Geoptimaliseerde methode voor teelt en microbiële bioaugmentatie van Typha latifolia (lisdodde )

Summary

Typha latifolia, die zich voornamelijk ongeslachtelijk voortplant via wortelstokken, vormt verzameluitdagingen vanwege het uitgebreide wortelstelsel. Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van T. latifolia uit zaad, waardoor laboratoriumteelt gemakkelijker wordt en het potentieel wordt geboden voor steriele plantengroei en vroege microbiële bioaugmentatie.

Abstract

Typha latifolia, beter bekend als de breedbladige lisdodde of de gewone lisdodde, heeft een wereldwijd bereik en domineert wetland-ecosystemen in Noord-Amerika. Hoewel verschillende soorten lisdodde in Noord-Amerika vaak als invasief worden beschouwd, wordt T. latifolia beschouwd als de inheemse soort in de regio en wordt over het hele continent aangetroffen als de dominante Typha-soort . Historisch gezien heeft Typha verschillende functies vervuld, van voedselbronnen tot bouwmaterialen. Meer recentelijk is T. latifolia naar voren gekomen als een prominente soort om bioremediatie-inspanningen te ondersteunen. Met een toenemende belangstelling voor de ontwikkeling van aangelegde wetlandbehandelingssystemen (CWTS) voor de sanering van verontreinigende stoffen, zijn reproduceerbare technieken nodig om lisdodde in een laboratoriumomgeving te kweken. Het hier gepresenteerde werk onderzocht en testte verschillende groeiparameters voor de succesvolle teelt van T. latifolia uit zaad. Succesvolle ontkieming van Typha-soorten gaat gepaard met scarificatie (scheuren van de zaadhuid), wat werd bereikt met behulp van mechanische technieken voor grootschalige productie. Vroege zaadvorming bleek de eerste week gunstig te zijn voor groeiomstandigheden met weinig voedingsstoffen, gevolgd door de introductie van kunstmest in de daaropvolgende weken om de overleving na transplantatie te verbeteren. Voor microbiële bioaugmentatie van het plantensysteem toonden de resultaten aan dat het weken van de zaden in inoculum leidt tot een uitgebreidere kolonisatie van het wortelweefsel en bacteriële persistentie op de lange termijn. Een geoptimaliseerde zaadsterilisatietechniek met een combinatie van bleekmiddel en wasmiddel werd gebruikt om het succes van de kolonisatie van micro-organismen te verbeteren. De groeivaten, zowel steriel als niet-steriel, die in deze studie zijn ontworpen, ondersteunen de groei van T. latifolia op lange termijn onder verschillende omstandigheden.

Introduction

Als kosten- en energie-efficiënte technologie hebben aangelegde wetlandbehandelingssystemen (CWTS) aanzienlijk aan populariteit gewonnen voor de sanering van milieuverontreinigende stoffen ^1,2,3. CWTS maakt gebruik van fysische, chemische en biologische processen om verontreinigingen te verwijderen, te transformeren of te stabiliseren. Hoewel de fysische en chemische processen die betrokken zijn bij de chemische omzettingsgraad goed zijn gekarakteriseerd sinds het ontstaan van CWTS, bleef de impact van vegetatie grotendeels raadselachtig². In de afgelopen jaren is er meer aandacht gekomen voor het begrijpen van de mechanismen waarmee planten organische en anorganische verontreinigingen die mogelijk zorgwekkend zijn in afvalwater transformeren ^2,4,5. Mechanistische studies zoals deze zijn echter gebaseerd op het vermogen om grote aantallen macrofyten te kweken en de groei uit zaad te bevorderen om ervoor te zorgen dat elke plant zich in hetzelfde stadium van groei en ontwikkeling bevindt.

CWTS in Noord-Amerika worden vaak opgericht met behulp van vegetatie die inheems is in natuurlijke wetlands in de regio, zoals Typha-, Scirpus-, Juncus- en Phragmites-soorten ^6,7. De keuze van de vegetatie hangt ook af van het aangelegde wetland dat wordt gebruikt, dat kan variëren in diepte, waterstroom, substraatbron en waterbron (met of zonder recirculatie)². Ten slotte beïnvloedt het klimaat ook de wetlandvegetatie, waarbij koelere klimaten de voorkeur geven aan ondergedompelde planten vanwege hun verhoogde aanpassingsvermogen⁸. Typha-soorten zijn van bijzonder belang in diepe, aan de oppervlakte aangelegde wetlands vanwege hun vermogen om een omgeving snel te koloniseren en zich aan te passen aan diverse omgevingsomstandigheden ^9,10.

Een recent overzicht van de resultaten meldde dat van de 87 fytotoxiciteitstests met Typha-soorten , slechts 15 studies de testplanten uit zaad begonnen, en daarvan onderzocht slechts één studie de groei van volwassen planten¹¹. Deze ondervertegenwoordiging van lisdodde-experimenten uit zaad wijst op een lacune in de literatuur met betrekking tot protocollen die gericht zijn op het beschrijven van de teelt van lisdodde voor laboratoriumstudies. De hier beschreven protocollen zijn bedoeld om deze kloof te overbruggen door een diepgaand protocol te presenteren voor de groei van Typha latifolia van zaad tot volwassen plant onder steriele en niet-steriele omstandigheden. Daarnaast bespreekt dit artikel een techniek voor bacteriële bioaugmentatie van lisdoddesoorten in het zaadstadium, waarbij vroege inoculatie kan helpen om de persistentie van geïntroduceerde rhizo- en endofytische microben op lange termijn te behouden.

Protocol

1. Zaad scarificatie

1. Lisdoddezaden zijn in de herfst van 2023 afkomstig uit een wetland in Calgary, AB, Canada (51.11312° N, 114.39381° W). Verzamel lisdoddebloeiwijze in de herfst en bewaar in een papieren zak in het donker tot gebruik. Als de stengel nog aan zit, verzamel dan de bloeiwijze in het voorjaar, maar het zaadherstel zal afnemen.
2. Knip met een tuinschaar de stengel van de plant ~2 cm af vanaf de basis van de bloeiwijze. Trek de zaadjes van de bloeiwijze en doe ze in een laboratoriumblender tot het volume van de blender ongeveer een kwart vol is. Dit is ongeveer 250 ml zaden die niet gecomprimeerd zijn.
3. Vul de blender met 500 ml kraanwater. Houd een vrije ruimte van 10 cm aan in de blender. Mix gedurende 20 s op een middelhoge snelheid en breng onmiddellijk over naar een grote bekerglas van 1 l. De resulterende oplossing moet stroperig zijn.
4. Breng ongeveer 100 ml van dit zaadwaterslib terug in de blender en vul de blender met 400-600 ml vers kraanwater. Mix gedurende 20 s op middelhoge snelheid en breng onmiddellijk over naar een vers bekerglas van 1 l.
5. Vul het bekerglas met leidingwater tot 800 ml en laat het minstens 60 s staan. Verticuteerde en levensvatbare lisdoddezaden zullen naar de bodem van de beker zinken en de pluim en snavel (zie figuur 1 voor een beschrijving van de lisdoddezaadstructuur) zullen naar de top drijven. Schep het slib aan de bovenkant van het bekerglas eraf en giet langzaam het water uit het bekerglas zonder de zaden op de bodem te verstoren. Breng de zaden over in een bekerglas van 100 ml.
6. Herhaal het mengproces op de rest van het lisdododdenslib uit stap 1.5.
7. Plaats het bekerglas met de zaadjes op een roerplaat en draai gedurende 1 uur op gemiddelde snelheid. Schep na 1 uur al het plantmateriaal weg dat aan de bovenkant van de beker drijft.
8. Giet de zaden in een Büchner-trechter met filterpapier dat aan een vacuüm is bevestigd om de zaden een nacht te drogen. Droge zaden kunnen worden bewaard bij -20 °C in conische polypropyleen tubes van 15 ml.

2. Ontkiemen met behulp van niet-steriele techniek

1. Bereid halfsterke Murashige en Skoog (MS) mediaplaten voor met 1% fytoagar¹².
2. Doe ongeveer 1 ml droge zaden in een kegelvormige polypropyleen buis van 15 ml en vul deze met 10 ml kraanwater. Draai 24 uur op een orbitale schudder op lage snelheid om ontkieming op te wekken.
3. Verwijder overtollig water zodat er 3 ml in de conische polypropyleen buis van 15 ml achterblijft.
4. Snijd de punt van een plastic pipetpunt van 1000 μl af om de boring te vergroten en pipetier de zaadoplossing krachtig om de zaden in de pipetpunt te laten zweven.
5. Plaats zaden en water op de MS-agarplaten met halve sterkte. Draai de plaat rond om de zaden gelijkmatig te verdelen.
6. Wikkel de platen in laboratoriumafdichtingsfolie en plaats ze in een groeikamer met een licht-donkercyclus van 16 uur/8 uur bij 23 °C en een luchtvochtigheid van 70%. Incubeer de platen gedurende 1 week (maximaal 2 weken) om het ontkiemen van de zaden te stimuleren.

3. Ontkiemen met behulp van steriele techniek

OPMERKING: Verschillende protocollen voor zaadsterilisatie werden getest en vergeleken. De techniek die de hoogste kiemkracht opleverde bij het produceren van volledig gesteriliseerde zaden, werd gewijzigd ten opzichte van een eerder protocol¹³ en wordt hier beschreven.

1. Bereid MS-mediaplaten op halve sterkte voor met 1% fytoagar¹².
2. Doe een volume van ongeveer 1 ml zaden in een kegelvormige polypropyleen buis van 15 ml en vul deze met 10 ml steriele ddH₂O. Plaats op een orbitale schudder op middelhoge snelheid gedurende 10 min.
3. Verwijder het water en voeg 5 ml van een 0,1% Polysorbaat 20-oplossing (bereid in steriel ddH₂O) toe aan de conische polypropyleen buis van 15 ml. Plaats op een orbitale schudder op middelhoge snelheid gedurende 10 minuten.
4. Verwijder de oplossing en voeg 5 ml 30% in de handel verkrijgbaar bleekmiddel en 0,025% polysorbaat 20-oplossing (bereid in steriel ddH₂O) toe aan de conische polypropyleentube van 15 ml. Schud op middelhoge snelheid gedurende 30 min.
5. Verwijder de oplossing en vervang deze door steriel ddH₂O. Schud gedurende 5 minuten op middelhoge snelheid. Herhaal dit voor een totaal van 3 waterspoelingen.
6. Vul de conische polypropyleen buis van 15 ml met steriel ddH₂O en draai 24 uur op lage snelheid om kieming op te wekken. Verwijder na 24 uur het overtollige water zodat er 3 ml in de plastic buis overblijft.
7. Snijd aseptisch de punt van een plastic pipet van 1000 μl af en pipetteer krachtig om de zaden in de punt te laten zweven.
8. Plaat zaden en vloeistof op MS-agarplaten op halve sterkte. Draai de plaat rond om de zaden gelijkmatig te verdelen.
9. Wikkel de platen in laboratoriumafdichtingsfolie en plaats ze in een groeikamer met een licht-donkercyclus van 16 uur/8 uur bij 23 °C en een luchtvochtigheid van 70%. Laat de platen 1 week (maximaal 2 weken) staan om te ontkiemen.

4. Zaadinoculatie met geselecteerde bacteriën

1. Om lisdoddezaad te inoculeren, volgt u eerst het steriele ontkiemingsprotocol voor zaden hierboven tot stap 3.6 om steriele zaden te produceren. Verwijder de laatste waterspoeling uit de conische polypropyleen buis van 15 ml zoals beschreven in stap 3.6 hierboven.
2. Gebruik 's nachts gekweekte microbiële culturen die zijn geïnoculeerd uit een enkel isolaat of gemeenschap, meet de OD600 en normaliseer naar een absorptiewaarde van 1,0 door te verdunnen in kweekmedium. Incubeer culturen voor een langere periode als een OD600 van 1.0 niet wordt bereikt.
   OPMERKING: Hier werden culturen tot stand gebracht uit een Luteimonas sp. geïsoleerd uit plantenwortels in het noorden van Alberta en geconjugeerd om een DsRed fluorescerend eiwit tot expressie te brengen voor microscopische visualisatie.
3. Centrifugeer 1 ml cultuur op 9300 x g gedurende 2 min. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de pellet opnieuw in 1 ml 1x met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Draai 2 minuten op 9300 x g .
4. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de bacteriële korrel opnieuw in 1 ml steriel ddH2O.
5. Schud in een kegelvormige polypropyleen buis van 15 ml ongeveer 1 ml zaden op lage snelheid gedurende 24 uur in 10 ml van een 1:10 verdunning van het bereide inoculum met 0,025% organosiliconen oppervlakteactieve stof.
6. Volg de rest van het steriele zaadontkiemingsprotocol vanaf stap 3.8.

5. Niet-steriele lisdoddegroei op aarde

1. Vul de potten met grond met weinig organisch materiaal naar keuze en laat 1 cm ruimte over vanaf de bovenkant van de pot. Bevochtig de grond voor met kraanwater en prik gaatjes van 1 cm in de grond.
2. Verwijder met een pincet voorzichtig de 1-week ontkiemde zaailingen van de MS-agarplaten die zijn gekweekt zoals beschreven in stap 3 hierboven, en zorg ervoor dat u de wortels niet beschadigt. Plaats voorzichtig een zaailing in elk gat in de grond en bedek deze met aarde.
3. Zet de potten in een bak en vul ze met kraanwater tot het grondniveau. Voeg voor elke 10 potten 100 ml 0,5% 20/20/20 NPK-meststof toe.
4. Voeg aan elke set van tien potten als volgt meststof toe: week 2 - 100 ml 0,5% meststof, week 3 - 100 ml 1,0% meststof, week 4 - 100 ml 1,0% meststof.
5. Stop na 4 weken met de wekelijkse bemesting en bemest slechts één keer per maand met 100 ml 1,0% meststofoplossing. Na 4 weken indien nodig overplanten in grotere potten. De planten zijn op dit moment minder gevoelig voor grondsoorten, dus gebruik een mix.
6. Ga door met het verplanten van lisdodde terwijl ze hun container ontgroeien. Verwijder dood loof met een schaar. Bemest lisdodde één keer per maand.
7. Verplant voor experimenten zaailingen in een klein potje dat, wanneer het op de bodem van een lege pipetpuntdoos wordt geplaatst, aan de zijkanten van de doos wordt verankerd. Dit zorgt voor een goede overstroming van de bodem, waardoor de omstandigheden van wetlands worden nagebootst. Als er experimenten worden uitgevoerd op oudere lisdodde, verander dan op dezelfde manier, zodat de pot bijna volledig in water kan worden ondergedompeld.

6. Steriele groei van zaailingen

1. Ontwerp van de groeikamer voor zaailingen
   OPMERKING: Voor de montage van elke groeikamereenheid voor zaailingen zijn twee kweekdozen nodig, een spuit met een luer-lock-tip, een wegwerpsteriel filter van 0,2 μm en hittebestendige siliconen. Zie Figuur 2 voor een visuele weergave van de opstelling van de kamer.
   1. Verwijder de deksels van de kweekdozen en gebruik een handboor om gaten met een diameter van 3,5 cm in het midden van de deksels te maken. Gebruik hittebestendige siliconen om de bovenkant van de twee deksels aan elkaar te lijmen.
   2. Boor een gat ter grootte van de spuitpunt (~ 1 cm diameter) in de benedenhoek van een van de kweekdozen. Snijd de punt van een spuit af en gooi de romp van de spuit weg.
   3. Gebruik hittebestendige siliconen om de punt van de spuit in de kweekdoos te bevestigen met de Luer-lockschroefdraad aan de buitenkant van de doos.
   4. Laat de siliconen minimaal 24 uur uitharden voor gebruik.
2. Steriele groei in de grond
   1. Volg het steriele zaadontkiemingsprotocol beschreven in stap 3 om steriele zaden te verkrijgen.
   2. Vul de steriele groeikamerunit met aarde naar keuze, bevochtigd met kraanwater.
   3. Autoclaaf op een vloeibare cyclus van 20 minuten, waarbij de lokbevestigingspunt wordt afgedekt met aluminiumfolie. Autoclaveer het systeem na 24 uur opnieuw met een vloeibare cyclus van 20 minuten. Voer alle volgende stappen uit in een laminaire stromingskap.
   4. Bevestig een filterunit van 0.2 μm aan de Luer-lock-bevestiging op de groeikamer (afbeelding 2). Open de groeikamer en voeg 500 μL filtergesteriliseerde 1% 20/20/20 meststof toe aan de grond. Meng de grond met een steriele spatel. Voeg tijdens het mengen van de grond steriel ddH₂O toe om ervoor te zorgen dat het voldoende gehydrateerd wordt zonder oververzadiging.
   5. Gebruik een steriel scheermesje om de MS-agar van platen met zaailingen van 1 week oud in vieren te snijden. Gebruik een steriele spatel om het agarstuk op de grond te leggen.
   6. Plaats de groeikamereenheid in een plantengroeibroedmachine in een dag-nachtcyclus van 16 uur/8 uur bij 23 °C en een luchtvochtigheid van 70%.
3. Steriele groei in hydrocultuuroplossing
   1. Volg het steriele ontkiemingsprotocol dat in stap 3 wordt beschreven om steriele zaden te verkrijgen.
   2. Autoclaaf een pipettipdoosje en MS-agar op halve sterkte op een vloeibare cyclus van 20 minuten. Wikkel in een laminaire stromingskap de onderkant van het tipinzetstuk in met steriele laboratoriumafdichtingsfilm. Vul elke opening van de pipetpunt met agar tot bijna aan de bovenkant.
   3. Voeg het tipinzetstuk terug toe aan de tipbox en vul de bodem van de doos met Hoagland's hydrocultuurgroeioplossing op halve sterkte (0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1mM MgSO₄, 0,023 mM H₃BO₃, 0,005 mM MnCl₂·4H₂O, 0,0004 mM ZnSO₄·7H₂O, 0,0002 mM CuSO_{4,5H 2}O, 0,00007 mM H₂MoO_{4,1H 2}O en 0,045 mM FeSO_{4,7H 2}O, aangepast aan pH 7,0).
   4. Verwijder de zaailingen voorzichtig van de MS-agarplaten en plaats ze op de MS-agar bovenop de agar in de pipetopening in de insteek van de tipbox.
   5. Sluit het deksel van de tipbox en plaats in een groeikamer op een dag-nachtcyclus van 16 uur/8 uur bij 23 °C en een luchtvochtigheid van 70%.
   6. Als de planten te groot zijn voor de tipbox, verplant ze dan naar de kweekcel zoals beschreven in stap 5.1. Om over te brengen, verwijdert u de hele agarplug met de plant en verplaatst u deze naar een schuimstop met een radiale snede. De schuimstop kan tussen de twee kweekdozen worden geplaatst en de onderste kweekdoos kan worden gevuld met Hoagland's op halve sterkte.

Results

Figuur 1 toont een weergave van een Typha-zaad dat het verticuteringsproces heeft doorlopen, samen met een onvolledig gescarificeerd zaad waarvan de snavel is verwijderd en een niet-gescarificeerd zaad. Zorg ervoor dat de mengtijd voldoende is om voornamelijk volledig verticuteerde zaden te produceren.

Na het verticuteren en drogen van de zaden moet de levensvatbaarheid van de zaden worden getest met behulp van de niet-st...

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol biedt een gedetailleerde gids voor de groei van lisdoddesoorten uit zaad voor laboratoriumtoepassingen. Hoewel lisdodde gemakkelijk kan worden vermeerderd uit wortelstokstekken, zorgt het starten van planten uit zaad voor genetische variatie binnen een monsterset, zorgt ervoor dat planten zich in gelijke groeistadia bevinden en biedt de mogelijkheid voor vroege kolonisatie voor microbiële bioaugmentatie-experimenten. Het is belangrijk om de soorten die wo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm steriele filter	VWR	514-4126
3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetofenon	PhytoTech Labs	S7777
Kweekdozen met deksels (77 mm × 77 mm × 97 mm)	Millipore Sigma	V8505
Hittebestendige siliconenkit hi-temperatuur	Imperial Manufacturing Group	KK0205
Laboratoriumafdichtingsfolie	Millipore Sigma	P7793
Murashige en Skoog media	PhytoTech Labs	M401
Organische siliconen oppervlakteactieve stof	PhytoTech Labs	S7777
Phytoagar	GoldBiotechnology	P1003
Polysorbaat 20	Roche	11332465001