Methodenartikel

Verbeterde methodologie voor het bestuderen van postnatale osteogenese via intramembraneuze ossificatie in een beenmergletselmodel bij muizen

DOI:

10.3791/67727

⸱

7 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beenmergletselmodel bij muizen is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van postnatale osteogenese door middel van intramembraneuze ossificatie. Dit vereenvoudigde chirurgische protocol beschrijft de beenmergablatieprocedure voor stroomafwaartse beoordeling van nieuwe botvorming en cellulaire reacties na verwonding.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschadigingen van lange botten genezen via endochondrale of intramembraneuze botvormingsroutes. In tegenstelling tot de endochondrale route die een kraakbeensjabloon vereist, omvat het proces van intramembraneuze ossificatie de directe omzetting van skeletstam- en voorlopercellen (SSPC's) in botvormende osteoblasten. Er zijn beperkte chirurgische methoden om dit proces bij experimentele muizen te modelleren. Hier hebben we een beenmergletselmodel bij muizen verbeterd om de studie van botherstel via intramembraneuze ossificatie te vergemakkelijken en om postnatale regulatoren van osteogenese te beoordelen. Deze methode is zeer reproduceerbaar en gebruiksvriendelijk en maakt temporele beoordeling van nieuwe botvorming mogelijk in een korte periode (3-7 dagen na het letsel) met behulp van microcomputertomografie (μCT) en histologie van bevroren secties. Bovendien kunnen de bijdragen van SSPC's en rijpe osteoblasten gemakkelijk worden beoordeeld met behulp van een combinatie van fluorescerende reportermuizen en dit intramembraneuze beenmergletselmodel. In klinische contexten is intramembraneuze botvorming relevant voor het genezen van kritieke groottedefecten, gestabiliseerde fracturen, corticale defecten, trauma door tumorresecties en gewrichtsvervangingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Letsels aan lange botten genezen via de endochondrale of intramembraneuze botvormingsroute. In tegenstelling tot de endochondrale route, waarvoor een voorloper van het kraakbeen nodig is, omvat botherstel via intramembraneuze ossificatie directe omzetting van skeletstam- en voorlopercellen (SSPC's) in botvormende osteoblasten1. Klinisch gezien is dit proces relevant voor botgenezing in verschillende contexten, waaronder kritieke groottedefecten, gestabiliseerde fracturen, corticale defecten, afleidingsosteogenese, trauma door tumorresecties en osseo-integratie van gewrichtsvervangende implantaten 2,3. Interessant is dat in onderzoeken bij patiënten met lange botbreuken 66%-82% verplaatste fracturen had, waarvoor fixatieapparaten nodig waren om het bot te stabiliseren 4,5. Deze stijf gestabiliseerde botten genezen voornamelijk door intramembraneuze ossificatie omdat de gebroken botuiteinden in direct contact met elkaar komen 6,7. Toch blijft de mechanistische regulatie van intramembraneuze botregeneratie relatief onderbelicht in vergelijking met botvorming via de endochondrale routes. Door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde therapieën om botgenezing te verbeteren, worden gehinderd door beperkte klinische werkzaamheid en hoge kosten en gaan gepaard met aanzienlijke nadelige effecten8.

Mechanische beenmergablatie biedt een waardevol model voor het bestuderen van intramembraneuze botvorming. Dit eenvoudige letselmodel maakt het mogelijk om botregeneratie in het beenmerg te bestuderen zonder het corticale bot te verstoren. Na BM-ablatie omvat het genezingsproces verschillende maar overlappende fasen. De beginfase vindt plaats in de eerste 1 tot 5 dagen en omvat stolselvorming en ontsteking, waarbij ontstekingscellen en cytokinen genezing initiëren. Van dag 3 tot 14 wordt de tweede fase gekenmerkt door regeneratie, waaronder neovascularisatie, migratie en proliferatie van mesenchymale stamcellen (MSC), osteoblastische differentiatie en vorming van geweven botten. De laatste remodelleringsfase begint ongeveer 10 dagen na de operatie, waarbij botweefsel wordt gerijpt en geherstructureerd totdat het beenmerg op dag 569 volledig is hersteld. Deze tijdlijn voor snelle genezing maakt het BM-ablatiemodel ideaal voor het bestuderen van vroege botherstelreacties, met name tijdens de kritieke perioden van ontsteking, rekrutering van voorlopercellen en differentiatie van osteoblasten. Met behulp van technieken zoals histologie, flowcytometrie en kwantitatieve μCT-analyse kunnen cellulaire responsen en botvorming in vroege herstelstadia worden geëvalueerd. Met behulp van de bovengenoemde technieken kan het BM-ablatiemodel inzicht geven in mechanismen van intramembraneuze botregeneratie en helpen bij het identificeren van belangrijke therapeutische doelen voor het verbeteren van botgenezing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende procedures zijn uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het University of Connecticut Health Center. Alle operaties werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden, zoals uiteengezet in de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH). Pijn en het risico op infecties werden behandeld met de juiste analgetica en antiseptica om een succesvol resultaat te garanderen.

1. Voorbereiding van het operatiegebied en de instrumenten

  1. Bereid de operatiekamer voor door werkoppervlakken te desinfecteren met een desinfecterende reiniger van klinische kwaliteit.
    OPMERKING: De chirurg moet de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen, waaronder steriele wegwerphandschoenen, een haarmuts, een jas en een masker.
  2. Bereid een verwarmingskussen voor dat bedekt is met een steriel chirurgisch kussen. Verzamel en rangschik alle steriele instrumenten en reagentia (Materiaaltabel) met gemakkelijke toegang.

2. Preoperatieve anesthesie

  1. Weeg alle muizen voor de operatie. Bereken de te gebruiken hoeveelheden pijnstillers op basis van de beschikbare formulering van buprenorfine.
  2. Monteer een anesthesie-eenheid voor dieren in de steriele werkruimte, die een inductiekamer en een neuskegel omvat. Stel de zuurstofafgifte in op 2 L min-1 en isofluraan op 1,5-3% (v/v), afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van de muis.
  3. Zodra de muis verdoofd is, haalt u het dier uit de inductiekamer en plaatst u het in rugligging op een steriel chirurgisch kussen. Breng oogheelkundig glijmiddel aan op beide ogen. Plaats de neuskegel over het hoofd. Controleer of de muis voldoende verdoofd is door voorzichtig in de teen te knijpen. Zorg ervoor dat er geen reflexreactie van de achterpoot is voordat u verder gaat.
  4. Verwijder voorafgaand aan de operatie de muis kort uit de neuskegel om de totale dosis buprenorfine met verlengde afgifte via de subcutane route te injecteren; De totale dosis is 3,25 mg/kg.

3. Beschrijving van de chirurgische procedure

OPMERKING: Bij deze chirurgische ingreep worden C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen van 10 weken tot 24 weken gebruikt. De procedure kan worden uitgevoerd op muizen vanaf 6 weken tot 33 weken oud en op verschillende ingeteelde stammen, zoals aangetoond door anderen10,11. Jongere muizen kunnen kortere naaldlengtes nodig hebben, terwijl oudere of grotere muizen een langere naald nodig kunnen hebben.

  1. Vul een spuit van 3 ml uitgerust met een naald van 26 G met steriele zoutoplossing. Leg dit opzij.
  2. Verwijder de vacht van de achterpoot waarop de procedure zal worden uitgevoerd met elektrische of op batterijen werkende tondeuses (#40 mes) en verwijder eventuele losse vacht uit het operatieveld. Gebruik steriele applicators met wattenstaafjes en behandel de operatieplaats met een scrub op basis van jodium (10% povidon-jodium), gevolgd door 70% isopropylalcohol. Schrob de operatieplaats vanaf het midden van de knie en maak een cirkelvormige zwaai naar buiten. Laat de site drogen. Herhaal de schrobstappen 3 keer.
  3. Plaats de muis op zijn rug en buig de knie van het operatiebeen. Houd het been van de muis in de niet-dominante hand, zodat de knie over de middelvinger gebogen is, de tweede vinger op het dijbeen rust en de duim op het scheenbeen.
  4. Maak een kleine, ondiepe horizontale incisie net onder de patella met behulp van een scalpel.
    OPMERKING: Met deze stap verbetert u de visualisatie van de invoegplaats. Met ervaring kan deze stap worden overgeslagen.
  5. Lokaliseer de gewrichtsruimte door de naald horizontaal over de gebogen knie te plaatsen en de ruimte tussen het dijbeen en het scheenbeen te voelen. Gebruik deze anatomische plaats als geleiding, neem een naald van 25 G en boor handmatig (door de naald te draaien en tegelijkertijd matige druk op de naald uit te oefenen) in het distale dijbeen van de knie naar de proximale zijde. Steek de naald door of rond de patella.
  6. Röntgenfoto van de muis om er zeker van te zijn dat de naald op de juiste manier in de mergholte is geplaatst, zo dicht mogelijk bij het midden (Figuur 1).
  7. Verwijder de naald van 25 G en steek onmiddellijk een naald van 26 G in hetzelfde gat in de mergholte. Ruim de zijkanten van de mergholte minstens 5 keer in een cirkelvormige beweging totdat deze glad aanvoelt. Houd het aantal ruimbewegingen consistent tussen elke muis.
    OPMERKING: Stappen 3.5 en 3.7 kunnen prikaccidenten veroorzaken bij de chirurg als ze niet zorgvuldig worden behandeld.
  8. Verwijder de 26 G-naald en vervang de 26 G-naald die is aangesloten op de zoutoplossing. Spoel de holte door totdat de terugstroming vrij is. Dit vereist meestal 1,5-2 ml zoutoplossing. Verwijder de spuit en naald en gooi ze veilig weg in een scherpe container.
    OPMERKING: Er mag geen weerstand zijn bij het duwen van de vloeistof. Als dit het geval is, plaatst u de naald opnieuw om er zeker van te zijn dat deze zich in de holte bevindt. Het kan nodig zijn om de naald er half uit te trekken.
  9. Sluit de huidwond met behulp van een topische hechtdraad.

4. Postoperatieve zorg

  1. Dien onmiddellijk na de operatie de resterende halve dosis buprenorfine met verlengde afgifte toe met behulp van de dosering uit stap 2.4.
    OPMERKING: Buprenorfine met verlengde afgifte biedt pijnverlichting tot 72 uur.
  2. Houd de dieren op het verwarmingskussen in de gaten op tekenen van normale, onbelemmerde ademhaling totdat ze ontwaken uit de operatie. Eenmaal ambulant, breng je de muizen terug naar hun kooi.
  3. Blijf de muizen gedurende 3 dagen na de operatie één keer per dag controleren om er zeker van te zijn dat ze goed genezen en volledige mobiliteit hebben, waarbij u let op tekenen van pijn.

5. Verwerking van botten voor μCT-scanning en -analyse

  1. Euthanaseer de muizen volgens de humane euthanasiemethode die is gereguleerd en goedgekeurd door de IACUC of ander toepasselijk institutioneel beleid. Hier werd de primaire euthanasiemethode van CO2 -inhalatie gebruikt, gevolgd door een secundaire methode van cervicale dislocatie.
  2. Oogst de dijbenen door de huid rond de achterpoten af te pellen en het hele ledemaat bij het heupgewricht te verwijderen.
  3. Sandwich elk ledemaat tussen twee sponzen in een inbeddingscassette. Breng de botten in hun cassettes over naar een 10% formaline-oplossing en fixeer ze gedurende 5-7 dagen bij 4 °C, rekening houdend met de leeftijd en grootte van de muis.
    OPMERKING: Zowel overfixatie als onderfixatie resulteren in een slechte beenmergresolutie.
  4. Was de cassettes na fixatie 3 keer 5 minuten in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  5. Verwijder de ledematen uit de cassettes en knip indien nodig de spieren weg met een scalpel.
    OPMERKING: Afhankelijk van stroomafwaartse toepassingen kan ruwe behandeling de periostale botlaag verstoren.
  6. Scheid het dijbeen bij de knie door voorzichtig door de ligamenten te knippen met een kleine chirurgische schaar of een scalpel.
    OPMERKING: Het scheenbeen kan voor andere toepassingen worden gebruikt of worden weggegooid.
  7. Breng de dijbenen over in conische buisjes van 1,7 ml of 15 ml in een oplossing van 70% ethanol. Botten kunnen in 70% ethanol bij 4 °C blijven totdat ze klaar zijn voor μCT-scanning.
  8. Scan en beoordeel de dijbenen op trabeculaire parameters, waarbij kwalitatieve en kwantitatieve gegevens worden geproduceerd.

6. Verwerking van botten voor bevroren secties en histologie

OPMERKING: Botten kunnen worden verwerkt voor ingevroren secties en histologie na het ondergaan van μCT-scanning. Het scannen heeft geen invloed op de fluorescerende etikettering of de daaropvolgende antilichaamkleuring.

  1. Breng de botten over van 70% ethanol naar PBS en was 3 keer, 5 minuten per wasbeurt.
  2. Incubeer in een reeks sacharoseoplossingen van 10%, 20% tot 30% in PBS bij 4 °C 's nachts bij elke concentratie. Bewaar de botten in 30% sucrose gedurende maximaal 5 dagen bij 4 °C of in deze oplossing bij -20 °C gedurende 6-12 maanden tot ze klaar zijn om te worden ingebed.
    OPMERKING: Het gebruik van een sucrosegradiënt resulteert in een betere weefselpenetratie. Na stap 6.1 kunnen de botten een nacht direct in een 30% sucrose-oplossing worden geplaatst.
  3. Veranker botten in een verbinding met een optimale snijtemperatuur (OCT) met behulp van cryo-inbeddingsmallen. Bewaren bij -80 °C tot klaar om te snijden.
  4. Doorsnijd ingebedde botten met behulp van de cryofilmtape-methode met cryostaattemperatuur ingesteld tussen -24 °C en -26 °C.
  5. Plak de secties op de cryofilm op een zelfklevende dia met behulp van optische lijm en hard uit totdat deze is uitgehard met behulp van een ultraviolette (UV) crosslinker.

7. Verwerking voor flowcytometrie

OPMERKING: Dit protocol is compatibel met een verscheidenheid aan antilichamen. Voor het karakteriseren van skeletstam- en voorlopercellen wordt aanbevolen om 3-4 botten samen te voegen, aangezien dit zeldzame celpopulaties in het beenmerg zijn.

  1. Bereid fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kleuringsmedia (FSM) voor. Om 1000 ml FSM-oplossing te maken, combineert: 100 ml Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), 10 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 20 ml foetaal runderserum (FBS), 870 ml dd H2O. Laat de FSM-oplossing door een filter van 0,2 μm lopen.
  2. Voordat u weefsel oogst, vult u petrischaaltjes met 4-5 ml steriele PBS zonder calcium en magnesium.
  3. Bereid de spijsverteringsmedia voor
    1. Bereid voor elke 4-6 dijbenen een digestiemengsel in 10 ml PBS met 0,005 g collagenase P en 0,02 g hyaluronidase. Meng door zachte vortex en laat het mengsel door een filter van 0,22 μm lopen.
  4. Oogst botten op dag 3 na de operatie, zoals beschreven in stap 5.2. Verwijder alle spieren en bindweefsel met een scalpelmesje.
  5. Vul een petrischaal met 5 ml digestiemiddel. Plaats 4-6 botten in het spijsverteringsmedium. Hak elk bot fijn en maak de eerste snede in de lengte- en breedterichting.
  6. Breng het weefsel over in een buis van 14 ml met ronde bodem en sluit af met parafilm. Dek de buizen af in aluminiumfolie.
  7. Schud gedurende 20 minuten bij 37 °C door de buis horizontaal op de shaker te houden.
  8. Verwijder de buis uit de schudder. Cellen zullen aan de onderkant samenklonteren. Verzamel voorzichtig het verteerde materiaal zonder de cellen op de bodem te verstoren en leid het digestaat door een filter van 70 μm. Vang het filtraat op in een nieuwe tube van 50 ml met 10 ml koude FSM en bewaar het op ijs.
  9. Voeg aan de cellen de resterende 5 ml van de spijsverteringsmix toe. Sluit opnieuw af met parafilm en dek af met aluminiumfolie. Schud de tube zoals hierboven beschreven. Herhaal stap 7.7-7.8.
  10. Na de incubatie van 20 minuten bij 37 °C wordt het digest overgebracht naar dezelfde buis met het digestaat uit stap 7.8 en passeer het door een filter van 70 μm met nog eens 10 ml FSM.
  11. Centrifugeer de suspensie bij 274 x g bij 4 °C. Zuig het bovenstaande op en verzamel de celpellet. Maak de pellet los door zachtjes op de buis te tikken.
    OPMERKING: De centrifugaalkracht (g) is gebaseerd op een rotorradius van 170 mm. Controleer de rotorradius en pas het toerental dienovereenkomstig aan.
  12. Om de lysis van rode bloedcellen uit te voeren, voegt u 1 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lyseringsbuffer toe. Bewaar alle reagentia en cellen op ijs.
  13. Incubeer de cellen in ACK gedurende ongeveer 5 minuten bij RT. Niet langer dan 5 minuten om te voorkomen dat de cellen te veel worden gelyseerd.
  14. Voeg 9 ml FSM toe. Centrifugeer bij 274 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  15. Aspiratie van het bovenlevende. Breek de celpellet door de buis voorzichtig op een buisrek te harken.
  16. Voeg 10 ml FSM toe (volume voor 4 botten, kan worden aangepast op basis van het aantal botten dat wordt gecombineerd) en resusorsie.
  17. Neem een hoeveelheid van elk monster en voeg propidiumjodide (PI) toe volgens de instructies van de fabrikant. Tel live en totaal aantal cellen met een cellenteller.
  18. Ga verder met het kleuren van antilichamen van monsters met behulp van de gewenste markers voor flowcytometrie-analyse 12,13,14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van de mechanische beenmergablatieprocedure (BM) werd gevalideerd door middel van röntgenbeeldvorming, terwijl de 26G-naald in de medullaire holte werd ingebracht (Figuur 2A). Toen röntgenfoto's aangaven dat de naald in een onjuiste hoek was ingebracht of door het bot was doorgedrongen, werd de naald opnieuw in de juiste hoek ingebracht en opnieuw in beeld gebracht om de nauwkeurige plaatsing te bevestigen. Wanneer een succesvolle positie niet kon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel was om een betrouwbare en reproduceerbare methode op te zetten om de moleculaire en cellulaire processen die botherstel regelen te bestuderen, met de nadruk op de directe omzetting van skeletstam- en voorlopercellen (SSPC's) in botafzettende osteoblasten in de beenmergruimte/holte. De hier beschreven mechanische beenmergablatiemethode is een geoptimaliseerd en gevalideerd protocol voor beenmerglablatie door mechanisch letsel, dat het mogelijk maakt om intramembraneuze botvorming...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen onthullingen te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering werd verstrekt door NIH/NIDCR R01-DE030716-01 en NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 aan AS, NIH/NIAMS R01AR080131 aan RG en UConn REP Convergence Grant aan RG en AS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Formalin Solution Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Hypodermic NeedleAit Tite/ Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Disposable Hypodermic NeedlesExel International/ Fisher Scientific14-840-83; ref #26402Elke 26 G naald kan worden vervangen, moet los te koppelen van de spuit 
3 mL Sterile SyringeFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Sterile PadMcKesson/ Fisher ScientificNC0593755Alternatief kan worden gebruikt autoklaveerbare absorberende pads 
Acetic Acid, GlacialMillipore SigmaAX0073Moet worden verdund tot 1%
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing BufferGibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Wordt gebruikt voor rode bloedcel lysis in voorbereiding voor flow cytometry 
Anesthesia Induction Chamber 2 LVetEquip941444
Betadine (Providone-Iodine) Solution Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
Buprenorphine HCL Injection 0.3 mg/mL Generic/ Covetrus59122Moet staat en federale DEA-licentie verkrijgen voor het kopen van gereguleerde stof
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenase P Roche11249002001Wordt gebruikt voor het verteren van bot
Cotton Swabs and ApplicatorsFisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Cryofilm Type II C(10), 3.5 cmSection Lab, JapanCFS 105
DAPI Staining Solution Abcamab228549
Digital Gram ScaleToprime/ AmazonB06X6LW4V9Kan elke merk schaal te gebruiken om muizen te wegen
Dissecting Forceps Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Dissecting Scissors Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Endure Low Profile Cryostat/Microtome BladesTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorphine Extended-Release 1.3 mg/mLEthiqa XR/ Cevetrus72117Moet staat en federale DEA-licentie verkrijgen voor het kopen van gereguleerde stof
Fast Green, 0.2%Electron Miscroscopy Sciences EMS50-319-57
Fetal Bovine Serum heat inactivatedGibco/ Thermo Fisher Scientific A5256801Wordt gebruikt om FACS Staining Media (FSM) te maken
Fluoromount-G Mounting Solution SouthernBiotech 0100-01
GLUSEAL Topical Skin Adhesive AD Surgical GLU-550
Goat anti-Rabbit Alexa 647Thermo FisherA212441:300 verdunning
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific14065056Wordt gebruikt om FACS Staining Media (FSM) te maken
Heating Pad (large)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXKan elke merk verwarmingskussen, verwijder de stoffen cover 
HematoxylinMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
HyaluronidaseMilliporeSigmaHX0514Wordt gebruikt voor het verteren van bot
Isoflurane Animal Anesthesia SystemVetEquip901810
KUBTEC Parameter 2D Cabinet X-ray SystemOncoMed SolutionsN/AElke X-ray Cabinet beeldvormingssysteem kan worden gebruikt
Microcentrifuge TubesCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Microscope Cover Glass, 18 mm x 18 mm, # 1 ThicknessGlobe Scientific1414-10
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Wordt gebruikt om FACS Staining Media (FSM) te maken
Norland optical Adhesive NO61Edmund Optical37-322Wordt gebruikt om cryofilm secties te hechten aan een glijbaan 
Osterix Rabbit Monoclonal Antibody Abcamab2094841:500 verdunning
Peroxigard Ready to Use One Step DisinfectantVirox Technologies29101Kan worden vervangen door elke andere klinische/lab graad desinfectiemiddel
Propidium Iodide (PI) Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific P1304MPNucleaire fluorescente vlek gebruikt om dode cellen voor vioabiliteit tellen te detecteren
Rechargeable Electric TrimmerWahl/ AmazonB001FWXKUEElke haarschaar kan worden gebruikt, een kleinere trimmer maakt het gemakkelijker om kleinere dieren te scheren
Rodent Nose ConeVetEquip921609
Safranin O, 85% pure, certifiedFisher ScientificAC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Square MoldsElectron Miscroscopy Sciences EMS62642-01Wordt gebruikt voor inbedding, andere inbedding mallen kunnen worden gebruikt. Dit specifieke model heeft een diepere mal, evenals een deksel om de blok te verzegelen 
Silver NitrateSigma AldrichS6506Zilvernitraat voor von Kossa vlek
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023Alternatief kan vers bereid PBS dat is gefilterd en geautoclaveerd worden gebruikt
Sterile Standard ScalpelsIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sterile Standard ScalpelsIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sucrose Powder 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Skeletal Stem CellsBone RegenerationMurine Bone ModelOsteoblast DifferentiationMicro Computed TomographyFrozen Section HistologyBone Repair Mechanisms

Gerelateerde artikelen