Beeldvorming van Ca2+ -signalen in kleine longaders bij fysiologische intraluminale druk

Yen-Lin Chen; Kyosuke Kazama; Vihaan Vattipally; Swapnil K. Sonkusare

doi:10.3791/67722

Methodenartikel

Beeldvorming van Ca²⁺ -signalen in kleine longaders bij fysiologische intraluminale druk

904 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67722

⸱

21 maart 2025

Yen-Lin Chen¹ , Kyosuke Kazama¹ , Vihaan Vattipally¹ , Swapnil K. Sonkusare¹^,²

¹Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, ²Department of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

In dit protocol presenteren we een nieuwe techniek voor het registreren en analyseren van Ca²⁺ -signalen in intrapulmonale aders (kleine longaders of PV's) bij fysiologische intraluminale druk. De techniek omvat het isoleren van kleine PV's, het incuberen ervan met een Ca²⁺ -indicator, het canuleren en onder druk zetten, confocale beeldvorming van Ca²⁺ -signalen en gegevensanalyse.

Samenvatting

Longaders (PV's) transporteren zuurstofrijk bloed van de longen terug naar het linkerhart en vervullen zo een belangrijke functie bij de afgifte van zuurstofrijk bloed aan vitale organen. De meeste onderzoeken naar pulmonale vasculatuur hebben zich echter gericht op longslagaders en haarvaten onder normale en ziekteomstandigheden. Ca²⁺ -signalen zijn kritische regulatoren van de vasculaire functie. Ondanks de kritieke fysiologische rol van PV's, zijn Ca²⁺ -signalen in kleine intrapulmonale PV's niet geregistreerd onder fysiologische omstandigheden. Hier beschrijven we een techniek om Ca²⁺ signaalactiviteit te registreren in PV's van muizen die geïsoleerd, gecanuleerd en onder druk staan bij 5 mmHg. Door een Ca²⁺ -indicator op te nemen, kunnen we Ca²⁺ -signalen in de myocytenlaag van kleine PV's bestuderen met behulp van confocale beeldvorming met hoge snelheid, draaiende schijven onder fysiologische omstandigheden. Onze representatieve gegevens geven aan dat de Ca²⁺ -signalen in kleine PV-myocyten worden gemedieerd door openingen van ryanodinereceptor-ionkanalen. Deze methode zal van groot belang zijn voor onderzoekers op het gebied van pulmonale vasculaire fysiologie en aandoeningen.

Inleiding

Het longvaatstelsel speelt een belangrijke rol bij het uitwisselen van gassen, het toevoegen van zuurstof en het verwijderen van kooldioxide uit het bloed ^1,2. Longslagaders (PA's) ontvangen zuurstofarm bloed uit het rechterhart. De gasuitwisseling vindt plaats ter hoogte van haarvaten (alveolaire haarvaten) en zuurstofrijk bloed wordt via longaders (PV's) naar het linkerhart gebracht. In tegenstelling tot andere aderen die zuurstofarm bloed vervoeren, hebben PV's een belangrijke functie bij het leveren van zuurstofrijk bloed aan het linkerhart en bijgevolg aan vitale organen in het lichaam. De signaalmechanismen die de PV-functie onder normale en ziekteomstandigheden reguleren, worden echter slecht begrepen.

Studies naar pulmonale vasculatuur hebben zich voornamelijk gericht op PA's en pulmonale capillairen. Recente studies tonen aan dat Ca²⁺-signalen in endotheel- en gladde spiercellagen cruciaal zijn bij het reguleren van de functie van PA's ^3,4,5. Bovendien zijn abnormale Ca²⁺-signaleringsmechanismen verantwoordelijk voor de verminderde functie van PA's en pulmonale capillairen bij ziektetoestanden 6,7,8,9,10. Studies naar intrapulmonale aders (kleine PV's) blijven echter schaars. Ectopische activiteit in grote PV's grenzend aan het linkerhart (cardiale PV's) is voorgesteld als een bron van atriumfibrilleren bij mensen^11,12, en spontane pulsatie¹³ en Ca²⁺-signalen 12,14,15 zijn ook aangetoond bij grote PV's. Kleine PV's leveren zuurstofrijk bloed aan grote PV's. Ca²⁺-signaleringsmechanismen in kleine PV's zijn echter niet bestudeerd onder fysiologische intraluminale druk.

In dit manuscript introduceren we een nieuwe methode voor het isoleren, kannuleren en onder druk zetten van kleine PV's en het afbeelden van Ca²⁺-signalen in PV-myocyten met behulp van confocale microscopie met hoge snelheid draaiende schijf. Het algemene doel van deze methode is het registreren van spontane en geïnduceerde Ca^2+-signalen in kleine PV-myocyten onder fysiologische intraluminale druk. Intraluminale druk speelt een cruciale rol bij het reguleren van Ca²⁺-signalen in myocyten¹⁶. Doorgaans worden PV's blootgesteld aan fysiologische intraluminale drukken variërend van 4 tot 10 mm Hg^17,18. Veranderingen in intraluminale druk tijdens de hartcyclus kunnen de Ca²⁺-signalen in PV-myocyten beïnvloeden. Daarom is het essentieel om een techniek te gebruiken waarmee we deze signalen onder fysiologische omstandigheden kunnen bestuderen en kunnen onderzoeken hoe variërende intraluminale drukken ze beïnvloeden. Bovendien heeft het meeste eerdere onderzoek naar PV's zich geconcentreerd op grotere cardiale PV's. De huidige techniek richt zich op kleine PV's die zich diep in de longen bevinden, wat relevanter kan zijn voor het begrijpen van de regulatie van de longfunctie bij zowel gezondheid als ziekte.

Protocol

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia (protocollen 4100 en 4120). C57BL6/J Muizen in de leeftijd van 10-12 weken worden geëuthanaseerd met pentobarbital (90 mg/kg; intraperitoneaal), gevolgd door cervicale dislocatie voor het oogsten van longweefsel 3,4,19,20.

1. Isolatie van kleine PV's

Reinig het dissectiegereedschap en de vaat met 100% ethanol, gevolgd door wassen met gedeïoniseerd water.
Gebruik een schaar om de borstholte te openen. Gebruik een tang om het hart en de longen voorzichtig uit de borstholte te verwijderen met minimale aanraking van de longen.
Leg het weefsel op een met Sylgard beklede plaat met koude (4-10 °C) HEPES-gebufferde fysiologische zoutoplossing (HEPES-PSS, in mM, 10 HEPES, 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl₂hexahydraat, 2 CaCl₂ dihydraat en 7 dextrose, pH aangepast aan 7,4 met behulp van 1 M NaOH)^3,4,19. Gebruik dissectiepennen om het hart en de longen vast te pinnen, zodat de grote PV's en PA's duidelijk zichtbaar zijn en de linkerkwab van de long iets uitgerekt is, zoals weergegeven in figuur 1.
Gebruik grote longaders (PV's) als referentiepunten en verwijder voorzichtig het weefsel rond de kleine intrapulmonale aders (kleine PV's, ongeveer 50-100 μm in diameter, aangegeven door de stippelige rechthoek in figuur 1) met een fijne schaar. Zorg ervoor dat u direct contact met de kleine PV's vermijdt. Isoleer de kleine PV's voorzichtig van het omringende weefsel.
Isoleer ongeveer 1-2 mm lange segmenten van kleine PV's. Plaats kleine PV's in 4-10 °C HEPES-PSS.

2. Laden van kleine PV's met een Ca²⁺ indicator

OPMERKING: Kleine PV's moeten voorzichtig worden behandeld en ervoor zorgen dat de tang alleen de uiteinden van de PV's raakt. Deze methode is een aanpassing van de eerder beschreven techniek 3,7,20,21.

Bereid een voorraadconcentratie voor van 2,5 mM Fluo-4 AM met DMSO ^3,4. Bereid met behulp van de bovenstaande voorraadoplossing 10 μM fluo-4 AM en 0,04% pluronzuur met HEPES-PSS.
Plaats kleine PV's in een buis van 1.5 ml met de laadoplossing (10 μM fluo-4 AM en 0.04% pluronzuur in HEPES-PSS)^3,4. Dek de buis af met aluminiumfolie en plaats deze in een waterbad voor incubatie bij 37 °C gedurende 1 uur.
Vervang na de incubatie de laadoplossing voorzichtig door HEPES-PSS van 4-10 °C en laat deze 30 minuten op ijs staan als wasstap.

3. Cannulatie van kleine PV's

OPMERKING: Deze methode is een wijziging van de eerder beschreven techniek ^3,20,21.

Bereid de drukmyografiekamer voor met twee glazen canules, één aan elke kant. Vul de canules met PSS (119 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂ 160 hexahydraat, 2,5 mM CaCl₂ dihydraat ^3,4,21,22, 7 mM dextrose en 24 mM NaHCO₃, op pH 7,4 gehouden door de oplossing te laten borrelen met 21% O₂ en 5% CO₂) met behulp van een spuit van 10 ml.
Verwijder een kleine PV uit de wasoplossing en plaats deze in de drukmyografiekamer. Gebruik een tang met fijne punt om voorzichtig het ene uiteinde van de kleine PV op een van de canules te cannuleren. Leg vervolgens met behulp van een microfilament gemaakt van nylondraad een knoop rond het gecanuleerde uiteinde van de kleine PV en de punt van de canule om deze vast te zetten.
Duw de PSS voorzichtig door de canule om het bloed in de PV te verwijderen. Gebruik nylondraad om het andere uiteinde af te binden met een glazen canule met behulp van microfilamenten, zoals weergegeven in afbeelding 1.

4. Drukregeling en Ca²⁺ beeldvorming van kleine PV

OPMERKING: Deze methode is een wijziging van de eerder beschreven techniek ^3,21.

Gebruik een servodrukregelaar die is bevestigd aan een slang die PSS bevat, zet de kleine PV vanaf het ene uiteinde onder druk bij 5 mm Hg. Gebruik een peristaltische pomp die is aangesloten op zowel een inlaat als een uitlaat om de PSS te overfuseren. Houd de temperatuur van het superfusaat op 37 °C.
Na de equilibratieperiode kunt u Ca²⁺ beelden maken voor 1000 frames (framesnelheid: 30 frames per seconde) met behulp van het 40x waterdompelobjectief (NA 0.8) en een confocaal beeldvormingssysteem van een draaiende schijf. Exciteer Fluo-4 met behulp van een 488 nm solid-state laser en vang uitgezonden fluorescentie op met behulp van een 525/36 nm banddoorlaatfilter.
Breng de ryanodinereceptor (RyR)-antagonist ryanodine (5 μM)^21,23 aan op het superfusaat. Wacht 5 minuten. Maak de Ca²⁺-foto's opnieuw zoals hierboven beschreven en leg nog eens 1000 frames vast met een snelheid van 30 frames/s.

5. Ca²⁺ beeldanalyse

OPMERKING: Deze methode is een wijziging van de eerder beschreven techniek 21,22,24. Veranderingen in de activiteit van Ca²⁺-signalen in PV-myocyten kunnen belangrijke inzichten verschaffen in de remming of versterking van de excitatie-contractiekoppeling in PV's.

Gebruik op maat ontworpen software (ontwikkeld door Dr. Adrian Bonev, https://github.com/vesselman/SparkAn) om Ca²⁺ beelden te analyseren.
Vloeiende beelden met behulp van 5 x 5 boxcar filter en 5 x 5 mediaan filter. Gebruik een frame dat een plat PV-gebied schetst met meerdere cellen voor automatische detectie van gebeurtenissen.
Klik op Weergave en automatische detectie van gebeurtenissen. Gebruik de volgende instellingen: gebeurtenisdrempel bij een amplitude van 1.3 F/F₀, tolerantie van 20%, scanbox van 7 x 7 pixels en een lopend gemiddelde van 7 afbeeldingen. Genereer automatisch gemiddelde afbeeldingen om de 10 afbeeldingen, beginnend bij de eerste afbeelding.
Klik op Start Search (het oogpictogram). Zoek de gebeurtenistabel die is opgeslagen als een Bestand markeren onder het menu Bestand. Om gebeurtenissen per μm² te berekenen, deelt u het aantal gedetecteerde Ca²⁺ -signalen door de oppervlakte van het geselecteerde frame.

Resultaten

Figuur 2A toont een gezichtsveld van een kleine PV bij 5 mm Hg intraluminale druk. De +-symbolen geven de automatisch gedetecteerde Ca²⁺-signalen aan binnen een geselecteerd frame (Video 1), aangegeven door de groene omtrek. Van elke PV werd één gezichtsveld geregistreerd en van elke muis werd één PV gebruikt. Eén kleine PV werd beschouwd als n=1. Het aantal Ca²⁺-signalen per μm^{, 2}per minuut werd vergeleken vóór en 5 minuten na de toevoeging van RyR-remmer ryanodine (5 μM)²³ in gepaarde experimenten. Een gepaarde t-toets werd gebruikt voor statistische vergelijkingen om significante verschillen te detecteren. Het aantal spontaan optredende Ca²⁺ signalen was 0,73 ± 0,2 gebeurtenissen per minuut per μm²(Figuur 2B,C) onder de hierboven beschreven omstandigheden. Behandeling met ryanodine remde de Ca²⁺-signalen in kleine PV's bijna volledig (Figuur 2C, Video 2), zoals blijkt uit een drastische vermindering van gebeurtenissen per minuut per μm². Deze gegevens tonen aan dat spontane activiteit van Ca²⁺-signalen in de myocytenlaag van kleine PV's onder druk openingen van RyR's vertegenwoordigt. Deze resultaten leveren bewijs dat de activiteit van Ca²⁺-signalen kan worden bestudeerd in kleine PV's onder fysiologische intraluminale druk. Deze methode zal toekomstige studies naar de effecten van intraluminale druk en neurohumorale mediatoren op Ca²⁺-signalering in kleine PV-myocyten vergemakkelijken, wat mogelijk waardevolle inzichten kan bieden in de regulatie van de PV-functie. Hoewel de huidige studie zich richt op het aantal RyR Ca²⁺-signalen, is het ook mogelijk om de kinetische eigenschappen van deze signalen te analyseren, waaronder duur, amplitude, ruimtelijke spreiding en stijgtijd. Begrijpen hoe fysiologische en pathologische stimuli de kinetische eigenschappen van RyR Ca²⁺-signalen beïnvloeden, kan belangrijke informatie opleveren over de regulatie van de PV-functie in zowel gezonde als zieke toestanden.

figure-results-1
Figuur 1: Bereiding en Ca²⁺ beeldvorming van PV's. Sequentiële beelden die de identificatie en isolatie van kleine PV's, incubatie van fluo4-AM, cannulatie en drukregeling (5 mm Hg), draaiende schijf high-speed confocale beeldvorming en beeldanalyse tonen. De stippellijnige rechthoek in de afbeelding links staat voor de PV die voor het onderzoek is gebruikt. Afkortingen: PA = longslagader; RA = rechter atrium; PV = longader; LA = linker atrium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Analyse van Ca²⁺ beeldvorming. (A) Beelden van een gezichtsveld van een onder druk (5 mm Hg), fluo-4 geladen, kleine PV in afwezigheid (links) of aanwezigheid van ryanodine (5 μM; RyR-remmer, rechts). De groene rechthoek geeft het gebied aan dat is geselecteerd voor automatische detectie van Ca^2+- signalen. De +-tekens geven automatisch gedetecteerde gebeurtenissen binnen het frame aan. Rode tekens geven signalen aan met een oppervlakte van minder dan 3000 μm², terwijl blauwe borden signalen aangeven die een gebied van meer dan 3000 μm² innemen. Elk + teken geeft één Ca²⁺ gebeurtenis of sein aan. (B) F/F0 sporen van gedetecteerde gebeurtenissen uit het geselecteerde gebied aangegeven in A, die de activiteit tonen van Ca²⁺ -signalen in de myocytenlaag van kleine PV's onder druk onder basale omstandigheden (links) en in aanwezigheid van ryanodine (rechts). (C) Kwantificering van gebeurtenissen per minuut per μm² van Ca²⁺ signalen in kleine PV's voor en na de toevoeging van ryanodine (1 PV per muis; n=6 muizen; **p < 0,01 versus basaal; gepaarde t-toets). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Filmpje 1: Ca²⁺ signalen in een kleine PV onder druk gezet bij 5 mm Hg voor behandeling met ryanodine. Het gezichtsveld vertegenwoordigt het geselecteerde frame, weergegeven in groene kleur in afbeelding 2. Klik hier om deze video te downloaden.

Filmpje 2: Ca²⁺ signalen in een kleine PV onder druk bij 5 mm Hg na behandeling met ryanodine (5 μM). Het gezichtsveld vertegenwoordigt het geselecteerde frame, weergegeven in groene kleur in afbeelding 2. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Ca²⁺ signalen in gladde spiercellen spelen een cruciale rol bij het reguleren van de vasculaire functie²⁵. PV's zijn een belangrijk maar relatief onderbelicht vaatbed dat verantwoordelijk is voor de afgifte van zuurstofrijk bloed aan het linkerhart²⁶. Ca²⁺ signaleringsmechanismen in kleine PV's en hun impact op de fysiologische functie zijn echter onbekend. Het doel van dit manuscript is om een nieuwe methode te beschrijven voor het isoleren, kannuleren en onder druk zetten van kleine PV's om Ca²⁺ -signalen in de myocytenlaag op te nemen en deze Ca²⁺ -signalen te analyseren. De mogelijkheid om Ca²⁺ -signalen in kleine PV's te visualiseren, kan ons helpen beter te begrijpen hoe deze signalen werken onder normale en zieke omstandigheden. Hoewel het bestuderen van Ca²⁺ -signalen in PV's in de intacte long fysiologisch relevantere gegevens zou opleveren, zijn kleine PV's niet duidelijk zichtbaar in de intacte long, wat technische uitdagingen kan opleveren bij het laden van Ca²⁺ -kleurstoffen en confocale beeldvorming. Het isoleren en onder druk brengen van kleine PV's biedt een alternatieve manier om Ca²⁺ -signalen waar te nemen onder fysiologische intraluminale druk, temperatuur en ionische oplossingen.

Ca²⁺ beeldvorming van PV's beschreven in dit manuscript is gebaseerd op onze gevestigde procedure voor Ca²⁺ beeldvorming in systemische slagaders 21,22,27. De gegevens geven aan dat de meerderheid van de Ca^2+-signalen in kleine PV-myocyten te wijten zijn aan openingen van RyR-ionkanalen. Daarom zal het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, toekomstige studies mogelijk maken naar RyR-regulatie en de impact ervan op de PV-functie onder normale omstandigheden en bij ziekten. RyR2-activiteit is essentieel voor contracties in cardiale myocyten²⁸, terwijl het in arteriële gladde spiercellen in verband is gebracht met ontspanning²⁹. Het precieze effect van RyR-activiteit op kleine PV-contractie blijft onbekend. Drukmyografie is een veelgebruikte techniek voor het monitoren van veranderingen in de samentrekking van kleine bloedvaten. Daarom is het waarschijnlijk dat PV-preparaat onder druk ook kan worden gebruikt om kleine PV-contracties te monitoren.

Ryanodine vertoont concentratieafhankelijke effecten op de RyR-activiteit, waardoor deze toeneemt bij submicromolaire concentraties en afneemt bij micromolaire concentraties²³. Ryanodine kan ook een indirect remmend effect hebben op andere Ca²⁺ -signalen in kleine PV's, een mogelijkheid die niet is getest. Bij de gebruikte concentratie zagen we geen compenserende toename van Ca²⁺ -signalen in PV's. De regulatie van Ca²⁺ -signalen in geïsoleerde en onder druk staande PV's kan verschillen van die in PV's in een intacte long, een mogelijkheid die nog moet worden onderzocht. Het registreren van Ca²⁺ -signalen in kleine PV's in de intacte long van een verdoofde muis brengt echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee, die voortkomen uit de locatie van de long in de borstholte en de moeilijkheid om een Ca²⁺ -indicator selectief te laden in PV's in een verdoofde muis.

Het is bekend dat schuifspanning van de bloedstroom de functie van bloedvaten verandert. Hoewel de huidige methode het mogelijk maakt om het effect van intraluminale druk op Ca²⁺ -signalen in kleine PV's te isoleren, is het ontbreken van stroming of schuifspanning een mogelijke beperking. Stromings- of schuifspanning kan echter eenvoudig worden opgenomen en uitgevoerd in combinatie met Ca²⁺ -beeldvorming met behulp van eerder beschreven opstellingen²¹. Het is mogelijk dat stromings-/schuifspanning de activiteit van Ca²⁺ -signalen in kleine PV's wijzigt, wat een interessant onderwerp zou zijn voor toekomstig onderzoek.

We gebruikten fluo-4-AM als een Ca²⁺ indicator om Ca²⁺ signalen in kleine PV's op te nemen. Afhankelijk van de experimentele behoeften zou het mogelijk moeten zijn om andere Ca²⁺ indicatoren te gebruiken die kunnen worden geëxciteerd bij 488 nm (Calbryte 520 AM)⁷ of 560 nm (Calbryte 590 AM)³⁰. Het gebruik van een confocaal beeldvormingssysteem met draaiende schijf maakt beeldvorming van Ca^2+- signalen mogelijk, met name in PV-myocyten. Hoewel niet bestudeerd in de huidige studie, zal focus op de endotheelcellaag het mogelijk maken om endotheliale Ca²⁺ -signalen in kleine PV's op te nemen. PA's en PV's zijn functioneel verschillend en worden blootgesteld aan verschillende micro-omgevingen. Daarom kan een vergelijking van myocyt- en endotheliale Ca²⁺ -signalen tussen kleine PA's en kleine PV's cruciale inzichten verschaffen in hun functionele verschillen.

Het is aannemelijk dat Ca²⁺ signalen in kleine PV's de stroom van zuurstofrijk bloed door PV's reguleren. De druk in het linker atrium verandert tijdens elke hartcyclus van 4 mmHg naar 12 ^mmHg ^17,18. Aangezien PV's bloed naar het linker atrium voeren, is het waarschijnlijk dat de druk in de PV's ook verandert tijdens de hartcyclus. Eerdere studies hebben aangetoond dat RyR's kunnen worden geactiveerd door intraluminale druk in kleine slagaders¹⁶. Daarom kan het meten van het effect van intraluminale druk op PV Ca²⁺-signalen nieuwe inzichten opleveren in de afgifte van zuurstofrijk bloed van PV's naar het linkerhart. Zenuwstimulatie en humorale mediatoren in de bloedbaan kunnen ook gladde spieren Ca²⁺ signalen activeren. De huidige methode zal toekomstige studies naar de impact van neurohumorale mediatoren op PV Ca²⁺ signalen en PV-functie vergemakkelijken.

Er zijn een paar cruciale stappen binnen het protocol die moeten worden uitgevoerd. Een zorgvuldige dissectie van longaders (PV's) is uiterst belangrijk. Het is van cruciaal belang om het beeldvormingsgebied van de PV's niet aan te raken met dissectie-instrumenten, omdat dit een negatieve invloed kan hebben op hun gezondheid. Alleen de uiteinden van de PV's mogen worden aangeraakt. Het verkorten van de dissectietijd kan het slagingspercentage vergroten. Onvoldoende kleurstofbelasting kan resulteren in een lagere signaal-ruisverhouding en de kans op valse positieven vergroten tijdens automatische detectie van gebeurtenissen. Het volgen van het hier beschreven protocol moet zorgen voor voldoende kleurstofbelasting in PV-myocyten.

Samenvattend hebben we een methode gepresenteerd voor het registreren van Ca²⁺ signalen in kleine PV's, die het mogelijk maakt om Ca²⁺ signaleringsmechanismen te onderzoeken in dit belangrijke maar vaak over het hoofd geziene vaatbed. Belangrijk is dat het vermogen om Ca²⁺ -signalen in kleine PV's onder normale omstandigheden op te nemen, een waardevol begrip kan bieden van pathologische mechanismen voor longziekten, waaronder pulmonale hypertensie, longbeschadiging en door hartfalen geïnduceerd longoedeem.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door prijzen van de NHLBI (HL167208, HL157407 en HL146914) aan SKS en NIDDK (DK138271) aan YLC.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Custom-Designed SparkAn Software	University of Vermont		https://github.com/vesselman/SparkAn
Fluo-4, AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FN1 Upright Microscope	Nikon
Heater/Temperature Controller	Warner Instruments
Imaging System	Andor
iQ 3.x acquisition Software	Andor
iXon EMCCD Cameras	Andor
Nylon Thread for Tying Blood Vessels	Living Systems Instrumentation	THR-G
Pressure Myography Chamber	Instrumentation and Model Facility, University of Vermont, Burlington, VT, USA
Revolution WD (with Borealis) High Speed Spinning Disk Confocal Imaging System	Andor
Ryanodine	Bio-Techne	1329
Servo Pressure Controller	Living Systems Instrumentation
SS Dissection Pins, 0.2mm dia	Living Systems Instrumentation	PIN-0.2mm
Tubing Pump REGLO	ISMATEC	ISM4212

Referenties

Suresh, K., Shimoda, L. A. Lung circulation. Compr Physiol. 6 (2), 897-943 (2016).
Sundjaja, J. H., Bordoni, B. Thorax, heart pulmonic valve. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).
Daneva, Z., et al. Caveolar peroxynitrite formation impairs endothelial TRPV4 channels and elevates pulmonary arterial pressure in pulmonary hypertension. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (17), e2023130118(2021).
Daneva, Z., et al. Endothelial pannexin 1-TRPV4 channel signaling lowers pulmonary arterial pressure in mice. Elife. 10, e67777(2021).
Kuhr, F. K., Smith, K. A., Song, M. Y., Levitan, I., Yuan, J. X. New mechanisms of pulmonary arterial hypertension: role of Ca2+ signaling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (8), H1546-H1562 (2012).
Sonkusare, S. K., Laubach, V. E. Endothelial TRPV4 channels in lung edema and injury. Curr Top Membr. 89, 43-62 (2022).
Kuppusamy, M., et al. Purinergic P2Y2 receptor-induced activation of endothelial TRPV4 channels mediates lung ischemia-reperfusion injury. Sci Signal. 16 (808), eadg1553(2023).
Alvarez, D. F., et al. Transient receptor potential vanilloid 4-mediated disruption of the alveolar septal barrier: a novel mechanism of acute lung injury. Circ Res. 99 (9), 988-995 (2006).
Balakrishna, S., et al. TRPV4 inhibition counteracts edema and inflammation and improves pulmonary function and oxygen saturation in chemically induced acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (2), L158-L172 (2014).
Suresh, K., et al. Reactive oxygen species induced Ca2+ influx via TRPV4 and microvascular endothelial dysfunction in the SU5416/hypoxia model of pulmonary arterial hypertension. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (5), L893-L907 (2018).
Haissaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. N Engl J Med. 339 (10), 659-666 (1998).
Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circ Res. 114 (9), 1483-1499 (2014).
Brunton, T. L., Fayrer, J. XXII Note on independent pulsation of the pulmonary veins and vena cava. Proc R Soc Lond. 25, 174-176 (1877).
Namekata, I., et al. Involvement of the Na(+)/Ca(2+) exchanger in the automaticity of guinea-pig pulmonary vein myocardium as revealed by SEA0400. J Pharmacol Sci. 110 (1), 111-116 (2009).
Cros, C., et al. Regional differences in Ca2+ signaling and transverse-tubules across left atrium from adult sheep. Int J Mol Sci. 24 (3), 2347(2023).
Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20 (4), 307-316 (2013).
Nair, R., Lamaa, N. Pulmonary capillary wedge pressure. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).
Fukuta, H., Little, W. C. The cardiac cycle and the physiologic basis of left ventricular contraction, ejection, relaxation, and filling. Heart Fail Clin. 4 (1), 1-11 (2008).
Daneva, Z., et al. Endothelial IK and SK channel activation decreases pulmonary arterial pressure and vascular remodeling in pulmonary hypertension. Pulm Circ. 13 (1), e12186(2023).
Marziano, C., et al. Nitric oxide-dependent feedback loop regulates transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel cooperativity and endothelial function in small pulmonary arteries. J Am Heart Assoc. 6 (12), e007157(2017).
Chen, Y. L., et al. Novel smooth muscle Ca2+-signaling nanodomains in blood pressure regulation. Circulation. 146 (7), 548-564 (2022).
Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336, 597-601 (2012).
Arias-Cavieres, A., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium release has a key role in hippocampal LTD induction. Front Cell Neurosci. 12, 403(2018).
Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. J Vasc Res. 58 (3), 159-171 (2021).
Ottolini, M., Sonkusare, S. K. The calcium signaling mechanisms in arterial smooth muscle and endothelial cells. Compr Physiol. 11 (2), 1831-1869 (2021).
Boyette, L. C., Burns, B. Physiology, pulmonary circulation. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).
Ottolini, M., et al. Local peroxynitrite impairs endothelial transient receptor potential vanilloid 4 channels and elevates blood pressure in obesity. Circulation. 141 (16), 1318-1333 (2020).
Shan, J., et al. Phosphorylation of the ryanodine receptor mediates the cardiac fight or flight response in mice. J Clin Invest. 120 (12), 4388-4398 (2010).
Knot, H. J., Standen, N. B., Nelson, M. T. Ryanodine receptors regulate arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat via Ca2+-dependent K+ channels. J Physiol. 1 (Pt 1), 211-221 (1998).
Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), 11377-11382 (2015).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Calciumsignalen intraluminale druk spinning disk confocale microscopie drukmyografie ryanodine receptor Fluo 4 AM longadere van muis vasculaire fysiologie calciumimaging

Beeldvorming van Ca2+ -signalen in kleine longaders bij fysiologische intraluminale druk