Evaluatie van salidroside als therapeutisch middel voor vasculaire calcificatie met behulp van netwerkfarmacologie en experimentele rattenmodellen

Samenvatting

Deze studie stelt een rattenmodel vast van vasculaire calcificatie geïnduceerd door een vetrijk dieet (HFD) in combinatie met vitamine D3 (VD3). Het model werd gebruikt om de therapeutische werkzaamheid van salidroside bij het voorkomen en behandelen van vasculaire calcificatie te evalueren, en inzicht te verschaffen in de mogelijke werkingsmechanismen door middel van netwerkfarmacologie en in vivo experimenten.

Samenvatting

Vasculaire calcificatie (VC) is een kritieke pathologische aandoening die gepaard gaat met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Deze studie maakt gebruik van een hybride benadering van netwerkfarmacologie en moleculaire biologie om de therapeutische mechanismen van salidroside (SAL), een actieve stof van Rhodiola crenulata, af te bakenen tegen VC. Door middel van databasemining en netwerkanalyse werden 388 SAL-doelen geïdentificeerd die elkaar kruisten met 2871 VC-geassocieerde doelen, wat resulteerde in 208 gemeenschappelijke doelen. Een eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerk dat is geconstrueerd via de String-database en topologische analyse in Cytoscape 3.9.1 heeft 10 belangrijke doelen geïdentificeerd, waaronder IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 en STAT3. De geïdentificeerde genen waren geconcentreerd in de lipide- en atheroscleroseroutes, wat aangeeft dat de verbetering van VC door SAL kan optreden door de regulatie van abnormale expressie van lipide en ontstekingsfactoren. Er werd ook vastgesteld dat SAL de abnormale expressie van ontstekingsfactoren remt, waardoor de JAK2/STAT3-route wordt geactiveerd om in te grijpen in de progressie van VC. De JAK2/STAT3-route is een belangrijk moleculair mechanisme waarmee SAL verdere verslechtering van VC voorkomt. Functionele verrijkingsanalyses toonden de betrokkenheid van deze doelwitten aan bij ontstekingsreacties en lipidenmetabolisme, cruciale routes in VC. In vivo studies bij ratten toonden de werkzaamheid van SAL aan bij het verminderen van dyslipidemie en vasculaire ontsteking, met verbeterde serumlipideprofielen en verminderde vasculaire calciumafzetting. De mechanistische exploratie, gebaseerd op westerse blot-analyse, toonde het vermogen van salidroside aan om de JAK2/STAT3-signaleringsroute te reguleren, wat het potentieel ervan als modulator in dit kritieke moleculaire mechanisme benadrukt en een potentieel therapeutisch doelwit voor VC biedt. De kracht van dit onderzoek ligt in de methodologische nauwkeurigheid, waarbij computationele voorspellingen worden geïntegreerd met in vivo validaties. Deze alomvattende aanpak biedt een robuust kader voor het onderzoeken van de therapeutische mechanismen van natuurlijke verbindingen bij de bestrijding van VC.

Inleiding

Vasculaire calcificatie (VC) verwijst naar de abnormale afzetting van calcium in de vaatwanden, wat leidt tot arteriële verstijving en verminderde elasticiteit, wat uiteindelijk de vasculaire functie aantast. Traditioneel wordt VC onderverdeeld in twee typen: intimale verkalking, gekoppeld aan lipidenopbouw, en mediale verkalking. De eerste is nauw verbonden met inflammatoire infiltratie, die een osteogene transformatie in de vaatwand teweegbrengt, gekenmerkt door de migratie, proliferatie en differentiatie van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) in osteoblastachtige cellen¹.

Het vermogen van VSMC's om osteogene differentiatie te ondergaan, beïnvloed door factoren zoals veroudering, genetica en omgevingsfactoren zoals diabetes en chronische nierziekte, levert een belangrijke bijdrage aan leeftijdsgebonden VC. Deze osteoblastachtige transformatie verergert arteriële calcificatie en degeneratie¹.

VC is een veelzijdige aandoening, gedreven door degeneratieve veranderingen, metabole onevenwichtigheden en verschillende systemische aandoeningen. Ongeveer 80% van de vasculaire letsels en 90% van de gevallen van coronaire hartziekte vertonen VC, waardoor het risico op ernstige cardiovasculaire gebeurtenissen aanzienlijk toeneemt ^1,2. Daarom is er een dringende behoefte om farmacologische behandelingen te ontdekken die deze aandoening effectief verminderen of omkeren.

Momenteel omvatten behandelingsstrategieën voor VC verschillende farmacologische interventies, hoewel er geen medicijnen zijn die specifiek voor dit doel zijn ontworpen. Voor patiënten met milde verkalking worden statines vaak voorgeschreven om plaques te stabiliseren. Hoewel ze de stenose van de kransslagader kunnen verminderen door de lipideniveaus te verlagen, is hun effect op verkalking beperkt².

Gezien de complexiteit van atherosclerose, vertonen veel patiënten een verbeterde activering van bloedplaatjes, waardoor het gebruik van bloedplaatjesaggregatieremmers zoals aspirine of clopidogrel nodig is om de aggregatie van bloedplaatjes te remmen en het risico op trombose te verminderen. Aspirinetherapie is echter alleen gunstig voor personen met een hoge calciumscore in de kransslagader en een laag risico op bloedingen³.

Bovendien suggereert onderzoek naar supplementen, zoals vitamine K, potentieel bij het voorkomen van VC-progressie⁴. In ernstige gevallen kunnen invasieve interventies worden overwogen, hoewel deze vaak ongeschikt zijn voor wijdverspreide VC⁵. Voor personen zonder bestaande VC blijft het beheersen van risicofactoren, zoals bloeddruk, lipidenprofielen en levensstijlkeuzes, van cruciaal belang⁶.

Rhodiola crenulata, een overblijvend kruid van de Crassulaceae-familie, wordt van oudsher gebruikt in de Chinese geneeskunde. Het belangrijkste bioactieve bestanddeel, salidroside, trekt veel aandacht vanwege zijn opmerkelijke biologische activiteiten. Salidroside staat bekend om zijn vermogen om apoptose te remmen, robuuste antioxiderende eigenschappen te vertonen en ontstekingsremmende eigenschappen te bezitten ^7,8. Deze eigenschappen dragen bij aan het potentieel om de vasculaire functie te verbeteren, vasculaire veroudering te vertragen en het vasculaire endotheel te beschermen. Als potentieel therapeutisch middel voor VC heeft salidroside een aanzienlijke waarde voor onderzoek. De precieze mechanismen waarmee salidroside VC verbetert, moeten echter nog volledig worden opgehelderd en rechtvaardigen verder onderzoek om het therapeutisch potentieel ervan bij de behandeling van VC te benutten.

Om deze mechanismen te onderzoeken, maakt deze studie gebruik van netwerkfarmacologie, een innovatieve methodologie die farmacologie, bio-informatica en informatica combineert om biologische systemen te analyseren en geneesmiddelmechanismen op te helderen. Vergeleken met traditioneel single-target geneesmiddelenonderzoek, biedt netwerkfarmacologie een meer uitgebreide benadering door de effecten van een medicijn op meerdere biologische doelen en signaalroutes te analyseren. Als een belangrijk hulpmiddel in de moderne ontwikkeling van geneesmiddelen, construeert het netwerken van geneesmiddelen, doelen en routes om de onderliggende mechanismen van de werking van geneesmiddelen te onthullen ^9,10. Ondanks het uitgebreide gebruik ervan bij het verkennen van therapeutische mechanismen, is er beperkt onderzoek gedaan naar de interactieve mechanismen tussen salidroside en VC vanuit het perspectief van bio-informatica en netwerkfarmacologie.

Dit onderzoek construeert een moleculaire netwerkkaart van de potentiële impact van salidroside op VC door belangrijke doelen te identificeren en te analyseren door middel van uitgebreide databasemining. Er wordt een eiwit-eiwitinteractie (PPI)-netwerk gegenereerd en topologische analyse wordt toegepast om kritieke knooppunten in het verkalkingsproces te markeren.

Om de computationele voorspellingen te bevestigen, wordt een rattenmodel van VC ontwikkeld door een vetrijk dieet met vitamine D3 (VD3) toe te dienen. Dit model repliceert de pathologische kenmerken van menselijke VC. Vasculair letsel wordt beoordeeld door middel van histologische technieken, serumlipideprofielen en ontstekingsmarkers worden geëvalueerd om de systemische effecten van salidroside te onderzoeken, en de expressie van SAL anti-VC-gerelateerde eiwitten wordt gemeten met behulp van Western blotting tot het onderzoeken van de impact van salidroside op experimenteel geïnduceerde VC, deze studie heeft tot doel waardevolle inzichten te verschaffen in het potentieel van deze verbinding als therapeutische strategie voor het bestrijden van VC.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd door het Proefdierencomité van de Changchun University of Chinese Medicine (goedkeuring nr. 2023091). Deze studie voldoet aan internationale richtlijnen, waaronder de richtlijnen van de Europese Gemeenschap en de EEG-richtlijn van 1986, en zorgt ervoor dat dieren gedurende het hele onderzoek ethisch worden behandeld. Mannelijke Wistar-ratten (8-10 weken, gewicht 200-220 g) werden gebruikt voor het onderzoek. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorspelling van potentiële salidroside-VC-doelen in de farmacologie van het netwerk

OPMERKING: Netwerkfarmacologie maakt gebruik van computationele methoden en grootschalige gegevensanalyse om de complexe interacties tussen geneesmiddelmoleculen en biologische doelen zoals routes, genen en eiwitten binnen een organisme te onderzoeken^11,12. Deze benadering helpt bij het ontcijferen van de biologische functies en relaties van de bestudeerde entiteiten. De methodologie omvat het gebruik van databases, verwerking van chemische informatie, verwerving van bioactiviteitsgegevens, het ophalen van eiwitgegevens, analyse van genexpressieprofielen, constructie van interactienetwerken en verrijkingsanalyse van routes¹¹. Figuur 1 toont het interactienetwerk van kerndoelen tussen salidroside en vasculaire calcificatie.

1. Opbouw van de database met doelwitten "Ingrediënten"
   1. Gebruik "Salidroside" als trefwoord voor ingrediënten om databases¹³ te doorzoeken (zie aanvullende tabel 1), zoals HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA en STITCH.
   2. Bekijk relevante literatuur om doelen te identificeren die verband houden met salidroside, met de soorten ingesteld op Homo sapiens. Na het verwijderen van duplicaten, standaardiseert u de doeleiwitten met behulp van UniProt (zie aanvullende tabel 1) en zet u een uitgebreide Salidroside-doeldatabase^{op 14}.
2. Opbouw van de database met doelwitten "Ziekte"
   1. Gebruik "Vasculaire calcificatie" als trefwoord om databases¹⁵ te doorzoeken (zie aanvullende tabel 1), waaronder GeneCards, OMIM, PharmGkb en DrugBank, met de soorten ingesteld op Homo sapiens. Maak na deduplicatie een database met doelen voor vasculaire verkalking.
3. Voorspelling van potentiële therapeutische doelen
   1. Voer de doelen voor salidroside en vasculaire calcificatie in (zie aanvullende tabel 1) om gemeenschappelijke doelen te identificeren. Genereer een Venn-diagram om de potentiële therapeutische doelen voor salidroside bij de behandeling van vasculaire calcificatie te visualiseren.
4. Opbouw van het "Salidroside-Vascular Calcification" Protein-Protein Interaction (PPI) netwerk
   1. Stel de potentiële doelen samen in een lijst met meerdere eiwitten en analyseer ze met behulp van STRING (zie aanvullende tabel 1), waarbij het organisme is ingesteld op Homo sapiens en de interactiescore is ingesteld op gemiddelde betrouwbaarheid (>0,4)¹⁶. Extraheer de PPI-gegevens in TSV-formaat voor verdere analyse.
      OPMERKING: Aangezien 85% van de genen van ratten homoloog zijn aan menselijke genen en vergelijkbare biologische functies vervullen, werden ratten geselecteerd als experimentele proefpersonen voor het valideren van de effecten van salidroside op vasculaire calcificatie¹⁷.
5. Selectie en netwerkopbouw van belangrijke doelen
   1. Importeer de PPI-netwerkgegevens in Cytoscape 3.9.1 (zie aanvullende tabel 1) voor analyse met behulp van de CytoNCA-plug-in om parameters zoals Betweenness (BC), Nabijheid (CC), Graad (DC), Eigenvector (EC), Lokale Gemiddelde Connectiviteit (LAC) en Netwerkcentraliteit (NC) te beoordelen. Selecteer de belangrijkste doelen met CC=1 om een kerndoelactiespectrumkaart voor 'SAL-VC' te maken.
   2. Gebruik de CytoHubba-plug-in om de top 10 hub-genen te identificeren op basis van Maximal Clique Centrality (MCC), Maximum Neighborhood Component (MNC) en Degree-berekeningen, waardoor een Hub-genenspectrumkaart wordt gegenereerd.
6. Analyse van de verrijking van de GO- en KEGG-route
   1. Voer gen-ID-conversie uit met behulp van DAVID (zie aanvullende tabel 1), selecteer ENSEMBL_GENE_ID voor het gentype-9606 voor soortinformatie. Analyseer de lijst met geconverteerde genen met behulp van Omicshare (zie aanvullende tabel 1) voor GO functionele en KEGG-routeverrijking, met een significantie ingesteld op een P-waarde < 0,05¹⁸.
      OPMERKING: GO-functionele analyse omvat moleculaire functie (MF), biologisch proces (BP) en cellulaire component (CC). KEGG-routeanalyse omvat routeverrijking en verrijking van routeclassificatie¹⁹. De resultaten van de verrijkingsanalyse zijn weergegeven in figuur 2.

2. Dierproeven

1. Acclimatisering
   1. Acclimatiseren Wistar-ratten onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden met een licht/donkercyclus van 12 uur. Zorg ervoor dat ze ad libitum toegang hebben tot voedsel en water om hun gezondheid te behouden voordat met experimenten wordt begonnen. Voer adaptieve voeding uit gedurende 1 week.
2. Model vestiging
   1. Acclimatiseer de ratten aan de omgevingsomstandigheden en wijs ze willekeurig toe aan vijf groepen: controlegroep (Ctrl, ND + voertuig), modelgroep (model, HFD + voertuig), SAL-groep met lage dosis (SAL-L, HFD + SAL 5 mg/kg), SAL-groep met hoge dosis (SAL-H, HFD + SAL 10 mg/kg) en simvastatine (SIM) groep (HFD + SIM 5 mg/kg).
   2. Dien een normaal dieet (ND) toe aan de Ctrl-groep en een vetrijk dieet (HFD) aan de overige groepen gedurende de gehele duur van het experiment. Injecteer op de eerste dag van de toediening van HFD een enkele subcutane dosis van 600.000 IE/kg VD3 aan alle groepen behalve de Ctrl-groep ^20,21. Volg met wekelijkse subcutane injecties van 100.000 IE/kg VD3 gedurende de volgende 8 weken (figuur 3).
   3. Bewaak dagelijks de gezondheidstoestand en overleving van de dieren. Begin met experimentele interventies in de negende week.
   4. Euthanasie van de dieren aan het einde van het onderzoek (volgens de institutioneel goedgekeurde protocollen). Verzamel serummonsters, laat ze 30 minuten staan en centrifugeer om het serum te isoleren (volgens eerder gepubliceerde rapporten^20,21). Ontleed vaatweefsel (abdominale aorta) en spoel af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed te verwijderen.
   5. Fixeer een deel van het weefsel in 4% paraformaldehyde voor histologisch onderzoek en bewaar een ander deel in vloeibare stikstof voor moleculaire analyse.
      OPMERKING: Verdun salidroside voor gebruik met warm water.

3. Evaluatie van vaatweefselbeschadiging met behulp van HE-, VK-, EVG-kleuring

OPMERKING: Fixeer vaatweefsel (abdominale aorta) in 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd in ethanol na 48 uur en ingebed in paraffine. Snijd de ingebedde paraffineblokken in plakjes van 5 μm voor Hematoxyline-Eosin (HE), Elastica van Gieson (EVG) en Von Kossa (VK) kleuring en observeer de histologische morfologie onder een lichtmicroscoop. HE-kleuring wordt gebruikt om veranderingen in de weefselmorfologie te beoordelen. In vaatweefsel benadrukt het structurele veranderingen in de vaatwand, waaronder proliferatie van gladde spiercellen, ongeorganiseerde celrangschikking en ontsteking. EVG-kleuring visualiseert elastische en collageenvezels, wat essentieel is voor het evalueren van elastische vezelbeschadiging of hermodellering in vaatweefsel en helpt bij het begrijpen van de impact van verkalking op de vasculaire elasticiteit. VK-kleuring detecteert calciumafzettingen, een belangrijk kenmerk van VC, waardoor het cruciaal is voor het beoordelen van de omvang en verdeling van verkalking in vaatweefsel^22,23.

1. HE-kleuring voor het opsporen van vaatweefselschade
   1. Deparaffinisatie en rehydratatie
      1. Deparaffiniseer secties in twee wisselingen van xyleen gedurende elk 8 minuten en rehydrateer door een graduele ethanolreeks (100%, 95%, 85%, 75%) gedurende 3 minuten per stap. Spoel vervolgens 2 minuten af in stromend kraanwater.
   2. Hematoxyline-kleuring
      1. Kleur de secties 5-10 minuten met hematoxyline en was om overtollige vlekken te verwijderen, gevolgd door een spoeling met stromend kraanwater.
         OPMERKING: Een lichte vlek van 5 minuten wordt aanbevolen om te donkere vlekken te voorkomen, die de cytoplasmatische kleur kunnen beïnvloeden.
   3. Differentiatie
      1. Differentieer de secties in een differentiatieoplossing gedurende 30 s, gevolgd door twee spoelingen in leidingwater gedurende elk 3 minuten.
   4. Eosine tegenkleuring
      1. Plaats de secties gedurende 1 minuut in de eosinekleuring. Voer na het verwijderen van de overtollige vlek een snelle uitdroging uit.
   5. Uitdroging, klaring en montage
      1. Voor snelle uitdroging dompelt u de secties elk 3 s in 75%, 85%, 95% en 100% ethanol, gevolgd door 100% ethanol gedurende 1 minuut.
         OPMERKING: Snelle uitdroging wordt aanbevolen, omdat eosine kleur kan verliezen in water- en ethanolgradiënten.
2. VK-kleuring voor calciumdetectie
   1. Deparaffinisatie en rehydratatie
      1. Voer deze stap uit volgens stap 3.1.1.
   2. Zilver nitraat reactie
      1. Dep de secties droog, omlijn ze met een fijne borstel en bevlek ze met Von Kossa (zie Materiaaltabel). Stel ze gedurende 4 uur bloot aan ultraviolet licht en spoel ze vervolgens grondig af met stromend kraanwater.
   3. Tegenkleuring met hematoxyline
      1. Kleur de secties 5 minuten met hematoxyline, spoel ze af met stromend kraanwater, differentieer en spoel opnieuw, gevolgd door een stromende spoeling met kraanwater.
   4. Eosine tegenkleuring
      1. Dehydrateer de secties door middel van graduele ethanol (85% en 95% gedurende elk 5 minuten) en kleur vervolgens gedurende 5 minuten met eosine.
   5. Uitdroging en montage
      1. Dehydrateer de secties in ethanolbaden (100% ethanol I, II, III elk 5 minuten) en klar ze op in xyleenbaden (xyleen I en II elk 5 minuten). Monteer vervolgens de secties met neutrale balsem.
   6. Microscopisch onderzoek en beeldopname
      1. Onderzoek de bevlekte delen onder een lichtmicroscoop en maak beelden voor analyse.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat calciumafzettingen bruinzwart tot donkerzwart lijken, de kernen blauw zijn en de achtergrond rood is. Bereid de zilvernitraatoplossing direct voor gebruik voor op verse VK-kleuring.
3. EVG-kleuring voor elastische en collageenvezels
   1. Deparaffinisatie en rehydratatie
      1. Behandel de paraffinesecties 50 minuten met warmte en dompel ze vervolgens 20 minuten onder in xyleen om paraffine te verwijderen. Ga verder door de secties elk 5 minuten te onderwerpen aan een gegradueerde ethanolreeks (100%, 95%, 85%, 75%) en sluit af met een spoeling in stromend kraanwater gedurende 5 minuten.
   2. EVG-kleuring
      1. Breng de EVG-kleuringsoplossing (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten aan en spoel vervolgens 5 s kort af in stromend kraanwater om overtollige vlekken te verwijderen.
      2. Breng vervolgens Verhoeff werkoplossing (zie Materiaaltabel) gedurende 5 minuten aan, gevolgd door nog een korte spoeling in stromend kraanwater gedurende 5 s. Breng de differentiërende oplossing van Verhoef gedurende 5 s aan totdat de elastinevezels duidelijk zichtbaar zijn en spoel vervolgens 5 s af met stromend kraanwater.
         OPMERKING: Meng de componenten A, B en C (meegeleverd in de in de handel verkrijgbare kit) in een verhouding van 5:2:2 om de Verhoeff-werkoplossing voor gebruik te bereiden. Gebruik de oplossing binnen 2 uur en vul indien nodig bij tijdens het kleuringsproces om te voorkomen dat de secties uitdrogen.
   3. Uitdroging en montage
      1. Dehydrateer de secties door een gegradueerde ethanolreeks (75%, 85%, 95% en 100%) gedurende elk 5 s, gevolgd door een klaring in twee veranderingen van xyleen van elk 1 minuut. Monteer de secties na een korte droogperiode aan de lucht met neutrale balsem.
   4. Microscopisch onderzoek en beeldanalyse
      1. Onderzoek de bevlekte secties onder een lichtmicroscoop om elastische en collageenvezels te visualiseren en maak afbeeldingen voor latere analyse.

4. Alkalische fosfatase (ALP) test

OPMERKING: Gebruik ALP als een belangrijke indicator om de effectiviteit van antiverkalkingsbehandelingen te evalueren.

1. Bereiding van reagens
   1. Los het kleurontwikkelende substraat op in ijskoude 0,05 M pH 9,6 carbonaatbuffer tot een eindvolume van 2,5 ml.
      OPMERKING: Bereid de buffer voor door 1.59 g natriumcarbonaat en 2.93 g natriumbicarbonaat op te lossen in 1,000 ml dubbel gedestilleerd water.
2. Verdunning van het substraat
   1. Verdun 10 μL p-nitrofenoloplossing (10 mM) met 0,05 M pH 9,6 carbonaatbuffer tot een eindvolume van 0,2 ml om een eindconcentratie van 0,5 mM te bereiken.
3. Voorbereiding van het monster
   1. Homogeniseer de abdominale aorta in lysisbuffer. Centrifugeer het homogenaat (~12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C) en verzamel het bovenstaande voor detectie van ALP-activiteit.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de lysisbuffer vrij is van fosfataseremmers. Bewaar in afwachting van testmonsters bij -80 °C en vermijd herhaalde vries-dooicycli.
4. Voorbereiding van microplaten voor assay
   1. Bereid een plaat met 96 putjes voor met lege, standaard- en voorbeeldputjes. Voeg 50 μl van de standaardoplossing toe aan standaardputjes en 50 μl hangende testmonsters aan bemonsteringsputjes. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 °C.
5. Meting van reactiebeëindiging en extinctie
   1. Voeg 100 μL stopoplossing toe aan elk putje om de reactie te beëindigen. Meet de extinctie bij 405 nm en bereken de ALP-activiteit op basis van absorptiewaarden (volgens de instructies van de fabrikant, zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Putten die de standaard of monsters met ALP-activiteit bevatten, zullen verschillende tinten geel vertonen. De kleur is tot 2 uur stabiel.

5. Bepaling van het calciumgehalte

OPMERKING: Bepaling van het calciumgehalte is van cruciaal belang voor het beoordelen van de mate van mineralisatie in biologische weefsels.

1. Weefsel preparatie
   1. Hak het weefsel in kleine stukjes en homogeniseer in lysisbuffer.
2. Monsterverdunning en centrifugeren
   1. Verdun het weefsel in de lysisbuffer in een verhouding van 1:10. Homogeniseer het mengsel en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C, 12.000 x g . Verzamel het bovenstaande voor analyse.
      OPMERKING: Bereid calciumstandaardverdunningen (0-1,0 mM) met een calciumstandaardoplossing van 5 mM (zie materiaaltabel).
3. Plaatopstelling en incubatie
   1. Voeg 50 μL standaard- of testmonsters toe aan elk putje van een plaat met 96 putjes. Voeg 150 μL analyseoplossing toe, meng grondig en incubeer de plaat 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Meet de extinctie bij 575 nm en construeer een standaardcurve.
4. Berekening van het calciumgehalte
   1. Bereken het calciumgehalte met behulp van de standaardcurve, waarin de verdunningsfactor, het monstervolume en het atoomgewicht van calcium zijn opgenomen.

6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) voor inflammatoire cytokines (IL-6, TNF-α, IL-1β)

OPMERKING: IL-6, IL-1β en TNF-α zijn belangrijke pro-inflammatoire cytokines die de aanwezigheid en ernst van een ontstekingsreactie aangeven. Het meten van deze cytokinen is essentieel voor het begrijpen van het ontstekingsproces en het evalueren van de effectiviteit van ontstekingsremmende behandelingen.

1. Stalen collectie
   1. Verzamel serum uit de abdominale aorta van de rat. Laat het 2 uur stollen bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en vang het bovenstaande op.
2. Voorbereiding van de microplaat voor de test
   1. Bereid een plaat met 96 putjes voor met putjes die zijn aangewezen voor standaarden en testmonsters. Voeg 50 μL standaarden (zie Tabel met materialen) in verschillende concentraties toe aan de juiste putjes.
3. Voorbereiding van het monster
   1. Voeg 40 μl monsterverdunningsmiddel toe aan elke put die voor testmonsters is aangewezen. Voeg 10 μL van het monster toe aan dezelfde putjes, wat resulteert in een 5-voudige verdunning.
4. Incubatie met enzymgelabelde reagentia
   1. Voeg 100 μL enzymgelabelde reagentia die specifiek zijn voor IL-6, TNF-α of IL-1β toe aan alle putjes behalve de blanco. Incubeer de plaat gedurende 60 minuten bij 37 °C.
5. Was
   1. Gooi de vloeistof uit alle putjes weg, behalve de blanco. Was de putjes met 1x wasoplossing (bereid als een 20-voudige verdunning in gedestilleerd water). Herhaal deze wasstap vijf keer en droog de putjes af.
6. Kleurontwikkeling en -beëindiging
   1. Voeg 50 μL substraatoplossingen A en B (uit de in de handel verkrijgbare kit, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje. Meng voorzichtig en incubeer de plaat 15 minuten bij 37 °C in het donker. Voeg 50 μL stopoplossing toe aan elk putje om de reactie te beëindigen.
7. Absorptiemeting en data-analyse
   1. Stel de lege ruimte goed in op nul. Meet de extinctie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer. Genereer een standaardcurve op basis van de OD-waarden en standaardconcentraties. Bereken de monsterconcentraties met behulp van interpolatie en pas deze aan voor de verdunningsfactor.

7. Test van het lipidenprofiel

OPMERKING: De lipidenprofieltest detecteert abnormale lipideniveaus, waarbij verhoogde of onevenwichtige lipideniveaus het risico op vasculaire verkalking kunnen versnellen.

1. Totaal cholesterol en triglyceriden (TC en TG)
   1. Verzamel serum en bereid een plaat met 96 putjes voor met aangewezen putjes voor blanco, kalibratie en in afwachting van testmonsters. Voeg 2,5 μl serum, kalibratiestandaard of blanco oplossing toe aan elk putje.
   2. Voeg 250 μL van de werkoplossing toe aan elk putje. Meng voorzichtig en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 °C. Meet de extinctie bij 500 nm met behulp van een microplaatlezer.
2. Lipoproteïne met lage dichtheid en lipoproteïne met hoge dichtheid (LDL-C en HDL-C)
   1. Verzamel serum en bereid een plaat met 96 putjes voor met putjes die zijn aangewezen voor blanco, kalibratie en in afwachting van testmonsters. Voeg 2,5 μl serum, kalibratiestandaard of blanco oplossing toe aan de respectievelijke putjes.
   2. Voeg het juiste reagens (reagens één voor 180 μl of reagens twee voor 60 μl, zie materiaaltabel) toe aan elke put zoals aangegeven in de instructies van de testkit. Incubeer bij de temperatuur (37 °C) en gedurende de tijd (reagens 1 gedurende 5 minuten of reagens twee gedurende 10 min) die voor elk reagens worden aanbevolen.
   3. Meet de extinctie bij de specifieke golflengte (600 nm) aangegeven voor LDL-C of HDL-C met behulp van een microplaatlezer.

8. Western blotting

OPMERKING: Western blot (WB) speelt een belangrijke rol bij het beoordelen van de expressieniveaus van belangrijke eiwitten, waardoor zowel totale als gefosforyleerde vormen kunnen worden gedetecteerd.

1. Weefsel preparatie
   1. Weeg 0,05 g tissue af en spoel grondig af met PBS om overtollig vuil te verwijderen. Voeg 500 μL lysisbuffer toe met 1x fosfatase- en proteaseremmers. Incubeer het weefsel gedurende 10 minuten bij 4 °C en homogeniseer het met een tissuemolen.
2. Eiwit extractie
   1. Laat het gehomogeniseerde monster 1 minuut staan en centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 4 °C en 12.000 x g . Verzamel het bovenstaande voor eiwitanalyse. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-methode volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Gebruik een standaardcurve om de concentratie te berekenen.
      OPMERKING: Koel de centrifuge voor gebruik voor tot 4 °C. Meet de eiwitconcentratie bij 562 nm.
3. Voorbereiding van het monster
   1. Meng het eiwitmonster met 5x laadbuffer met β-mercaptoethanol en SDS in een verhouding van 4:1. Verwarm het mengsel 5 minuten op 100 °C om de eiwitten te denatureren.
      OPMERKING: Als 1x laadbuffer nodig is, verdun dan de 5x buffer met lysisbuffer.
4. SDS-PAGE gel preparaat
   1. Bereid een 12% SDS-PAGE-gel voor en plaats deze in het elektroforese-apparaat. Voeg 1x elektroforesebuffer toe tot halverwege volgens de instructies (zie aanvullende tabel 2).
5. Elektroforese
   1. Haal de eiwitmonsters op bij -20 °C. Laad 60 μg eiwit per putje en laat de gel lopen.
   2. Stel de stroom in op 50 mA gedurende 20 minuten voor de stapelgel en verhoog vervolgens tot 100 mA gedurende 60 minuten voor de scheidingsgel totdat het verffront de bodem bereikt.
6. Membraan overdracht
   1. Activeer het PVDF-membraan in methanol gedurende 5 minuten.
   2. Monteer de transfersandwich in de volgende volgorde: filtreerpapier → SDS-PAGE-gel → PVDF-membraan → filtreerpapier. Breng eiwitten over bij 300 mA gedurende 60 minuten.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen bekneld raken tussen de SDS-PAGE-gel en het PVDF-membraan.
7. Blokkeren
   1. Incubeer het PVDF-membraan in 5% BSA (bereid in 1x TBST) bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 60 minuten. Was het membraan met 1x TBST drie keer gedurende 5 minuten elk.
8. Incubatie van primaire antilichamen
   1. Incubeer het membraan in 5 ml van het juiste primaire antilichaam (bijv. p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) verdund in blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 2,5 uur.
9. Incubatie van secundaire antilichamen
   1. Was het membraan met 1x TBST driemaal gedurende 5 minuten elk na incubatie van primaire antilichamen. Incubeer met het juiste secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan opnieuw met 1x TBST, drie keer gedurende 5 minuten elk.
10. Opsporing
    1. Visualiseer eiwitbanden met behulp van ECL-chemiluminescentiedetectie²⁴ (zie materiaaltabel).
11. Densitometrie analyse
    1. Kwantificeer eiwitbanden met behulp van ImageJ-software. Volg deze workflow in ImageJ: Afbeelding → 8-bits → Proces → Achtergrond aftrekken. Analyseer → stel metingen in → analyseer → ingestelde schaal. Bewerk → keer om → analyseer → meet → resultaten. Bestand → opslaan als → IntDen.
    2. Genereer statistische grafieken met behulp van grafische en statistische analysesoftware.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat de resultaten consistent zijn in alle replica's om bevindingen te valideren.

9. Statistische analyse

1. Verzamel en organiseer gegevens met behulp van GraphPad Prism 9.0.
2. Bereken en teken foutbalken met behulp van gemiddelde ± SD uit onbewerkte gegevens.
3. Voer statistische analyse uit met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoctest voor meerdere vergelijkingen.
4. Bepaal de statistische significantie bij P < 0,05, waarbij kleinere P-waarden grotere verschillen in de resultaten aangeven.

Resultaten

Farmacologische analyse van het netwerk

Met behulp van databases zoals HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA en STITCH werden 388 potentiële doelwitgenen voor salidroside geïdentificeerd. Bovendien werden 2871 potentiële doelwitgenen gerelateerd aan VC opgehaald uit databases zoals GeneCards, OMIM, PharmGkb en DrugBank. Kruispuntanalyse via VENN-diagrammen onthulde 208 overlappende doelen, die worden bescho...

Discussie

VC wordt gekenmerkt door degeneratieve veranderingen in vasculaire cellen en weefsels, met pathologische minerale afzettingen in bloedvaten die leiden tot verstijving van de vaatwanden of de vorming van atherosclerotische plaques, wat kan leiden tot obstructieve vaatziekten²⁵. Studies tonen aan dat ongeveer 85% van de VC-plaques kan evolueren naar trombose, die acute cardiovasculaire episodes kan veroorzaken. Bovendien is VC een cruciale indicator van mogelijke ac...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
30% (29:1) Acrylamide/Bis Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd,China	A1010
4% Paraformaldehyde Fix Solution	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	P0099
5*loading buffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd,China	P1040
Alkaline Phosphatase Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	P0321S
AlphaView Software	Proteinsimple Inc.USA	AlphaView SA
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	P0012
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd,China	G1866
Calcium Colorimetric Assay Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	S1063S
Collagen Fiber And Elastic Fiber Staining Kit(EVG-Verh eff Method)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd,China	G1597
Dewatering machine	Diapath Biosciences  Ltd, Italy	Donatello
Embedding machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd,China	JB-P5
Enzyme-labeled instrument	Biotek Co., Ltd,USA	Epoch
Ethanol absolute	GHTECH  Co., Ltd, China	64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRP	Bioworld technology, co, Ltd.,China	BS20242-Y
GraphPad Prism Software	GraphPad Software.,USA	GraphPad Prism 9.0
Hematoxylin-Eosin Stain Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd,China	G1120
High-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A112
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	A0208
Image J Software	National Institutes of Health(NIH),USA	Image J
IκB Alpha Polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10268-1-AP
JAK2 Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF6022
Low-density lipoprotein cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A113
NF-κB p65 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10745-1-AP
Pathological microtome	Leica Biosystems,USA	RM2016
Phosphatase Inhibitor Cocktail Tables	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF3024
Phospho-NF-κB p65(Ser276) Antibody	Affinity Biosciences Co., Ltd,China	AF2006
Phospho-STAT3(S727) Antibody	Abways  Science & Technology Co., Ltd,China	CY5291
Protease Inhibitor Cocktail	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	11873580001
PVDF membrane	F. Hoffmann-La Roche, Ltd,Switzerland	3010040001
Rat IL-1β ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	PI303
Rat IL-6 ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	PI328
Rat TNF-α ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	PT516
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	P0013B
Salisoroside	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,China	S25475
SDS	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD,China	3250KG001
Sodium carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd., China	1001921933
Sodium hydrogen carbonate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd., China	10018960
Sodium thiosulfate	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd., China	20042518
STAT3 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,USA	10253-2-AP
TBST (10×)	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), China	ST673
Total cholesterol assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A111
Triglyceride assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd,China	A110
Tris Base	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD	1115GR500
Upright optical microscope	Nikon Corporation,Japan	Eclipse E100
Von Kossa Solution	Wuhan servicebio technology CO.,LTD,China	G1043
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.,USA	SC-2048
β-Actin antibody	Cell Signaling Technology, Inc.,USA	E4967