Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro Trombosetest voor ventriculaire hulpmiddelen

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67731

⸱

21 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Cardiovascular Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een benchtop-protocol om trombose te induceren in ventriculaire hulpmiddelen (VAD) binnen een recirculerend testplatform. Deze methode dient om trombogene hotspots in het bloedstroompad te identificeren en kan helpen de tromboresistentie te verbeteren voorafgaand aan preklinische tests in diermodellen.

Samenvatting

Het risico op trombose blijft een belangrijk punt van zorg bij de ontwikkeling en het klinische gebruik van ventriculaire hulpmiddelen (VAD's). Traditionele beoordelingen van VAD-trombogeniciteit, voornamelijk door middel van dierstudies, zijn kostbaar en tijdrovend, roepen ethische bezwaren op en weerspiegelen uiteindelijk mogelijk niet nauwkeurig de menselijke resultaten. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een agressief in vitro testprotocol ontwikkeld dat is ontworpen om trombose uit te lokken en potentiële risicogebieden binnen het bloedstroompad te identificeren. Dit protocol, gemotiveerd door het werk van Maruyama et al., maakt gebruik van een aangepaste antistollingsstrategie en maakt gebruik van direct beschikbare componenten, waardoor het toegankelijk is voor de meeste laboratoria die in vitro bloedtesten van VAD's uitvoeren. We hebben het nut van deze methode aangetoond door middel van iteratief testen en verfijning van een miniatuur magnetisch zwevende pediatrische VAD (PediaFlow PF5). De methode is effectief gebleken bij het identificeren van trombogene hotspots veroorzaakt door ontwerp- en fabricagefouten in vroege VAD-prototypes, waardoor gerichte verbeteringen mogelijk zijn voordat wordt overgegaan tot dierstudies. Ondanks de beperkingen, waaronder de afwezigheid van pulserende stroom en de invloed van de kenmerken van donorbloed, dient dit protocol als een praktisch hulpmiddel voor de ontwikkeling van VAD in een vroeg stadium en risicobeperking.

Inleiding

Ventriculaire hulpmiddelen (VAD's) zijn een standaardbehandeling geworden bij de behandeling van patiënten met gevorderd hartfalen, maar het risico op trombose en beroerte blijft een grote uitdaging 1,2. Trombose binnen VAD's wordt doorgaans beoordeeld tijdens preklinische dierstudies, die weliswaar waardevol zijn, maar aanzienlijke kosten en logistieke uitdagingen met zich meebrengen. Deze onderzoeken zijn arbeidsintensief, tijdrovend en zijn vatbaar voor een enkel defect dat de hele test in gevaar brengt en aanvullende proeven noodzakelijk maakt. Dit verhoogt niet alleen de financiële lasten, maar roept ook ethische bezwaren op vanwege de noodzaak van herhaalde dierproeven.

Hoewel er veel numerieke modellen bestaan voor het voorspellen van bloedplaatjesafzetting en trombose 3,4,5,6, zijn er maar een paar geschikt voor het simuleren van trombusvorming in apparaten op macroschaal zoals VAD's 7,8,9. Bovendien gaan bestaande modellen onvermijdelijk uit van geïdealiseerde oppervlakken en vereenvoudigde "waterdichte" geometrieën, die de complexiteit en onvolkomenheden van echte pompassemblages niet nauwkeurig weerspiegelen. Wanneer de interacties tussen bloedplaatjes en oppervlakken in aanmerking worden genomen, maken deze macroschaalmodellen over het algemeen gebruik van uniform voorgeschreven materiaaleigenschappen (meestal gemodelleerd als een coëfficiënt in de randvoorwaarden van de oppervlakteflux)10,11,12. Bijgevolg kunnen numerieke modellen experimenteel testen met bloed niet volledig vervangen.

Zowel de materiaalkeuze als de oppervlakteafwerking spelen een cruciale rol bij de hechting van bloedplaatjes op VAD-oppervlakken 13,14,15,16,17. Onvolkomenheden zoals ruwe plekken of onregelmatigheden kunnen de hechting van bloedplaatjes en trombusvorming bevorderen. Bovendien kunnen spleten tussen componenten in het stroompad dienen als een nidus voor trombose, waardoor een beschermde omgeving ontstaat waar stolsels kunnen ontstaan en groeien 18,19. Het gebruik van vet, smeermiddelen of kitten tijdens de montage kan ook een risico vormen, omdat deze stoffen in het stroompad kunnen sijpelen en in wisselwerking kunnen staan met het bloed, waardoor het risico op complicaties verder toeneemt.

Er is daarom behoefte aan een goed gedefinieerd in-vitrotestprotocol dat de tromboresistentie van VAD's op betrouwbare wijze kan beoordelen voordat ze worden onderworpen aan dierproeven of klinisch gebruik. Hoewel er een algemeen aanvaarde ASTM-norm is voor de beoordeling van hemolyse20, bestaat een dergelijke norm niet voor trombogeniciteitstesten van VAD's onder klinisch relevante operationele omstandigheden21. Ondanks baanbrekende studies die drie decennia oud zijn en de haalbaarheid aantonen van in vitro trombosetesten voor bloedpompen 22,23,24,25, zijn dierproeven tot op heden de facto praktijk gebleven voor het evalueren van trombose 26. De belemmering voor een bredere acceptatie van in-vitromethoden is waarschijnlijk de complexe aard van coagulatie, met de veelheid aan verstorende factoren die de testresultaten kunnen beïnvloeden, waardoor het een uitdaging is om intrinsieke pomptrombogeniciteit te onderscheiden van artefacten die ontstaan als gevolg van methodologische beperkingen en procedurefouten.

Dit motiveerde ons om een gedetailleerd protocol te delen als leidraad voor experimentalisten om valkuilen te vermijden, waardoor het gebruik van in-vitrotests wordt bevorderd en de afhankelijkheid van dierstudies wordt verminderd. Het hierin beschreven protocol, afgeleid van Maruyama et al.27, werd verfijnd en gevalideerd tijdens het ontwerp van de 5egeneratie PediaFlow (PF5) pediatrische VAD28,29. Deze testmethode bleek een belangrijke rol te spelen bij het systematisch identificeren en aanpakken van potentiële trombogene risico's in de VAD-prototypes voorafgaand aan dierproeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Volbloed van schapen dat in dit onderzoek werd gebruikt, werd verkregen van een commerciële verkoper en vereiste daarom geen beoordeling door het Institutional Animal Care and Use Committee van Cornell University.

1. Constructie van de teststroomlus

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor een gedetailleerde lijst van luscomponenten en alle andere materialen die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Wijzig de intraveneuze (IV) zak.
    1. Gebruik een plastic heatsealer om een infuuszak aan te passen om het volume en de vorm aan te passen, zoals weergegeven in afbeelding 1.
      OPMERKING: De vorm van de zak vergemakkelijkt het ontluchten en maakt het mogelijk om de zak met een hemostaat over de vloeistofleiding30,31 te klemmen. De locatie van de afdichtingslijn wordt gekozen op basis van het aanzuigvolume van de VAD en de slang om een totaal aanmaakvolume van 150 ml te bereiken.
    2. Breng een ventilatieopening aan door een incisie van 4 mm aan de bovenkant van de zak te maken. Steek een vrouwelijk luer-slot met weerhaken in de incisie en verzegel de plaats met RTV-siliconenrubberlijm. Bevestig een eenrichtingskraan aan de luer-vergrendeling.
  2. Monteer de testlus met behulp van de gemodificeerde infuuszak, polyvinylchloride (PVC) slang, polycarbonaat connectoren met weerhaken en 3-weg en 1-weg kranen, zoals weergegeven in afbeelding 1.
  3. Sluit de drukmanometer aan.
    1. Bevestig 6-inch verlengkabels aan de drukpoorten aan de inlaat- en uitlaatzijde. Bevestig een eenrichtingskraan aan het andere uiteinde van de verlengkabel.
      NOTITIE: Met de kraan kan de manometerslang worden losgekoppeld om de verlengleiding met vloeistof te vullen voordat de pomp wordt gestart, zoals beschreven in stap 4.3.
    2. Sluit het ene uiteinde van elke slang met een binnendiameter (ID) van 1/8" aan op een manometerweerhaak en plaats een mannelijke luer-fitting in het andere uiteinde.
    3. Sluit de mannelijke luer-fittingen aan op de eenrichtingskranen. Open de kranen om drukmetingen mogelijk te maken.
  4. Breng een clamp-on ultrasone flowsonde aan om het debiet te meten.
  5. Plaats een Hoffman clamp distaal van de uitlaatdrukpoort om de stromingsweerstand te regelen.

2. Bereiding van de calciumchloride (CaCl2)-oplossing

  1. Los CaCl2 in poedervorm op in 1x TRIS-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) om een 1 M-oplossing te bereiden. Vermijd fosfaathoudende buffers (bijv. PBS of DPBS), aangezien calcium en fosfaat reageren om een onoplosbaar neerslag te vormen.
  2. Als u CaCl2 in grote hoeveelheden bereidt, voeg dan het CaCl2-poeder stapsgewijs in verschillende stappen toe, aangezien het oplossen ervan een exotherm proces is.
  3. Titreer de pH van de oplossing tot 6-8 met behulp van zoutzuur (HCl) of natriumhydroxide (NaOH) indien nodig.

3. Bereiding van bloed

OPMERKING: Het schapenbloed dat in dit onderzoek is gebruikt, is verkregen van een commerciële verkoper die in de materiaaltabel staat. Het bloed werd afgenomen met behulp van een 14-G-naald, waarbij het dier in een standaard agrarische staande positie werd vastgehouden. Het verzamelproces duurde 10-12 minuten van het inbrengen van de naald tot de voltooiing. Het bloed werd gedecoaguleerd met 14 delen CPD op 86 delen bloed (CPD-formulering: 26,3 g/L Na-Citraat, 25,2 g dextrose, 3 g/L citroenzuur en 2,2 g/L Na-fosfaat in gedeïoniseerd [DI] water). De bloedzak werd 's nachts verzonden in een geïsoleerde container met ijspakken en werd binnen 24 uur na afname gebruikt voor het experiment.

  1. Bereid het donorbloed voor op gebruik.
    1. Plaats de bloedzak 15-30 minuten op een kantelbaar platform om het bloed voorzichtig te mengen en op kamertemperatuur (RT) te laten komen.
    2. Plaats een magnetische roerstaaf in een bekerglas of container van polycarbonaat die is aangewezen voor de bloedoverdracht.
    3. Breng het bloed via een transfusiefilter over in het bekerglas om macroaggregaten te verwijderen. Behandel het bloed voorzichtig om schade aan cellulaire componenten te voorkomen. Giet het bloed langs de wanden van de container om een vrije val te voorkomen en cellulair trauma te minimaliseren.
      OPMERKING: Gooi het bloed weg als er grote trombi aanwezig zijn of als het filter verstopt raakt.
    4. Plaats het bekerglas of de container op een magnetische roerder en pas de snelheid aan totdat het bloedoppervlak zachtjes begint te draaien zonder een grote draaikolk te vormen. Roer minimaal 5 minuten onophoudelijk.
    5. Meet het aantal hematocrieten en bloedplaatjes om er zeker van te zijn dat de waarden binnen het normale bereik voor de soort liggen.
  2. Voer titraties uit om de beoogde CaCl2-concentratie te bepalen.
    OPMERKING: Citrerend bloed wordt opnieuw verkalkt om stollings- en trombosetesten mogelijk te maken, waarbij heparine wordt toegevoegd om op hol geslagen stolling te voorkomen. De beoogde geactiveerde stollingstijd (ACT) voor de start van de test is 300 s. Houd er rekening mee dat de referentie-ACT-waarden in dit gedeelte zijn verkregen met behulp van donorschapenbloed en kunnen variëren afhankelijk van de soort en het niveau van antistolling dat tijdens de verzameling wordt gebruikt. Bovendien kunnen ACT-metingen variëren tussen instrumenten 32,33,34. Er kan wat vallen en opstaan nodig zijn om het optimale ACT-bereik voor een specifieke laboratoriumopstelling vast te stellen.
    1. Breng 2 ml van de bereide 1 M CaCl2-oplossing en 0,5 ml heparinenatrium (1000 E/ml) uit de verpakking van de fabrikant over in microcentrifugebuisjes om verontreiniging van de voorraadoplossingen te voorkomen.
    2. Breng 10 ml bloed over in polypropyleen reageerbuisjes van 14 ml. Bereid vier van dergelijke buizen voor.
    3. Om een heparineconcentratie van 0,5 E/ml in het bloed te bereiken, voegt u 5 μl heparinenatrium toe aan het bloedmonster van 10 ml.
    4. Om een calciumconcentratie van 5 ml in het bloed te bereiken, voegt u 50 μl 1 M CaCl2-oplossing toe aan het bloedmonster van 10 ml. Draai tijdens het doseren de pipetpunt rond om de CaCl2 over een groter gebied te verdelen.
    5. Keer de buis onmiddellijk 10 keer om, rol hem horizontaal (op een vlakke ondergrond of tussen de handpalmen) en keer hem vervolgens nog 10 keer om om een grondige menging te garanderen.
    6. Meet de ACT met behulp van een point-of-care volbloedstollingssysteem volgens de instructies van de fabrikant. De initiële ACT zal doorgaans variëren tussen 400-500 s.
    7. Terwijl de heparineconcentratie constant blijft, verhoogt u de CaCl2-concentratie (tot ongeveer 7-8 mM) om een ACT van 300 s te bereiken.
    8. Controleer de uiteindelijke concentratie en de resulterende ACT in een apart buisje bloed.

4. Procedures voorafgaand aan de test

OPMERKING: Alle stappen die in dit gedeelte worden beschreven, zijn van toepassing op de paragrafen 5 en 6. Voer deze stappen uit voordat u de pomp bedient met runderserumalbumine (BSA) of bloed in de lus. Breng bloed over tussen bloedvaten met behulp van zwaartekrachtvoeding om mechanische stress te minimaliseren. Vermijd het gebruik van de zuiger van de spuit om bloed te drijven, omdat dit overmatige druk kan veroorzaken. Vermijd bovendien het verstikken van bloed door smalle openingen om schade aan cellulaire componenten te voorkomen.

  1. Vullen en legen van de testlus
    1. Bevestig een verlengkabel van 30 inch aan de injectiepoort en sluit een spuitcilinder van 60 ml aan als trechter. Open de kraan van het reservoir om als ventilatieopening te fungeren.
    2. Giet vloeistof in de trechter en til deze indien nodig op om het vijlen te versnellen. Vul de lus tot 1-2 cm onder de ventilatieopening aan de bovenkant van de tas. Sluit de ontluchter en de kranen van de injectiepoort.
    3. Om af te tappen, opent u de ontluchter en de kranen van de injectiepoort en laat u de trechter onder het bankniveau zakken. Breng de pomp boven de afvoerpoort om de resterende vloeistof af te voeren.
  2. Ontluchten van de testlus
    NOTITIE: Voer deze procedure uit wanneer u de lus vult met BSA of bloed voordat u de pomp start.
    1. Zorg ervoor dat er nergens in de lus lucht vastzit. Maak luchtbellen op oppervlakken los door zachtjes op de slang en het reservoir te tikken en erin te knijpen.
    2. Als u een axiale bloedpomp evalueert, draait u deze in een verticale positie om eventuele lucht via drijfvermogen te laten ontsnappen. Als u een centrifugaalpomp gebruikt, draai deze dan ondersteboven en draai hem om ervoor te zorgen dat er geen lucht vastzit in secundaire stroompaden.
    3. Inspecteer de horizontale delen van de slang en de verbindingen tussen de slang en de connectoren nauwkeurig om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
    4. Knijp in de infuuszak om het vloeistofniveau dicht bij het bovenste smalle gedeelte te brengen en klem de zak met een hemostaat over de vloeistoflijn om de vloeistof-luchtinterface te elimineren. Sluit de ontluchtingskraan.
  3. Aanzuigen van de drukleidingen en de bemonsteringspoort
    1. Sluit de kraan aan het einde van de drukleidingen, verwijder de manometerslang en bevestig een spuit van 3 ml. Open de kraan en zuig 1-2 ml vloeistof in de verlenglijn (ongeveer 4 cm).
    2. Sluit de kraan, maak de spuit los en sluit de manometerslang weer aan. Open de kraan om drukmetingen mogelijk te maken.
    3. Vul de bemonsteringspoort voor met een spuit.
  4. Reiniging van de injectie- en bemonsteringspoorten
    1. Knip of scheur een pluisvrij doekje in drie gelijke stukken. Draai de hoek van een fragment om een punt te vormen en steek deze in de poort om eventueel achtergebleven bloed te absorberen.
    2. Draai het tweede fragment, bevochtig het met zoutoplossing en steek de natte punt in de poort. Draai het rond de poort om al het resterende bloed te verwijderen.
    3. Gebruik het derde fragment om eventuele resterende zoutoplossing in de poort op te nemen.
      NOTITIE: Voer deze reinigingsprocedure uit onmiddellijk na het afnemen van een bloedmonster of wanneer er restbloed in de poorten aanwezig is.

5. Passiveren van de bloedcontactvlakken

  1. Vul de lus met 1% BSA-oplossing en bedien de VAD om deze minimaal 30 minuten te laten circuleren.
  2. Inspecteer de lus op lekken en zet deze indien nodig weer in elkaar.
  3. Laat de BSA-oplossing volledig weglopen om hemodilutie te voorkomen.

6. Trombose testen

  1. Bereid de testlus voor.
    1. Vul de lus met 150 ml bloed.
    2. Ontlucht de lus en vul de drukleidingen en de bemonsteringspoort voor zoals beschreven in de stappen 4.2-4.4.
    3. Start de pomp op een laag toerental en laat hem ongeveer 5 s draaien om eventuele ingesloten luchtbellen in de pomp los te maken, en stop vervolgens de pomp.
    4. Als er luchtbellen in de zak verschijnen, herhaalt u stap 4.2 om opnieuw te ontluchten.
    5. Start de pomp opnieuw op een lage snelheid om het bloed in de lus te laten circuleren.
  2. Voeg heparine toe aan het bloed in de lus.
    1. Breng 1 ml heparine-natrium (1000 E/ml) en 1,5 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; 0,5 M) over van de verpakking van de fabrikant in afzonderlijke buisjes om het gebruik tijdens de test te vergemakkelijken.
    2. Gebruik de dwarse poort van de 3-weg kraan om stoffen met een spuit in de lus toe te dienen. Draai de mannelijke luer-vergrendeling op de kraan zodat de injectiepoort naar boven wijst om luchtbellen aan de bovenkant op te vangen.
    3. Bereik een heparineconcentratie van 0,5 E/ml in de lus door 75 E heparinenatrium toe te voegen aan 150 ml bloed. Aspireer 75 E heparine (75 μl bij gebruik van een concentratie van 1000 E/ml) in een micropipet en doseer deze in een spuit van 3 ml door tegelijkertijd de pipet te doseren en de zuiger van de spuit op te zuigen. Zorg ervoor dat alle vloeistof wordt overgebracht zonder te morsen.
    4. Bevestig de spuit aan de injectiepoort via de luer-vergrendeling, met de poort naar boven en de punt van de spuit verticaal naar beneden. Trek de zuiger van de spuit aan om deze met bloed te vullen en meng de heparine met het bloed terwijl u eventuele lucht in de spuit opzuigt. Laat de luchtbel naar de bovenkant van de spuit stijgen. Injecteer het mengsel in de lus en zorg ervoor dat er geen lucht binnendringt.
    5. Pendel het bloed 4-5 keer in en uit de spuit om ervoor te zorgen dat het gehepariniseerde bloed niet beperkt blijft tot de ruimte in de haven. Zorg ervoor dat er geen lucht in de lus komt.
  3. Titreer de ACT van bloed in de lus.
    1. Bereik een initiële calciumconcentratie van 5 mM in de lus door 750 μl 1 M CaCl2-oplossing toe te voegen aan 150 ml bloed volgens dezelfde procedure als heparine.
      1. Bloed dat wordt blootgesteld aan hoge calciumconcentraties kan in de spuit gaan stollen. Spuit de vloeistof snel in na het verwijderen van restlucht. Verdun eventueel de CaCl2 in de spuit met 1 ml TRIS-gebufferde zoutoplossing om het risico op voortijdige stolling te verminderen.
    2. Laat de geïnjecteerde CaCl2 ten minste 2 minuten in de lus circuleren voordat u een bloedmonster neemt om de initiële ACT te meten.
    3. Sluit een spuit van 1 ml aan op de bemonsteringspoort. Zuig 0,5 ml afvalwater op en gooi ze weg om stilstaand bloed uit de poort te verwijderen.
    4. Bevestig een nieuwe spuit van 1 ml, neem 0,5 ml bloed af voor analyse en meet de ACT. Reinig de bemonsteringspoort met behulp van de procedure in stap 4.4.
    5. Raadpleeg de titratiewaarden in stap 3.2 om de beoogde CaCl2-concentratie te bepalen. Verhoog stapsgewijs de calciumconcentratie om een ACT van 300 s te bereiken. Vermijd het toevoegen van de volledige hoeveelheid CaCl2 in één keer om snelle stolling te voorkomen.
      OPMERKING: In de tests die in dit onderzoek zijn gebruikt, resulteerde de initiële calciumconcentratie van 5 mM in een ACT van 450 ± 50 s, en de uiteindelijke concentratie van 7-8 mM leverde een ACT op van 300 ± 20 s. Hoewel deze reactie kan variëren, moet u ernaar streven de ACT voor het begin van de test op of onder de 300 s te brengen.
  4. Begin met de test.
    1. Zodra de ACT van 300 s in de lus is bereikt, begint u met de 1-uurstest. Stel de pomp in op het gewenste debiet en de gewenste druk door de rotorsnelheid aan te passen en de weerstand te regelen met behulp van de Hoffman clamp.
    2. Meet de ACT elke 15 minuten volgens de stappen 6.3.3-6.3.4.
    3. Als de ACT onder de 200 s daalt, injecteer dan nog eens 25 E heparinenatrium in de lus.
  5. Beëindig de test.
    1. Injecteer aan het einde van 1 uur EDTA in de lus om verdere stolling te remmen, gericht op een uiteindelijke concentratie van 5 mM in het bloed. (Injecteer 1,5 ml bij gebruik van een 0,5 M EDTA-oplossing.)
    2. Laat de EDTA 2 minuten circuleren en mengen en stop dan de pomp.
  6. Koppel de pomp los en spoel deze door.
    1. Klem de slang vast die is aangesloten op de inlaat en uitlaat van de pomp met behulp van hemostaten en plaats de klemmen op 3-4 cm afstand van de inlaat en uitlaatweerhaken.
    2. Koppel de slang voorzichtig los om de pomp te ontgrendelen.
    3. Tap het bloed uit de pomp af en stroomlus in een container.
    4. Spoel eventueel achtergebleven bloed van de pomp door middel van zwaartekrachttoevoer of pipetterende zoutoplossing via de inlaat en uitlaat van de pomp.
      OPMERKING: Stap 6.7 en 6.8 worden gelijktijdig uitgevoerd.
  7. Inspecteer het stroompad van de pomp.
    1. Maak beelden van de inlaat en uitlaat van de pomp met behulp van een endoscoop-/borescoopcamera.
    2. Demonteer de pomp (indien van toepassing). Was de onderdelen in een zoutbad en inspecteer ze op trombi met behulp van een ontleedkijker of macrolens.
    3. Fotografeer oppervlakken die in contact komen met bloed voor documentatie.
      OPMERKING: Consistente inspectie en grondige documentatie zijn van cruciaal belang voor vergelijkende tests.
  8. Filter het gebruikte bloed.
    1. Knip een stuk nylon gaasstof van 100 μm dat groot genoeg is om de opening van een opvangbak te bedekken.
    2. Plaats het gaas over de container met een lichte drapering zodat het bloed er effectief doorheen kan stromen. Zet de randen van het gaas vast om te voorkomen dat het wegglijdt tijdens het filteren.
    3. Haal het gebruikte bloed door nylon gaas. Gooi het bloed weg volgens de richtlijnen voor de verwerking van biologisch afval van de instelling.
    4. Onderzoek het gaas op opgevangen trombi en documenteer de bevindingen.
  9. Bereid je voor op histologische analyse.
    1. Als histologische analyse is gepland, repareer dan eventuele trombi in de formalineoplossing volgens de juiste veiligheidsprocedures.
      LET OP: Gebruik altijd een zuurkast bij het hanteren van formaldehyde.

7. Reinigingsprocedure

  1. Demonteer de stroomlus. Gooi de PVC-bloedzak en -slang weg.
  2. Week alle andere componenten die in contact komen met bloed (connectoren, afsluitkranen, luer-locks, enz.) een nacht in een 1% enzymactieve wasmiddeloplossing in poedervorm. Spoel af met warm kraanwater, gevolgd door DI-water, en laat aan de lucht drogen.
    1. Als er stolsels achterblijven, sonificeer dan de componenten in de wasmiddeloplossing. Grondig afspoelen en aan de lucht laten drogen.
  3. Maak de pomp schoon.
    1. Als de pomp kan worden gedemonteerd, week en sonificeer dan de onderdelen die in contact komen met bloed met een 1% allesreiniger/ontvetteroplossing, gevolgd door een 1% enzymactieve wasmiddeloplossing in poedervorm.
    2. Als de pomp niet kan worden gedemonteerd, sluit deze dan aan op een nieuwe stroomlus gevuld met reinigingsoplossingen en laat deze minimaal 30 minuten op hoge snelheid draaien. Herhaal indien nodig.
  4. Spoel de pomp grondig af met warm kraanwater, gevolgd door gedemineraliseerd water en laat aan de lucht drogen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Succesvolle uitvoering van dit protocol maakt het mogelijk om gelokaliseerde gebieden met bloedplaatjesafzetting te identificeren, waardoor problematische plekken in het stroompad van de pomp aan het licht komen. Consistente toepassing van dit protocol maakt incrementele verbeteringen mogelijk door deze geïdentificeerde "hotspots" aan te pakken.

Zo kwamen we tijdens de ontwikkeling van de PediaFlow PF5 VAD uitdagingen tegen bij het handmatig polijsten van de d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het eerste onderzoek bij mensen met een nieuwe pomp is altijd een precaire onderneming, aangezien preklinische studies de trombogeniciteit van VAD's bij mensen niet betrouwbaar kunnen voorspellen26. Met name sommige VAD's die in dierproeven aantoonden vrij te zijn van trombose, hebben later een significante trombogeniciteit vertoond bij klinisch gebruik36. Een agressief in-vitrotestregime dat speciaal is ontworpen om trombose uit t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

S.E.O. is momenteel consultant voor Magenta Medical en was voorheen consultant bij Boston Scientific. Geen enkele andere auteur heeft relevante financiële onthullingen of belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant R01HL089456 en het Medical Research Acquisition Activity Project Number W81XWH2010387 van het Amerikaanse leger.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14-mL test tubesFalcon352059Rondbodem polypropyleen testbuisjes met klikkap
1-way stopcockQosina99759Vrouwelijke Luer Lock, mannelijke Luer met Spin Lock
3-way stopcockQosina997712 vrouwelijke Luer Locks, roterende mannelijke Luer Lock
ACT+ cuvettes voor HemochronWerfen000JACT+45/doos
All-purpose cleaner/ontvetterSimple Green2710200613005Simple Green Reiniger en Ontvetter. Gebruik 1% oplossing.
Barbed connectorsQosina73311Materiaal: polycarbonaat; ¼” x ¼” rechte connector
Barbed connectors met luer lockQosina73316Materiaal: polycarbonaat; ¼” x ¼” rechte connector met luer lock
Bovine Serum Albumin (BSA)Thermo Scientific ChemicalsAAJ6465522Of gelijkwaardig
Calcium chloride, CaCl2Thermo Scientific ChemicalsAA89866-30Watervrij, ≥96,0% ACS
Dissectie microscoop (aanbevolen)Olympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/Olympus SZH10 (continue zoomvergroting 7x - 70x) of vergelijkbaar
DPBS (zonder calcium en magnesium)Gibco14200075Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing, geen calcium, geen magnesium, 10X (moet worden verdund tot 1X voor gebruik)
EDTAQuality Biological351-027-721EA0,5 M, pH 7,0–8,0 (Ethyleendiaminetetraazijnzuur)
Endoscoop/borescope/otoscoop camera (optioneel)Bebirdhttps://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers3–4 mm sonde diameter
Enzyme-actief poederwasmiddelAlconox1304-1Alconox Tergazyme. Gebruik 1% oplossing.
Extension Line, 30"Qosina 3621830" lengte,  vrouwelijke luer lock naar mannelijke luer lock
Extension Line, 6"Qosina 362126" lengte,  vrouwelijke luer lock naar mannelijke luer lock
Vrouwelijke luer lock, barbedQosina11548Past op 1/8 inch ID slang; materiaal: polycarbonaat;
Flow meterTransonichttps://www.transonic.com/t402-t403-consolesTransonic TS410 module
HemostatFisherbrand13-820-004Vergrendelings hemostat met minimaal 5 cm tip lengte
Heparine NatriumMcKesson Packaging Services9495131000 U/mL concentratie
Hoffman klemHumboldtH8720Fijn-gedraaide klem
IV-zak (conforme bloed reservoir)Qosina51494Materiaal: PVC, 2 buispoorten 0,258” ID. De 100-ml zak wordt gemodificeerd met behulp van een hechtsealer
Lint-vrije doekjesKimberly-Clark Professional34120Kimtech Science Wipers
Magneet roerderINTLLABMS-500Of soortgelijk
Mannelijke luer lock, barbedQosina11549Past op 1/8 inch ID slang; materiaal: polycarbonaat;
Manometer (digitaal)Sper Scientific840081SPER-840081 of soortgelijk
Nylon filter gaasMcMaster-Carr9318T21100-μm (0,0039") openingsgrootte
SchapenbloedLampire7209004Donor vol bloed, anticoaguleerde met ACD 14:86, overnacht verzonden
Kunststof zak hechtsealerUlineH-190Uline H-190 of soortgelijk (zonder snijder)
Siliconen rubber lijmSmooth-On B00IRC1YI0Sil-Poxy of soortgelijk
Spuit met luer lock, 1 mLFisher Scientific14-955-646Fisherbrand handmatige spuit zonder naald voor onderzoeksdoeleinden
Spuit met luer lock, 3 mLFisher Scientific14-955-457Fisherbrand handmatige spuit zonder naald voor onderzoeksdoeleinden
Spuit met luer lock, 60 mLFisher Scientific14-955-461Fisherbrand handmatige spuit zonder naald voor onderzoeksdoeleinden
Transfusie filterHaemonetics Corporation SQ40S/SQ40NSHaemonetics Corporation SQ40S pall bloedtransfusiefilter
TRIS Buffered SalineThermo Scientific ChemicalsAAJ62938K2TBS 10x (moet worden verdund tot 1X voor gebruik), pH 7,4
SlangTygonADF00017Tygon ND-100-65 slang (medisch graad)
Ultrasonische flow sensorTransonichttps://www.transonic.com/hqxl-flowsensorsSelecteer geschikte flow sensor model voor de gebruikte slang grootte. ME6PXL klem-op sensor past de 3/8” OD slang. De sensor wordt gekalibreerd door Transonic voor de testvloeistof (bijv. bloed bij  24C) en slang graad (bijv. Tygon ND-100-65)
Ultrasonische sonicator (optioneel)Branson UltrasonicsCPX952238RBranson CPX2800H of soortgelijk
VAD systeemPediaFlowPF5Het te testen VAD systeem; omvat de pomp en de controller
Whole Blood Coagulation SystemWerfenhttps://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-eliteHemochron Signature Elite of Signature Jr

Referenties

  1. Kirklin, J. K., et al. Eighth annual INTERMACS report Special focus on framing the impact of adverse events. J Heart Lung Transplant. 36 (10), 1080-1086 (2017).
  2. Kormos, R. L., et al. The Society of Thoracic Surgeons Intermacs Database Annual Report: Evolving indications, outcomes, and scientific partnerships. Ann Thorac Surg. 107 (2), 341-353 (2019).
  3. Leiderman, K., Fogelson, A. An overview of mathematical modeling of thrombus formation under flow. Thromb Res. 133 (SUPPL. 1), S12-S14 (2014).
  4. Anand, M., Rajagopal, K. A short review of advances in the modelling of blood rheology and clot formation. Fluids. 2 (3), 35(2017).
  5. Belyaev, A. V., Dunster, J. L., Gibbins, J. M., Panteleev, M. A., Volpert, V. Modeling thrombosis in silico: Frontiers, challenges, unresolved problems and milestones. Phys Life Rev. 26- 27, 57-95 (2018).
  6. Manning, K. B., Nicoud, F., Shea, S. M. Mathematical and computational modeling of device-induced thrombosis. Curr Opin Biomed Eng. 20, 100349(2021).
  7. Wu, W. T., Yang, F., Wu, J., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. High fidelity computational simulation of thrombus formation in Thoratec HeartMate II continuous flow ventricular assist device. Sci Rep. 6 (Decemeber), 1-11 (2016).
  8. Méndez Rojano, R., Lai, A., Zhussupbekov, M., Burgreen, G. W., Cook, K., Antaki, J. F. A fibrin enhanced thrombosis model for medical devices operating at low shear regimes or large surface areas. PLoS Comput Biol. 18 (10), e1010277(2022).
  9. Taylor, J. O., Meyer, R. S., Deutsch, S., Manning, K. B. Development of a computational model for macroscopic predictions of device-induced thrombosis. Biomech Model Mechanobiol. 15 (6), 1713-1731 (2016).
  10. Strong, A. B., Stubley, G. D., Chang, G., Absolom, D. R. Theoretical and experimental analysis of cellular adhesion to polymer surfaces. J Biomed Mater Res. 21 (8), 1039-1055 (1987).
  11. Sorensen, E. N., Burgreen, G. W., Wagner, W. R., Antaki, J. F. Computational simulation of platelet deposition and activation: I. Model development and properties. Ann Biomed Eng. 27 (4), 436-448 (1999).
  12. Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Wagner, W. R., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. Multi-constituent simulation of thrombus deposition. Sci Rep. 7 (1), 42720(2017).
  13. Yamane, T. How Do We Select Materials. Mechanism of Artificial Heart. , Springer. Tokyo. (2016).
  14. Sin, D., Kei, H., Miao, X. Surface coatings for ventricular assist devices. Expert Rev Med Devices. 6 (1), 51-60 (2009).
  15. Zhang, M., Tansley, G. D., Dargusch, M. S., Fraser, J. F., Pauls, J. P. Surface coatings for rotary ventricular assist devices: A systematic review. ASAIO J. 68 (5), 623-632 (2022).
  16. Linneweber, J., Dohmen, P. M., Kerzscher, U., Affeld, K., Nosé, Y., Konertz, W. The effect of surface roughness on activation of the coagulation system and platelet adhesion in rotary blood pumps. Artif Organs. 31 (5), 345-351 (2007).
  17. Jayaraman, A., Kang, J., Antaki, J. F., Kirby, B. J. The roles of sub-micron and microscale roughness on shear-driven thrombosis on titanium alloy surfaces. Artif Organs. 47 (3), 490-501 (2023).
  18. Jamiolkowski, M. A., Pedersen, D. D., Wu, W., Antaki, J. F., Wagner, W. R. Visualization and analysis of biomaterial-centered thrombus formation within a defined crevice under flow. Biomaterials. 96, 72-83 (2016).
  19. Zhussupbekov, M., Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Massoudi, M., Antaki, J. F. Influence of shear rate and surface chemistry on thrombus formation in micro-crevice. J Biomech. 121, 110397(2021).
  20. ASTM F1841-19: Standard practice for assessment of hemolysis in continuous flow blood pumps. , ASTM International. At https://www.astm.org/f1841-19.html (2019).
  21. Sarode, D. N., Roy, S. In vitro models for thrombogenicity testing of blood-recirculating medical devices. Expert Rev Med Devices. 16 (7), 603-616 (2019).
  22. Swier, P., Bos, W. J., Mohammad, S. F., Olsen, D. B., Kolff, W. J. An in vitro test model to study the performance and thrombogenecity of cardiovascular devices. ASAIO Trans. 35 (3), 683-686 (1989).
  23. Schima, H., et al. In vitro investigation of thrombogenesis in rotary blood pumps. Artif Organs. 17 (7), 605-608 (1993).
  24. Tayama, E., et al. In vitro thrombogenic evaluation of centrifugal pumps. Artif organs. 21 (5), 418-420 (1997).
  25. Paul, R., et al. In vitro thrombogenicity testing of artificial organs. Int J Artif Organs. 21 (9), 548-552 (1998).
  26. Jamiolkowski, M. A., Snyder, T. A., Perkins, I. L., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Preclinical device thrombogenicity assessments: Key messages from the 2018 FDA, industry, and academia forum. ASAIO J. 67 (2), 214-219 (2021).
  27. Maruyama, O., Tomari, Y., Suciyama, D., Nishida, M., Tsutsui, T., Yamane, T. Simple in vitro testing method for antithrombogenic evaluation of centrifugal blood pumps. ASAIO J. 55 (4), 314-322 (2009).
  28. Olia, S. E., et al. Preclinical performance of a pediatric mechanical circulatory support device: The PediaFlow ventricular assist device. J Thorac Cardiovasc Surg. 156 (4), 1643-1651.e7 (2018).
  29. Borovetz, H. S., Olia, S. E., Antaki, J. F. Toward the Development of the PediaFlowTM Pediatric Ventricular Assist Device: Past, Present, Future. Appl Eng Sci. 11, 100113(2022).
  30. Herbertson, L. H., et al. Multilaboratory study of flow-induced hemolysis using the FDA benchmark nozzle model. Artif Organs. 39 (3), 237-248 (2015).
  31. Olia, S. E., Herbertson, L. H., Malinauskas, R. A., Kameneva, M. V. A reusable, compliant, small volume blood reservoir for in vitro hemolysis testing. Artif Organs. 41 (2), 175-178 (2017).
  32. Doherty, T. M., Shavelle, R. M., French, W. J. Reproducibility and variability of activated clotting time measurements in the cardiac catheterization laboratory. Catheter Cardiovasc Interv. 65 (3), 330-337 (2005).
  33. Chia, S., Van Cott, E. M., Raffel, C. O., Jang, I. -K. Comparison of activated clotting times obtained using Hemochron and Medtronic analysers in patients receiving anti-thrombin therapy during cardiac catheterisation. Thromb Haemost. 101 (03), 535-540 (2009).
  34. Li, H., Serrick, C., Rao, V., Yip, P. M. A comparative analysis of four activated clotting time measurement devices in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Perfusion. 36 (6), 610-619 (2021).
  35. Hastings, S. M., Ku, D. N., Wagoner, S., Maher, K. O., Deshpande, S. Sources of circuit thrombosis in pediatric extracorporeal membrane oxygenation. ASAIO J. 63 (1), 86-92 (2017).
  36. Starling, R. C., et al. Unexpected abrupt increase in left ventricular assist device thrombosis. N Engl J Med. 370 (1), 33-40 (2014).
  37. Hastings, S. M., Deshpande, S. R., Wagoner, S., Maher, K., Ku, D. N. Thrombosis in centrifugal pumps: Location and composition in clinical and in vitro circuits. Int J Artif Organs. 39 (4), 200-204 (2016).
  38. Patel, M., Jamiolkowski, M. A., Vejendla, A., Bentley, V., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Effect of temperature on thrombogenicity testing of biomaterials in an in vitro dynamic flow loop system. ASAIO J. 69 (6), 576-582 (2023).
  39. ASTM F2888-19: Standard practice for platelet leukocyte count-An in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials. , ASTM International. Available from: https://www.astm.org/f2888-19.html (2019).
  40. Patel, M., Serna, C., Parrish, A., Gupta, A., Jamiolkowski, M., Lu, Q. Alternative anticoagulant strategy to improve the test sensitivity of ASTM F2888-19 standard for platelet and leukocyte count assay. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 112 (12), e35514(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Trombose testenbloedstroompadbenchtop protocolgeactiveerde stollingstijdcalciumchloride titratieplaatjesdepositiepomp prototypingalternatieven voor dierproeven
In vitro Trombosetest voor ventriculaire hulpmiddelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.