Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genoombewerking in de gelekoortsmug Aedes aegypti met behulp van CRISPR-Cas9

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67732

⸱

21 maart 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2School of Biological Sciences, Department of Ecology, Behavior, and Evolution, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor genoombewerking door middel van embryonale micro-injectie in de mug A. aegypti met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie.

Samenvatting

De opkomst van de geclusterde, regelmatig afgewisselde, korte palindromische herhalingen (CRISPR)-Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van genetische manipulatie en de deuren geopend voor nauwkeurige genoombewerking in meerdere soorten, inclusief niet-modelorganismen. Bij de mug Aedes aegypti zijn met deze technologie mutaties met functieverlies en DNA-inserties tot stand gebracht. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor genoombewerking door middel van embryonale micro-injectie in de mug A. aegypti met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie, met de nadruk op zowel het genereren van gen-knock-out als knock-inlijnen. In dit protocol worden kwartsnaalden gevuld met een mengsel van gids-RNA, recombinant Cas9 en een plasmide met een DNA-cassette die codeert voor een gen voor een fluorescerende marker, als genknockin gewenst is. Embryo's in het preblastoderm-stadium worden op een rij gezet op een strook dubbelzijdig plakband die op een dekglaasje wordt geplaatst, dat vervolgens op een glasplaatje wordt gemonteerd. Met behulp van een micro-injector worden de naalden voorzichtig in het achterste uiteinde van de embryo's ingebracht en wordt een klein volume van het CRISPR-mengsel afgegeven. Wanneer de embryo's zijn uitgebroed, worden de larven gecontroleerd onder de fluorescerende scoop en worden de poppen op geslacht gesorteerd en gescheiden in verschillende kooien. Zodra de volwassenen tevoorschijn komen, worden deze wederzijds gekruist met wildtype individuen, met bloed gevoed en geplaatst om eieren te leggen. Zodra deze eieren zijn uitgekomen, vertegenwoordigen de verzamelde fluorescerende larven individuen met een stabiele invoeging van de DNA-cassette in hun genoom. Deze larven worden vervolgens gekweekt tot het volwassen stadium, gekruist met wildtype individuen en vervolgens verder beoordeeld door middel van moleculaire technieken om te bevestigen dat de exacte sequentie van de DNA-cassette aanwezig is op de gewenste plaats van het muggengenoom. Homozygote lijnen kunnen ook worden verkregen door de meegeleverde pijplijn van kruisingsschema en moleculaire screening van de mutaties te volgen.

Inleiding

Nauwkeurige genoombewerking is aantoonbaar eenvoudiger geworden, maar mogelijk, met de oprichting van de CRISPR-Cas-technologieën van moleculaire scharen1. Deze technologieën maken gebruik van een mechanisme dat het prokaryote immuunsysteem gebruikt om faaginfecties te bestrijden2. Onder deze systemen zijn geclusterde, regelmatig afgewisselde, korte palindromische herhalingen (CRISPR) samen met de Cas9-nuclease meestal gebaseerd op 20 basenpaar-RNA's, de gids-RNA's (gRNA's), met sequenties die homoloog zijn aan het beoogde DNA, die worden gevolgd door een NGG protospacer aangrenzend motief (PAM) sequentie3. De gRNA's die op de Cas9 zijn geladen, leiden deze nucleasen precies naar specifieke doelwitten in het genoom, waardoor dubbelstrengs DNA-breuken worden veroorzaakt3.

Dubbelstrengsbreuken in het DNA induceren de reparatiemechanismen om de dubbele helix4 te patchen. Hoewel van DNA-reparatie wordt verwacht dat deze nauwkeurig is, bestaan er minder nauwkeurige DNA-reparatiemechanismen die sequentielittekens kunnen achterlaten en, op hun beurt, mutaties met functieverlies4. Onder de foutgevoelige DNA-reparatiemechanismen kan de niet-homologe eindverbinding (NHEJ) frame-shift-mutaties veroorzaken, waaronder kleine deleties, inserties en nucleotideveranderingen (SNP's), die kunnen resulteren in mutatie met functieverlies. Het Homology Directed Repair (HDR)-mechanisme daarentegen vertrouwt op het homologe chromosoom als een sjabloon om de exacte sequentie van het onbeschadigde allel te kopiëren en een perfecte reparatie van de beoogde DNA-sequentie te maken4.

Op basis van deze kennis is de CRISPR-Cas9-technologie ontwikkeld om genomen nauwkeurig te bewerken, aantoonbaar op elke sequentie die een PAM-sitebevat 3. Bij muggen is de CRISPR-Cas9-technologie gebruikt om een verscheidenheid aan genen uit te schakelen, door middel van embryonale micro-injectie van een mengsel van Cas9 en gRNA's, gebruikmakend van het NHEJ-reparatiemechanisme 5,6. Vergelijkbare kiembaanmutagenese wordt verkregen met de injectie van gRNA + Cas9-mengsel in de hemolymfe van volwassen vrouwelijke muggen7. Deze technologie werd ReMOT-controle genoemd en is gebaseerd op een aangepaste versie van een Cas9 gelabeld met een peptide dat door de eierstokken wordt opgenomen door middel van endocytose tijdens het proces van ei-ontwikkeling (vitellogenese)7. Het inbrengen van specifieke gencassettes in een genoom is alleen mogelijk door embryonale micro-injectie van een mengsel van gRNA en Cas9 (of een plasmide dat die moleculen tot expressie brengt) samen met een plasmide dat codeert voor een gewenste DNA-cassette8. Door gebruik te maken van het HDR-mechanisme, wordt het plasmide met de DNA-cassette van belang, geflankeerd door homologe sequenties (500-1,000 bp)9,10 stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doellocatie, gebruikt als een sjabloon om de dubbelstrengsbreuk te herschrijven, waarbij ook de DNA-cassette in de doelsequentie9 wordt gekopieerd.

De CRISPR-Cas9-technologie is gebruikt om meerdere genen uit te schakelen die voornamelijk betrokken zijn bij de sensorische systemen in de mug Aedes aegypti11, maar ook genen die verband houden met mannelijke vruchtbaarheid en vrouwelijke levensvatbaarheid (PgSIT) voor populatiecontrole12. Het uitschakelen van doelgenen is ook bereikt door genen die coderen voor fluorescerende markers in de coderende sequenties van specifieke genen in te voegen13,14. Deze strategie heeft het voordeel dat er niet alleen frame-shift-mutaties worden induceerd, maar ook dat het gebruik van fluorescerend licht mogelijk is om de individuen van de nieuwe knock-outlijnte sorteren 13,14. Het A. aegypti-genoom is ook bewerkt met sequenties van binaire expressiesystemen, zoals het Q-systeem (QF-QUAS)11. Het inkloppen van het gen dat codeert voor de QF-transactivator stroomafwaarts naar een promotor van een specifiek gen zorgt voor een gedefinieerde spatiotemporele expressie van de transactivator15,16. Zodra een QF-expressie muggenlijn wordt gekruist met een andere muggenlijn die de bindingsplaatsen (QUAS) voor QF bevat, bindt deze laatste eraan en activeert de expressie van genen stroomafwaarts van de QUAS-sequentie15,16. Dit systeem maakt over het algemeen weefsel- en tijdspecifieke expressie van dergelijke effectorgenen mogelijk, die fluorescerende markers kunnen zijn die worden gebruikt voor cellokalisatie of detectie van neuronale activiteit, en zelfs Cas9-nucleasen voor het verstoren van genen in specifieke weefsels (d.w.z. somatische knock-out)11.

Gezien alle informatie die beschikbaar is voor de genetische transformatie van A. aegypti , bieden we hierin een gedetailleerd protocol met stapsgewijze aanwijzingen voor het uitvoeren van genoombewerking met het CRISPR-Cas9-systeem door middel van embryonale micro-injectie. Strategieën voor het genereren van zowel knock-out, door middel van frame-shift mutaties en deleties gemedieerd door NHEJ, als knockinlijnen, door HDR-gemedieerde gencassette-inserties, worden besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Details met betrekking tot de apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. Alle dieren werden behandeld volgens de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, zoals aanbevolen door de National Institutes of Health. De procedures werden goedgekeurd door het UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Use Protocol #S17187) en UCSD Biological Use Authorization (BUA #R2401).

1. gRNA's en ontwerp van donorplasmide

  1. Voor het maken van knock-outmutanten ontwerpt u twee gRNA's met een tussenpoos van ~20-100 bp (Figuur 1A).
    1. Ontwerp 20 bp gRNA's voor CRISPR-Cas9, met uitzondering van de PAM-sequentie (NGG) met behulp van een online tool (Figuur 1A), zoals CHOPCHOP ( https://chopchop.cbu.uib.no/)17of Benchling (benchling.com) of CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)18. Selecteer de meest specifieke en off-target-vrije gRNA's voor experimenten, zoals voorgesteld door de online tool.
    2. Zorg ervoor dat een efficiënte restrictie-enzymknipplaats wordt opgenomen in de sequentie tussen de gRNA-snijplaatsen (Figuur 1A). Voeg een restrictie-enzymplaats toe tussen gRNA-knipplaatsen om een snelle visuele bevestiging van succesvolle bewerkingen mogelijk te maken.
      OPMERKING: Wanneer de deletie optreedt, wordt de restrictieplaats verwijderd, zodat het enzym de sequentie niet zal verbreken en een enkele, niet-doorgesneden band op een gel produceert om de deletie te bevestigen.
  2. Voor HDR-gemedieerde gencassette-inserties ontwerpt u meerdere gRNA's met behulp van de genoemde tools voor het maken van knock-outmutanten en selecteert u de meest effectieve na latere evaluatie.
  3. Ontwerp donorplasmiden voor Homology-Directed Repair (HDR) met homologiearmen op de doellocatie, de cargo-DNA-sequentie, een fluorescerende marker, de oorsprong van replicatie en een antibioticaresistentiegen (Figuur 1B).
    1. Kies de homologiearmen uit de stroomopwaartse en stroomafwaartse regio's van de doellocatie, elk met een lengte van 500-1.000 bp10 (Figuur 1B).
    2. Selecteer de ladingsequentie, die een fluorescerende marker, een interessant gen of een regulerend element (bijv. QF2) kan bevatten.
    3. Selecteer een fluorescerende markering. Veel voorkomende fluorescerende markers die worden gebruikt voor A. aegypti zijn opgenomen in een DNA-cassette met een promotor, een fluorescerend markercoderend gen en een 3' UTR-sequentie. Zie de discussie voor meer details.

2. Bereiding van de injectiemix

  1. Verdun het Cas9-eiwit met de Cas9-verdunningsbuffer tot 1 μg/μL.
    LET OP: Cas9 niet meer dan 2x ontdooien en invriezen. Het is aan te raden om aliquots te maken van het Cas9 eiwit.
  2. Koop de gRNA's of produceer ze in eigen huis.
    OPMERKING: Gebruik voor interne productie standaard RNA-ontsmettingspraktijken en RNA-vrije materialen.
    1. Ontwerp 4-6 gRNA's en kies de twee beste gRNA's voor injectie (zie in vitro splitsingstest hieronder).
    2. Ontwerp een voorwaartse primer die de T7-promotorsequentie stroomopwaarts van de gRNA-sequentie omvat. Gebruik de universele gRNA reverse primer voor de niet-sjabloon PCR-reacties, zoals hieronder beschreven. De overlappende sequentie paren met de corresponderende sequentie in de universele omgekeerde primer (vet en onderstreept), waardoor een sjabloon ontstaat voor het DNA-polymerase om hun sequenties te versterken.
      OPMERKING: Voor deze PCR-reacties moet de voorwaartse primer de T7-promotor (vetgedrukt) bevatten, gevolgd door twee guanines (belangrijk voor transcriptie-initiatie via T7 RNA-polymerase), de 20-nucleotidesequentie van het gRNA (N20; zonder de PAM-sequentie) en de overlappende sequentie van de primer (onderstreept).
      Primer vooruit: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Primer omgekeerd: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
    3. Synthese van de DNA-sjabloon door middel van niet-sjabloon-PCR. Zet meerdere reacties op (elk met 12,5 μl van de 2x mastermix, 1,25 μl van de 10 μM-oplossing van voorwaartse primer, 1,25 μl van de 10 μM-oplossing van omgekeerde primer en 10 μl ultrapuur water) zodat er voldoende PCR-product (300 ng) beschikbaar is voor de in vitro transcriptiereactie. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: eerste denaturatie gedurende 30 s bij 98 °C; 35 amplificatiecycli gedurende 10 s bij 98 °C, 10 s bij 62 °C en 10 s bij 72 °C; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 2 min; en opslag bij 4 °C.
    4. Bevestig de amplificatie van een enkel DNA-fragment (122 basenparen) op een agarosegel (2%).
    5. Reinig de PCR-sjabloon met behulp van een PCR-zuiveringskit, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    6. Voer een in vitro transcriptiereactie uit met een T7-transcriptiekit. Meng 2 μL 10x reactiebuffer, 2 μL elk nucleotiden (ATP, CTP, UTP en GTP), 2 μL T7 RNA-polymerase, 3 μL van het sjabloon-DNA (100 ng/μL) en 5 μL ultrapuur water. Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur (niet meer dan 16 uur) tot een nacht (12 uur).
      OPMERKING: Bij deze reactie bindt het T7 RNA-polymerase zich aan de T7-promotor die is opgenomen in de voorwaartse sequentie van de primer, wat leidt tot de transcriptie van het gRNA.
    7. Behandel de transcriptiereactie met DNase door 1 μL DNase toe te voegen (goed mengen) en gedurende 15 minuten bij 37 °C te incuberen.
    8. Zuiver de gesynthetiseerde sgRNA's met een transcriptieopschoningskit door de aanbevelingen van de fabrikant op te volgen.
    9. Voer een in vitro splitsingstest uit om de knipefficiëntie van de geselecteerde gRNA's te beoordelen (Figuur 1C).
      1. Ontwerp primers om een DNA-fragment (500-1.000 bp) te amplificeren dat de gRNA-snijplaats flankeert.
      2. Stel de PCR-reacties als volgt in: 12,5 μl van het 2x mastermengsel, 1,25 μl van de 10 μM-oplossing van voorwaartse primer, 1,25 μl van de 10 μM-oplossing van omgekeerde primer, 9 μl ultrapuur water en 1 μl 5 ng/μl sjabloon-DNA.
      3. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: voorwaarden: eerste denaturatie gedurende 30 s bij 98 °C; 35 amplificatiecycli gedurende 10 s bij 98 °C, 15-30 s bij X °C (ideale gloeitemperatuur voor primers) en 35 s bij 72 °C; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 2 min; en de uiteindelijke langdurige opslag bij 4 °C.
      4. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor de beste versterkingstemperaturen en tijdspanne. Bundel ten minste vijf reacties of schaal de volumes van de reagentia op zodat voldoende PCR-product (1,5-2 μg) wordt verkregen na PCR-opruiming (enkele band) of agarosegel PCR-bandzuivering.
      5. Zet Cas9-splitsingsreacties op met recombinant Cas9 door het volgende mengsel gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen: 1 μl 10x Cas9-reactiebuffer, 0,35 μl recombinant Cas9 (1 μg/μl), 1 μl gRNA (100 ng/μl), 6,65 μl ultrapuur water en 1 μl 300 ng/μl sjabloon-DNA.
      6. Zet een negatieve controlereactie op zonder gRNA.
      7. Controleer de efficiëntie van de splitsing door reacties uit te voeren op een agarosegel (1,5-2,0%; Figuur 1C).

3. Montage van het donorplasmide

  1. PCR-amplificeren van de homologie-armen uit het genomische DNA van A. aegypti.
    1. Raadpleeg voor het ontwerp van de primer de richtlijnen van de fabrikant van de kloonset. Gebruik een online tool (bijv. Benchling), die ondersteuning biedt voor het ontwerp en de assemblage van plasmide met behulp van verschillende kloonstrategieën (bijv. Gibson, Golden Gate en klonen op basis van restrictie-enzymen).
    2. Versterk de ladingsequentie van A. aegypti genomisch DNA of bestel een commercieel gesynthetiseerd genfragment.
    3. Versterk fluorescerende markers van plasmiden in eigen huis.
  2. Ligate DNA-fragmenten van de stappen 3.1.1 tot 3.1.3 in de ruggengraat van een bestaand plasmide door Gibson-assemblage. Incubeer een mengsel van 10 μl 2x mastermix, X μl van alle DNA-fragmenten, 10-X μl ultrapuur water bij 50 °C gedurende 1 uur.
    NOTITIE: Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor het berekenen van de ideale verhouding tussen inserts en plasmide-backbone.
    1. Bereken de concentraties van elk kloonfragment in pico mols: pmols = (gewicht in ng) × 1.000/(basenparen × 650 dalton).
    2. Gebruik 50-100 ng plasmide-ruggengraat en 2-3-voudige molaire overmaat van elk inzetstuk.
    3. Als u 2-3 fragmenten samenvoegt, voegt u 0,02-0,5 pmol van elk fragment toe aan de Gibson-reactie. Als u 4-6 fragmenten samenvoegt, voegt u 0,2-1,0 pmol van elk fragment toe.
  3. Gebruik 3-5 μL van de Gibson-assemblagereactie om E. coli-competente cellen JM109 te transformeren.
    OPMERKING: JM109 werd gekozen voor Gibson-assemblage vanwege het recA-genotype , dat ongewenste recombinatiegebeurtenissen vermindert en nucleaseoverdracht tijdens celoogst voorkomt, waardoor de integriteit van de geassembleerde DNA-fragmenten wordt gewaarborgd
    Voor plasmiden groter dan 10 kb raden we transformatie van DH5α-competente cellen aan met behulp van het uitgebreide protocol, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  4. Breid de getransformeerde bacteriën uit en zuiver het plasmide met behulp van een miniprep-kit.
  5. Om de correcte assemblage van het plasmide te bevestigen, voert u een diagnostische restrictie-enzymdigest uit met het gezuiverde plasmide-DNA en visualiseert u dit door middel van agarosegelelektroforese (Figuur 1D,E).
    OPMERKING: We raden het gebruik van een online tool aan voor de selectie van een paar restrictie-enzymen die het plasmide op een enkele plaats kunnen knippen. Software zoals Benchling heeft een ingebouwde tool die virtuele vertering van plasmidesequenties uitvoert met de geselecteerde restrictie-enzymen, waarbij het verwachte DNA-bandpatroon wordt weergegeven op een virtuele elektroforesegel (Figuur 1D).
    1. Voer de vertering van het plasmidebeperkingsenzym uit. Incubeer een mengsel van 1 μl 10x restrictiedigestiebuffer, 0,5 μl restrictie-enzym 1, 0,5 μl restrictie-enzym 2, 1 μl plasmide-DNA (300 ng/ml) en 7 μl ultrapuur water bij 37 °C gedurende 2 uur.
    2. Voer de restrictie-verteringsreacties uit op een agarosegel (1,5%).
      OPMERKING: Het DNA-bandpatroon (Figuur 1E) moet lijken op het virtuele digest-bandpatroon (Figuur 1D). Plasmiden kunnen ook worden verzonden voor sequencing van het hele plasmide als er service beschikbaar is.
  6. Kweek de plasmidekloon in 150 ml LB-media.
  7. Voer plasmide maxiprep uit volgens de richtlijnen van de fabrikant.
  8. Suspendeer het plasmide in ultrapuur water.

4. Mengen van het injectieconstruct

OPMERKING: De voorgestelde uiteindelijke concentratiebereiken voor elk construct worden gegeven in tabel 1. Begin met een verhouding van 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng donorplasmide) en pas indien nodig aan om de HDR-efficiëntie te optimaliseren. Het monitoren van de resultaten zal helpen bij het identificeren van de meest effectieve combinatie.

  1. Voor het maken van knock-out mutanten,
    1. Verdun het aliquot Cas9-eiwit tot de gewenste concentratie met behulp van de Cas9-verdunningsbuffer en verdun het aliquot gRNA met ultrapuur water.
    2. Meng het Cas9-eiwit voor met elk gRNA om een ribonucleoproteïne (RNP)-complex te vormen. Combineer de voorgemengde oplossingen.
  2. Voor HDR-gemedieerde inserties van gencassettes,
    1. Verdun en meng Cas9-eiwit en gRNA's zoals voorgesteld voor het maken van knock-outmutanten.
    2. Verdun het donorplasmide met ultrapuur water.
    3. Combineer alle constructies.

5. Trekken en laden van microinjectienaalden

  1. Gebruik kwartsfilament om aan de injectienaalden te trekken (Figuur 2). Zorg ervoor dat het filament 10 cm lang is, met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 0,7 mm.
  2. Trek aan de naalden met behulp van een lasermicropipettrekker met een van de volgende twee programma's:
    Programma 1: Warmte 805, Filament 4, Snelheid 50, Vertraging 145, Pull 145
    Programma 2: Warmte 650, Filament 4, Snelheid 40, Vertraging 150, Pull 156
    OPMERKING: Programma 1 resulteert in een dunnere maar langere naaldpunt, waardoor het geschikt is voor injecties met constructies met een lagere concentratie, waarbij een fijnere punt gunstig is voor de precisie. Programma 2 levert een kortere maar dikkere naaldpunt op, ideaal voor injecties met een hogere concentratie, omdat het construct dikker is en een stevigere naald vereist.

6. Embryo oogsten

  1. Bereid een elektrische of handmatige aspirator voor om muggen te verzamelen en gebruik plastic flesjes voor het verzamelen en oogsten van embryo's.
  2. Bevochtig wit cirkelvormig filterpapier en leg het op de binnenwand of op vochtig katoen in de opvangbak.
  3. Plaats 5-10 vrouwelijke muggen die 5-10 dagen geleden met bloed zijn gevoed in de verzamelaar. Zet de collector 45 minuten in het donker.
  4. Haal het filterpapier eruit voor het oogsten van embryo's.

7. Embryo line-up

  1. Gebruik een wildtype stam (Liverpool) van A. aegypti voor embryo-injectie.
  2. Selecteer embryo's in het preblastodermstadium, met name embryo's die lichtgrijs van kleur zijn, uit het oogstpapier (Figuur 3).
  3. Breng een paar embryo's met een bevochtigde borstel over op de dubbelzijdige plakband die op een dekglaasje is geplaatst. Lijn de embryo's parallel uit terwijl hun omhulsel nog nat is en zorg ervoor dat ze naast elkaar liggen, met alle achterste uiteinden naar voren gericht.
  4. Eenmaal correct geplaatst, laat u de omgeving lichtjes drogen om de embryo's op hun plaats te houden.
  5. Voeg tijdens het uitlijnen Halocarbon oil 700 toe aan de embryo's om uitdroging te voorkomen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de embryo's niet omgeven zijn door water wanneer u de olie toevoegt, omdat de embryo's hierdoor in de olie zouden gaan drijven.

8. Micro-injectie van embryo's

OPMERKING: De injectie vindt plaats bij kamertemperatuur of bij 18 °C. De temperatuur van 18°C wordt om praktische redenen aanbevolen, omdat dit de ontwikkeling van het embryo vertraagt.

  1. Stel een microinjector in met de volgende parameters: compensatiedruk (Pc) 300 hPa, injectiedruk (Pi) 500 hPa. Pas deze voorwaarden aan wanneer dat nodig is.
  2. Laad 3 μL van het gemengde construct in een naald met behulp van een microloader.
  3. Plaats het dekglas met uitgelijnde embryo's op een microscoopglaasje (Figuur 3). Plaats het afdekglas en schuif onder de microscoop voor injectie. Zorg ervoor dat het achterste uiteinde van het embryo in de richting van de naald is geplaatst.
  4. Plaats een naald samen met een micromanipulator in een naaldhouder en plaats de naald in een hoek van 10° naar het achterste uiteinde van de uitgelijnde embryo's, waarbij u deze stil houdt (Figuur 4A). Open de naald voorzichtig onder een microscoop en raak deze lichtjes aan met de rand van een dekglaasje.
    OPMERKING: Een andere optie is om een kleine opening in de naald te maken door er met een embryo op te tikken. Een iets bredere naaldopening wordt echter aanbevolen, omdat de plakkerigheid van het Cas9-eiwit de naald kan verstoppen.
  5. Beweeg het glaasglas in de richting van de naald voor injectie (Figuur 5).

9. Nazorg voor geïnjecteerde embryo's

  1. Gebruik pluisvrije, wegwerpdoekjes om de olie rond de embryo's te verwijderen.
  2. Voeg gedeïoniseerd water toe om de embryo's te spoelen en verplaats de embryo's naar een nat filterpapier. Plaats het natte filterpapier op een natte tissue in karaat 9 oz bekers (Figuur 4B en Figuur 6A,B).
  3. Leg nat katoen op de bodem van de cup om vocht vast te houden (Figuur 6B).
  4. Bewaar de geïnjecteerde embryo's op nat filtreerpapier.

10. Embryo's uitkomen en screenen van G0-larven

  1. Breng ten minste 4 dagen na injectie het filterpapier met embryo's over naar ongeveer 3 l gedeïoniseerd water in sterilite 6-kwart pannen om uit te komen.
    OPMERKING: Eieren komen doorgaans efficiënter uit binnen 2 weken na injectie. Zorg ervoor dat de eieren in deze periode vochtig blijven. Het filterpapier mag niet te nat zijn, omdat te veel vocht kan leiden tot vroeg uitkomen van de embryo's. Hoewel langere bewaring de uitkomstpercentages kan verbeteren, mag u het uitkomen niet langer dan een maand gebruiken voor optimale resultaten. Het gebruik van zuurstofarm water kan ook helpen bij het uitkomen.
  2. Zodra de G0-larven uitkomen, voeg je visvoer gemengd met water als voer toe aan de pan.
  3. Screen de G0-larven op de fluorescerende marker in het 3e tot 4e larvale stadium (Figuur 7).
  4. Houd de larven apart op basis van hun fluorescerende status, waarbij fluorescerend-positieve en fluorescerend-negatieve larven in aparte pannen worden bewaard.

11. Geslacht sorteren poppen en uitkruisen naar wildtype

  1. Scheid de geïnjecteerde muggen op geslacht wanneer ze verpoppen, met behulp van grootte en geslachtsspecifieke structuren bij de genitale kwab voor identificatie:
    1. Mannetjes: Kleiner formaat, een prominentere en puntige genitale kwab en bredere peddels (structuren aan het uiteinde van de poppen; Figuur 8A 1,A2).
    2. Vrouwtjes: Groter formaat, een kleinere en minder uitgesproken genitale kwab en smallere peddels (Figuur 8B 1,B2).
  2. Zwembad fluorescerend-positieve of fluorescerend-negatieve muggen van elk geslacht.
  3. Kruis de gepoolde muggen met muggen van het andere geslacht van de Liverpool-stam. Gebruik een verhouding van 3:1 tot 5:1 van wildtype tot G0-mug.
  4. Kruis de muggen gedurende 4 dagen.
  5. Geef de vrouwtjes na het oversteken een bloedmaaltijd.

12. G1 vertoning

  1. Geef drie dagen na de bloedvoeding eierdopjes door een papieren handdoek in de wand van Karat 9 oz-bekers te plaatsen en ongeveer 3 oz gedeïoniseerd water toe te voegen.
  2. Oogst na 3-4 dagen de G1-embryo's en broed ze uit. Screen de G1-larven op de fluorescerende marker in de 3e tot 4e instar-stadia (Figuur 7).
  3. Verzamel de fluorescerende larven, wat een HDR-invoeging suggereert. Wanneer de fluorescerende G1-individuen het popstadium bereiken, scheid ze dan op geslacht en plaats elk geslacht in afzonderlijke kooien.
  4. Oversteek de fluorescerende G1-muggen met individuen van het andere geslacht van de Liverpool-stam.

13. Bevestiging van de G1-invoegsite

  1. Na het verstrekken van de bloedmaaltijd, stelt u G1-vrouwtjes in voor het leggen van eieren bij één vrouwtje door een klein stukje keukenpapier in individuele Drosophila-flesjes te plaatsen en 3 ml gedeïoniseerd water toe te voegen.
  2. Voor knock-outmutanten:
    1. Na het leggen van de eieren verdampt het water en droogt de papieren handdoek uit, broed je de eieren uit van vrouwtjes die duidelijk knock-outmutaties vertonen en verkrijg je de G2-generatie.
    2. Verzamel het lichaam van de G1-moeders die met succes G2-nakomelingen hebben uitgebroed en extraheer DNA.
    3. Gebruik het DNA als sjabloon voor PCR om de sequentie die de doelplaats bedekt, te amplificeren. Zorg ervoor dat de primers een DNA-fragment van ~200 bp versterken. Stel de reacties in (elk met 12,5 μl van het 2x mastermengsel, 1,25 μl van de 10 μM-oplossing van voorwaartse primer, 1,25 μl van de 10 μM-oplossing van omgekeerde primer, 9 μl ultrapuur water en 1 μl sjabloon-DNA [5 ng/μl]). Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: eerste denaturatie gedurende 30 s bij 98 °C; 35 amplificatiecycli gedurende 10 s bij 98 °C, 15-30 s bij X °C (ideale gloeitemperatuur van primers) en 10 s bij 72 °C; laatste verlenging bij 72 °C gedurende 2 min; en de uiteindelijke langdurige opslag bij 4 °C.
    4. Zuiver PCR-fragmenten en voer restrictie-enzymvertering van de PCR-fragmenten uit door een mengsel van 1 μl 10x restrictiedigestiebuffer, 0,5 μl restrictie-enzym 1, 0,5 μl restrictie-enzym 2, 1 μl PCR-fragment (200 ng/ml) en 7 μl ultrapuur water bij 37 °C gedurende 30 minuten te incuberen.
      OPMERKING: Bepaalde restrictie-enzymen kunnen in het PCR-mengsel worden gebruikt zonder voorafgaande zuivering.
    5. Visualiseer de vertering van het PCR-fragment door middel van gelelektroforese om te bevestigen of er splitsing heeft plaatsgevonden.
    6. Sequentie van het onverteerde PCR-fragment om de knock-outmutaties te identificeren.
    7. Voor HDR-gemedieerde inserties, na het leggen van eieren:
      1. Verzamel het lichaam van de G1-moeders en extraheer DNA.
      2. Gebruik DNA als sjabloon voor PCR om de sequentie die de doelplaats bedekt, te amplificeren.
      3. Voer sequentiebepaling uit van het geamplificeerde DNA-fragment om de integriteit van de ingebrachte DNA-cassette te bevestigen.
      4. Broed het ei uit en verkrijg de G2-generatie.

14. Uitbreiding van de nieuwe CRISPR-lijnen

  1. Voor knock-out mutantlijnen:
    1. Zet G2-vrouwtjes op voor het leggen van eieren, met 20 vrouwtjes per G1. Elke G1 vertegenwoordigt één lijn.
    2. Bevestig na het leggen van de eieren knock-outmutaties op dezelfde manier als voor G1.
    3. Ga verder met vijf G1-lijnen die duidelijk geïdentificeerde mutaties vertonen in zowel G1 als G2. Broed de eieren uit die zijn verzameld uit G2 van elke lijn, waardoor de G3-generatie ontstaat.
    4. Selecteer uit de vijf uitkruiste lijnen twee lijnen met duidelijk geïdentificeerde mutaties en een hoge fitheid of het gewenste fenotype.
    5. Outcross G3 vrouwtjes uit elke geselecteerde lijn met mannetjes uit de Liverpool stam.
    6. Zet 50 alleenstaande vrouwtjes op om eieren te leggen uit elke lijn. Bevestig knock-out mutaties zoals eerder gedaan voor G1.
      OPMERKING: Verhoog het aantal vrouwen in de opstelling om de diversiteit te behouden.
    7. Herhaal de procedures gedurende twee extra generaties met de twee lijnen (Figuur 4J).
  2. Voor nieuwe HDR-gemedieerde invoegregels:
    1. Controleer de aanwezigheid van fluorescerende individuen in de G2-generatie.
    2. Outcross G2-muggen, van elk G1-individu, met de Liverpool-stam. Elk G1-individu vertegenwoordigt één lijn.
    3. Ga verder met nog drie generaties outcrossing. Controleer continu de fluorescerende markering en observeer de conditie19 van elke lijn (Figuur 4x).
    4. Selecteer een lijn met de juiste invoegingen en een hoge fitheid en het gewenste fenotype.

15. Maak homozygote lijnen

  1. Voor knock-out mutantlijnen:
    1. Generatie G6:
      1. Broed de eieren uit die door G5 zijn geproduceerd en verkrijg de G6-generatie.
      2. kruis G6-volwassenen binnen hun respectievelijke lijnen (Figuur 4K en Figuur 9A).
      3. Zet 50 enkele G6-vrouwtjes op voor de legleg per lijn en broed de eieren uit zoals eerder beschreven (Figuur 9B).
      4. Verzamel de G6-vrouwtjes die met succes G7-nakomelingen hebben uitgebroed, extraheer DNA en voer PCR- en restrictie-enzymvertering uit zoals gedaan voor G1 (Figuur 9C).
        OPMERKING: Een eenvoudige en goedkope squishing buffer (SB) kan in deze stap worden gebruikt voor DNA-extractie.
        1. Gebruik een handmolen om een enkele mug te macereren in 100 μL 1x SB (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA en 25 mM NaCl). Voeg proteïnase K (200 μg/ml) toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C, gevolgd door 95 °C gedurende 2 minuten. Draai gedurende 5 minuten op 10.000 × g en verzamel het bovenstaande20.
      5. Bevestig de mutatie door de resultaten op een gel te visualiseren.
      6. Gooi de eieren weg die zijn geproduceerd door vrouwtjes zonder mutaties (Figuur 9D).
      7. Behoud larven van vrouwtjes met bevestigde mutaties om verschillende G7-lijnen vast te stellen en gooi broedsels zonder mutaties weg (Figuur 9D).
    2. Generatie G7:
      1. Kruis vrouwtjes en mannetjes binnen elke G7-afstamming (Figuur 9E).
      2. Zet 10 eenpersoons G7-vrouwtjes op voor de legleg per lijn en broed de eieren uit zoals eerder beschreven (Figuur 9F).
      3. Verzamel de G7-vrouwtjes die met succes G7-nakomelingen hebben uitgebroed, extraheer DNA en voer PCR- en restrictie-enzymvertering uit (Figuur 9G).
      4. Detecteer knock-outmutaties op beide allelen of een enkel allel door de resultaten op een gel te visualiseren.
      5. Behoud larven van G7-vrouwtjes waarvan is bevestigd dat ze knock-outs hebben in beide allelen, waardoor de G8-generatie ontstaat (Figuur 9H). Gooi broedsels zonder mutaties weg (Figuur 9H).
        LET OP: Deze stap zorgt ervoor dat de vrouwtjes homozygoot zijn. In G8 bevestigt het testen van de homozygotie van het nageslacht of de vaders ook homozygoot zijn."
    3. Generatie G8:
      1. Kruis G8-volwassenen per elke vrouwelijke afstamming van de G7 (Figuur 9I).
      2. Kies willekeurig vijf G8-mannetjes, extraheer DNA en voer PCR- en restrictie-enzymvertering uit (Figuur 9J).
      3. Zorg voor een bloedmeel en broed de eieren uit van G8-vrouwtjes die zijn gekruist met G8-mannetjes waarvan is bevestigd dat ze knock-outs hebben in beide allelen.
      4. Ga verder met de G7-lijnen waar alle gedetecteerde mannetjes knock-outs hebben in beide allelen, wat aangeeft dat deze lijnen homozygoot zijn.
  2. Voor HDR-gemedieerde invoegregels:
    1. Broed de eieren uit die door G5 zijn geproduceerd en verkrijg de G6-generatie. Zeeflarven in het G6-stadium voor fluorescerende markeringen.
    2. Gooi larven zonder fluorescerende markeringen weg (Figuur 4xi).
    3. Kruis muggen die fluorescerende markeringen vertonen.
    4. Ga door met deze procedure voor elke volgende generatie totdat er geen niet-fluorescerende larve meer wordt waargenomen. Op dit punt zal de muggenlijn homozygoot zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ontwerp en validatie van gRNA-gemedieerde gentargeting voor HDR-homologierecombinatie
Om ervoor te zorgen dat het gewenste gen nauwkeurig wordt getarget, raden we aan om een paar gRNA's te selecteren en de 5'- en 3'-homologiearmen dicht bij de snijplaats te plaatsen voor HDR-gemedieerde homologe recombinatie (Figuur 1A). We hebben bijvoorbeeld twee gRNA's ontworpen om zich te richten op beide zijden van he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CRISPR-Cas-technologie heeft het landschap van genoombewerking veranderd door doelwitspecifieke veranderingen in chromosomen te bevorderen1. Hoewel transponeerbare elementen essentieel waren voor het genereren van de eerste transgene muggen, zijn hun insertieplaatsen enigszins willekeurig en komt de expressie van het ladingconstruct (promotor + gen) mogelijk niet overeen met het expressieprofiel van het eigenlijke gen vanwege een genoompositioneel effect (d.w.z. i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

O.S.A. is een van de oprichters van Agragene, Inc. en Synvect, Inc. met een aandelenbelang. De voorwaarden van deze overeenkomst zijn beoordeeld en goedgekeurd door de University of California, San Diego in overeenstemming met haar beleid inzake belangenconflicten. De overige auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Judy Ishikawa en Ava Stevenson voor hun hulp bij het houden van muggen. Dit werk werd ondersteund door financiering van NIH-prijzen (R01AI151004, RO1AI148300, RO1AI175152) toegekend aan O.S.A. en K22AI166268 aan NHR-figuren werden gemaakt met behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Cas9 reactiebufferPNA Bio CB01
Benchling softwareBenchlingN/Awww.benchling.com
Cas9 verdunningsbufferPNA Bio CB03
Cas9-eiwitPNA Bio CP01-50
DH5α E. coli competente cellenNew England BiolabsC2987
Dubbelzijdig plakbandScotch Permanent3136
Drosophila-buisjesGenesee Scientific 32-109
Filterpapieren GE Healthcare Life Science 1450-042
Visvoer TetraB00025Z6YIgoudvissenvlokken 
FlugsGenesee Scientific AS273
FluorescentiemicroscoopLeica Microsystems  M165 FC
GenfragmentIntegrated DNA TechnologiesN/A
gRNASynthegoN/A
Halocarbon olie 700 Sigma-AldrichH8898
InjectiemicroscoopLeica Microsystems DM2000
JM109  E. coli competente cellen Zymo ResearchT3005
MicroinjectorEppendorfFemtoJet 4x 
Microloader tips voor het vullen van Femtotips EppendorfE5242956003
Micromanipulator EppendorfTransferMan 4r 
Micropipettrekkers Sutter Instrument P-2000
Microscoopdekglas Fisherbrand 12-542-B
Microscoopglasplaat Eisco12-550-A3
Muisbloed (levende muizen gebruikt voor voeding)University of CaliforniaIACUC, Animal Use Protocol #S17187Gebaten voor muggenbloedvoeding; details voldoen aan protocollen voor dierenetiek
NEB Q5 High-Fidelity DNA-polymerase New England BiolabsM0491S
PCR-zuiveringskitQiagen28004
Plasmid Miniprep Kit Zymo ResearchD4036
Kwartsfilament Sutter InstrumentsQF100-70-10
Transcriptie Clean-Up KitFisher ScientificAM1908
Ultra-zuiver water Life Technologies10977-023

Referenties

  1. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 38 (7), 824-844 (2020).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Shen, H., Li, Z. DNA double-strand break repairs and their application in plant DNA integration. Genes (Basel). 13 (2), 322(2022).
  5. Vinauger, C., et al. Modulation of host learning in Aedes aegypti mosquitoes. Curr Biol. 28 (3), 333-344.e8 (2018).
  6. Li, M., Bui, M., Yang, T., Bowman, C. S., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 expression yields highly efficient genome engineering in a major worldwide disease vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (49), E10540-E10549 (2017).
  7. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nat Commun. 9 (1), 3008(2018).
  8. Rouyar, A., et al. Transgenic line for characterizing GABA-receptor expression to study the neural basis of olfaction in the yellow-fever mosquito. Front Physiol. 15, 1381164(2024).
  9. Ang, J. X. D., et al. Considerations for homology-based DNA repair in mosquitoes: Impact of sequence heterology and donor template source. PLoS Genet. 18 (2), e1010060(2022).
  10. Zhang, J. -P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35(2017).
  11. Coutinho-Abreu, I. V., Akbari, O. S. Technological advances in mosquito olfaction neurogenetics. Trends Genet. 39 (2), 154-166 (2023).
  12. Li, M., et al. Targeting sex determination to suppress mosquito populations. eLife. 12, RP90199(2024).
  13. Zhan, Y., Alonso San Alberto, D., Rusch, C., Riffell, J. A., Montell, C. Elimination of vision-guided target attraction in Aedes aegypti using CRISPR. Current Biol. 31 (18), 4180-4187.e6 (2021).
  14. Greppi, C., et al. Mosquito heat seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 367 (6478), 681-684 (2020).
  15. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  16. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 5 p following 222 219-222 (2015).
  17. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  18. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  19. Williams, A. E., et al. Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes. J Vis Exp. , e65136(2023).
  20. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  21. Coutinho-Abreu, I. V., Zhu, K. Y., Ramalho-Ortigao, M. Transgenesis and paratransgenesis to control insect-borne diseases: current status and future challenges. Parasitol Int. 59 (1), 1-8 (2010).
  22. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  23. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  24. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  25. McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
  26. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nat Protoc. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  27. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Rep. 11 (1), 51-60 (2015).
  28. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrephasuspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31 (2), 199-205 (2001).
  29. Harrell, R. A. 2nd Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. 2024 (7), Cold Spring Harb Protoc. (2024).
  30. Sun, R., Raban, R., Akbari, O. S. Generating mutant strains with transgenic Cas9. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 671-678 (2023).
  31. Giraldo, D., et al. An expanded neurogenetic toolkit to decode olfaction in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep Methods. 4 (2), 100714(2024).
  32. Liu, G., Lin, Q., Jin, S., Gao, C. The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies. Mol Cell. 82 (2), 333-347 (2022).
  33. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  34. Laursen, W. J., et al. Humidity sensors that alert mosquitoes to nearby hosts and egg-laying sites. Neuron. 111 (6), 874-887.e8 (2023).
  35. Weng, S. -C., Antoshechkin, I., Marois, E., Akbari, O. S. Efficient sex separation by exploiting differential alternative splicing of a dominant marker in Aedes aegypti. PLoS Genet. 19 (11), e1011065(2023).
  36. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector. eLife. 9, e51701(2020).
  37. Dalla Benetta, E., et al. Engineered Antiviral Sensor Targets Infected Mosquitoes. The CRISPR journal. 6 (6), 543-556 (2023).
  38. Li, H. -H., et al. C-Type lectins link immunological and reproductive processes in Aedes aegypti. iScience. 23 (9), 101486(2020).
  39. van Oers, M. M., Vlak, J. M., Voorma, H. O., Thomas, A. A. M. Role of the 3' untranslated region of baculovirus p10 mRNA in high-level expression of foreign genes. J Gen Virol. 80 (Pt 8), 2253-2262 (1999).
  40. Salem, T. Z., et al. The influence of SV40 polyA on gene expression of baculovirus expression vector systems. PloS One. 10 (12), e0145019(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Embryonale microinjectiegene knockoutgene knockinfluorescente markerhomologiericht herstelonderdrukking van muggenpopulatiesgids-RNA
Genoombewerking in de gelekoortsmug Aedes aegypti met behulp van CRISPR-Cas9
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.