voor het opslaan van bestanden worden aangepast. Zet de microscoop aan en plaats een USB-station. Pas de opslaginstellingen aan binnen de microscoopinstellingen en zorg ervoor dat alle kanalen (GFP en RFP) afzonderlijk worden opgeslagen en dat de beelden naar de juiste locatie op de USB-drive gaan.
OPMERKING: Maak een map op de USB-drive en geef elk dekglaasje een eigen naam voor toekomstig gebruik. - Spuit voorafgaand aan de beeldvorming een pluisvrij doekje met 70% ethanol en maak de achterkant van de objectglaasjes voorzichtig schoon. Reinig de voorkant van de geleiders voorzichtig en zorg ervoor dat er zo min mogelijk druk wordt uitgeoefend.
- Plaats een schoon glaasje op de microscoop, dekglaasjes naar beneden gericht. Dek af met de lichtafschermingsdoos.
- Gebruik met behulp van een 40x objectieflens het juiste kanaal (RFP voor het lamin B1-antilichaam dat hier wordt gebruikt) om de kernen op het microscoopscherm te lokaliseren. Pas de lichtintensiteit aan tot ongeveer 50% om te beginnen.
- Om te controleren op oververzadigde gebieden, selecteert u de optie Kleur uit en zorgt u ervoor dat geen enkele gebied op het dekglaasje een rood signaal heeft in de zwart-witinstelling. Als er veel rood signaal is, verlaag dan de lichtintensiteit totdat het minimale rode signaal wordt weergegeven.
OPMERKING: Een rood signaal geeft oververzadiging aan. Als de kernen nauwelijks zichtbaar lijken, verhoog dan de intensiteit met stappen van 10% totdat een geschikte intensiteit is bereikt zonder oververzadiging. - Controleer alle andere dekglaasjes met dezelfde intensiteit om er zeker van te zijn dat ze niet oververzadigd zijn. Controleer alle dekglaasjes met het andere kanaal met behulp van hetzelfde proces als hierboven (GFP voor het dsDNA-antilichaam dat hier wordt gebruikt).
- Noteer de lichtintensiteit voor elk kanaal. Zorg ervoor dat alle lichtintensiteiten voor elk kanaal constant worden gehouden tijdens het beeldvormingsproces.
- Afbeelding elk dekglaasje afzonderlijk. Begin met het eerste kanaal, stel de kernen scherp en leg het beeld vast.
- Wissel voorzichtig van kanaal en breng de cellen weer in beeld. Wanneer u scherpstelt, legt u het beeld vast.
- Nadat u afbeeldingen hebt vastgelegd in de benodigde kanalen (GFP en RFP), selecteert u Overlay om de samengevoegde afbeelding te bekijken en ervoor te zorgen dat de dia niet bewoog tijdens het maken van de afbeelding. Als de kanalen elkaar niet overlappen, voert u het benodigde kanaal opnieuw uit totdat de afbeeldingen op één lijn liggen.
- Sla de afbeelding op door op het pictogram van de flashdrive te klikken. Ga naar een andere plaats op het dekglaasje om de beeldvorming voort te zetten.
NOTITIE: Zorg ervoor dat elke keer een ander gebied van het dekglaasje wordt afgebeeld om te voorkomen dat hetzelfde gebied herhaaldelijk wordt vastgelegd. Het wordt aanbevolen om in de linkerbovenhoek van het dekglaasje te beginnen met beeldvorming en in een "S"-patroon te bewegen om volledige dekking zonder duplicatie te garanderen.
7. Gegevensanalyse
- De gegevens die met deze methode worden verkregen, zijn visueel. Onderzoek de afbeeldingen op tekenen van DNA-lekkage of nucleaire blebbing. Voorbeelden van blebbing en lekkage worden getoond in de sectie representatieve resultaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze studie introduceert een IF-methode voor het visualiseren van de nucleaire lamina in combinatie met dubbelstrengs DNA (dsDNA). Zodra IF is uitgevoerd, kunnen de vastgelegde beelden worden onderzocht op tekenen van nucleaire blebbing en DNA-lekkage.
Figuur 2: Nucleaire bl...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gepresenteerde protocol bevat verschillende kritische stappen, waarvan de belangrijkste de behandeling van de gefixeerde cellen met primaire en secundaire antilichamen is. Zorgen voor het gebruik van een primair antilichaam van goede kwaliteit tegen het doelwit van interesse met een correct corresponderend secundair antilichaam met fluoroforen binnen het bereik van de gebruikte microscoop zal optimale resultaten opleveren19. De kwaliteit van het antilichaam ka...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institute on Aging grant R03AG064525 aan ASW. We willen Dr. Jason A. Stewart bedanken voor zijn hulp bij het mentorschap op het gebied van techniek en het Hui Chen-laboratorium voor het ter beschikking stellen van de gebruikte microscoop. We willen ook Fabio Martinon bedanken voor de HeLa-cellijnen die in deze experimenten zijn gebruikt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 22 mm Square Glass Coverslips | Propper Manufacturing Company | M8710 | Elke grootte of vorm kan worden gebruikt zolang ze op een standaard microscoopglaasje kunnen worden bevestigd. |
| 36.5% Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | Fixatiereagens. |
| 75 cm 2 Flacons | Corning | 430725U | Voor celcultuur. |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | Antilichaam verdunningsbuffer. |
| DMEM met 1 g/L glucose, L-glutamine & natriumpyruvaat | Corning | 10-014-CV | Voor celcultuur. |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2701 | Voor dehydratie van monsters voor montage, verdund om meerdere concentraties te maken. |
| EVOS FL Digital Inverted Fluorescerende Microscoop | Fisher Scientific | 12-563-460 | Beeldvorming. |
| Visgelatine | Sigma Aldrich | G7041 | Antilichaam verdunningsbuffer. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Montagemedium om fotobleken te voorkomen. |
| Parafilm (4 inch) | Fisher Scientific | 13-374-12 | Elke grootte kan worden vervangen, zolang de gebruikte dekglasjes passen. |
| Penicilline-Streptomycine | Gibco | 15-140-122 | Voor celcultuur. |
| Fosfaatbufferoplossing (PBS) | N/A | N/A | Gemaakt en gesteriliseerd in het laboratorium voor weefselkweek en oplossingen. |
| Premium Foetaal Rundserum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Voor celcultuur. |
| Superfrost Premium Microscoopglaasjes | Fisher Scientific | 12-544-7 | Elke standaard microscoopglaasjes kunnen worden gebruikt. |
| Weefselkweek behandelde 6-wel platen met platte bodem | Falcon | 353046 | Voor celcultuur. |
| TritonX-100 | Thermofisher Scientific | A16046.AP | Voor wassen. |
| Trypsine-EDTA (0,5%) | Gibco | 15-400-054 | Voor celcultuur. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | 9005-64-5 | Celpermeateringsreagens. |
Referenties
- Navarro, C. L., et al. New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update. Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).
- Dittmer, T. A., Misteli, T. The lamin protein family. Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).
- Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. The nuclear lamina comes of age. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).
- Navarro, C. L., et al. Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy. Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).
- Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity. Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).
- Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine. Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).
- Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. The post-translational processing of prelamin A and disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).
- Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment. Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).
- Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes. J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).
- Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease. Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).
- Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. When lamins go bad: Nuclear structure and disease. Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).
- Fong, L. G., et al. Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).
- Pendas, A. M., et al. Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice. Nat Genet. 31, 94-99 (2002).
- Goldman, R. D., et al. Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).
- Eriksson, M., et al. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nature. 423, 293-298 (2003).
- Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis. J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).
- Worman, H. J., Michaelis, S. Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging. Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).
- Pande, S., Ghosh, D. K. Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases. FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).
- Kumar, V. Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods. J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).
- Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology. STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).
- Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability. Sci Rep. 14, 6013(2024).
- Yu, L., Liu, P. Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).
- Odinammadu, K. O., et al. The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B. Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
