Methodenartikel

Fluorescentietesten voor de studie van Mycobacterium tuberculosis Interactie met de immuunreceptor SLAMF1

DOI:

10.3791/67745

⸱

28 februari 2025

 ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas (CIBA), Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (UNNOBA), 2Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (CIT NOBA), UNNOBA- Universidad Nacional de San Antonio de Areco (UNSAdA)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3CONICET- Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), 4Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Universidad de Buenos Aires

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie biedt een protocol voor het evalueren van de interactie van Mycobacterium tuberculosis met de SLAMF1 microbiële sensor. De tests werden uitgevoerd op van menselijke monocyten afgeleide macrofagen met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie. De beschreven instrumenten zijn relevant voor het bestuderen van interacties tussen pathogenen en immunoreceptoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De evaluatie van directe interactie tussen pathogenen en immuunreceptoren omvat meestal geavanceerde technieken of impliceert het gebruik van transgene stammen en genetisch gemanipuleerde cellen. Hier wordt een alternatieve methode beschreven om biochemische interactie tussen de microbiële macrofaagsensor SLAMF1 en Mycobacterium tuberculosis te detecteren. Er werden twee technische benaderingen ontwikkeld waarbij gebruik wordt gemaakt van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie. Er werden totale celeiwitextracten van menselijke macrofagen gegenereerd, vervolgens 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met hele cellen van M. tuberculosis (WCMtb) of M. tuberculosis-antigenen (Mtb Ags) en ten slotte verknoopt met behulp van behandeling met formaldehyde/glycine/ethyleenglycol bis (succinimidylsuccinaat). SLAMF1-interactie met WCMtb door flowcytometrie werd gedetecteerd met een PE-specifiek anti-SLAMF1-antilichaam. Het bestaan van interactie door fluorescentiemicroscopie werd uitgevoerd door Rhodamine-PE gekleurde Mtb Ags te hechten aan met poly-D-lysine gecoate objectglaasjes, die werden geïncubeerd met het totale eiwitextract van van monocyten afgeleide macrofagen. Na een verknopingsbehandeling werd SLAMF1 gevisualiseerd met behulp van primaire (anti-SLAMF1) en secundaire (Alexa Fluor 488) antilichamen. De tests boden een sterk biochemisch hulpmiddel om pathogeen-immunoreceptorinteracties te meten, waardoor de moeilijkheden werden overwonnen die gepaard gaan met transgene cellijnen en experimenten met modulatie van eiwitgenexpressie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis, de tuberculose-veroorzakende ziekteverwekker die 142 jaar geleden werd geïdentificeerd, blijft een wereldwijde uitdaging en infecteert momenteel ten minste een kwart van de wereldbevolking1. M. tuberculosis wordt overgedragen via druppeltjes in de lucht van geïnfecteerde mensen en bereikt alveolaire macrofagen in de longen, waar het lange tijd in een latente toestand kan overleven 2,3. Niet alleen wordt de lokale macrofagische respons geactiveerd, maar in de afgelopen jaren is beschreven dat perifere monocyten naar de luchtwegen kunnen worden gerekruteerd en kunnen differentiëren tot alveolaire macrofagen, waardoor een nog robuustere respons tegen M. tuberculosis wordt gegenereerd dan hun tegenhanger van foetale oorsprong 2,4.

Macrofagen zijn fundamentele spelers van aangeboren immuniteit. Bij inname van M. tuberculosis vertonen macrofagen talrijke microbicide functies, zoals de afscheiding van pro-inflammatoire cytokines, de fusie van het fagolysosoom en de activering van andere immuuncellen om M. tuberculosis 2,3 te doden. De complexe architecturale structuur van deze ziekteverwekker zorgt echter voor effectoren (bijv. eiwitten en lipiden) die in staat zijn om het metabolisme en de functies van macrofagen te reguleren en, als gevolg daarvan, het ontstekingsproces3. Deze manipulatie van macrofaagreacties, door de secretie van virulentiefactoren of de exploitatie van gastheerfactoren, leidt tot verschillende ontsnappingsstrategieën die door M. tuberculosis worden uitgeoefend.Enkele belangrijke ontwijkingsmechanismen zijn onder meer inductie van ontstekingsremmende cytokines, remming van de rijping en verzuring van fagolysosomen, oxidatieve stressveranderingen, verstoring van autofagie en tekortkomingen tijdens de verwerking en presentatie van antigeen 3,5.

Een strak gereguleerde interactie tussen macrofagen en M. tuberculosis is cruciaal voor de ontwikkeling van een goede immuunrespons. Daarom is het bestuderen van deze synapsen van cruciaal belang voor het identificeren van immunoprotectieve of immunopathogene mechanismen die worden geïnduceerd door overspraak tussen gastheer en pathogeen, en voor het identificeren van potentiële therapeutische doelen. Veel receptoren bemiddelen de herkenning en/of internalisatie van M. tuberculosis, waaronder TLR's 6,7,8, NLR's 7,8, complementreceptoren 6,8, C-type lectinereceptoren 6,8 en scavenger receptoren 6,8. Accumulatieve gegevens geven aan dat zowel oppervlaktegebonden als intracellulaire PRR's een belangrijke rol spelen tijdens infectie, waarbij opsonized en niet-opsonized M. tuberculosis worden herkend.

Zihad en Sifat et al. hebben onlangs de deelname van de PRR's aan door M. tuberculose geïnduceerde reacties door aangeboren cellen9 beoordeeld. In het bijzonder zijn de meeste leden van de TLR-familie betrokken geweest bij de interactie met M. tuberculosis-liganden 6,7. Oppervlak TLR2 herkent mycobacteriële antigenen zoals geacyleerde lipoproteïnen, 19-kDa lipoproteïne, LprA lipoproteïne, LprG lipoproteïne, 30-kDa antigeen, 38-kDa antigeen, MymA, proline-proline-glutaminezuur (PPE)-57, LAM, LM, PIM, heat shock proteïne 60, kenmerkend eiwit Rv1509 en het uitgescheiden eiwit ESAT-67. Membraan TLR4 interageert met heat shock-eiwitten, 38-kDa-antigeen, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE en HBHA. Aan de andere kant omvatten liganden voor endosomale TLR's (TLR 3, 7, 8 en 9) dsRNA, tRNA, ssRNA, fagosomaal RNA en dsDNA van M. tuberculosis. Bovendien speelt TLR2 een actieve rol bij het initiëren van immuunresponsen wanneer het werkt in combinatie met TLR1 en TLR6, TLR4 en TLR9 6,7. NOD2 en NLRP3 zijn de meest gekarakteriseerde cytoplasmatische NLR's bij tuberculose. Hoewel hun specifieke liganden nog worden bestudeerd, worden deze receptoren geactiveerd door muramyldipeptide of ESAT-6, respectievelijk 7,8. C-type lectinereceptoren zijn klassiek betrokken bij M. tuberculosis endocytose. Terwijl Dectin-2 fungeert als een directe PRR voor ManLAM van M. tuberculosis celwand, is het Dectin-1 ligand nog niet ontdekt8. Mincle en MCL herkennen beide het glycolipid trehalose-6,6′-dimycolaat (TDM), ook wel de navelstrengfactor7 genoemd. DCAR interageert met de mycobacteriële glycolipiden fosfatidyl-myo-inositolmannosiden (PIM's)7. CR3 herkent mycobacterieel LAM en PIM, DC-SIGN ligeert ManLAM, MR herkent een aantal M. tuberculosis-componenten, waaronder ManLAM, PIM, LM, 38-kDa glycoproteïne, 19-kDa-antigeen en andere gemannosyleerde eiwitten, terwijl DCIR-ligand nog steeds niet geïdentificeerd is.

Oplosbare CLR's zijn onder meer SP-A, dat ManLam, LM, 60-kDa glycoproteïne en glycoproteïne Apa herkent; SP-D interageert met LAM, LM en PILAM; en MBL, dat gespecialiseerd is in ManLAM-erkenning 6,7. Scavenger receptoren zijn ook fagocytische PRR's. SR-A en MARCO hebben TDM als hun ligand, SR-B1 herkent ESAT-6 en CD36 bindt ManLAM en LM 7,8. Bovendien kunnen Dectin-1, Mincle en MARCO ook worden gecombineerd met TLR2 of TLR4 om signalen te activeren na detectie van M. tuberculosis PAMP's 6,7. CD14 is een oppervlaktereceptor die het vermogen heeft om niet-opsoniseerde bacteriën te internaliseren en ook het heat shock-eiwit Chaperonin 60.1 herkent. In het bijzonder functioneert CD14 als een co-receptor samen met MARCO en TLR26. AIM2 is een cytosolische receptor die ssDNA kan detecteren wanneer M. tuberculose ontsnapt uit het fagosoom8. Ten slotte is AhR een ligand-geactiveerde transcriptiefactor die gepigmenteerde virulentiefactor naftochinonphthiocol van M. tuberculosis6 bindt.

Veel van de hierboven beschreven interacties zijn gepostuleerd en niet strikt aangetoond. Zelfs de liganden voor bepaalde receptoren blijven onbekend, wat de noodzaak versterkt om het gebied van M. tuberculosis-immunoherkenning beter te begrijpen. In deze context is het costimulatoire molecuul SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) onlangs beschreven als een M. tuberculosis-receptor door Barbero et al.10. Door niet alleen als signaalmolecuul te fungeren, maar ook als M. tuberculosis-sensor, speelt SLAMF1 een bijzonder intrigerende rol bij tuberculose. SLAMF1 kan de activering van immuuncellen induceren door beschermende functies te moduleren, zoals de productie van IFN-γ door T-cellen door middel van Erk/CREB-fosforylering 11,12,13, autofagie in neutrofielen14 en bacteriële klaring in macrofagen15.

Receptoren-ligandinteracties zijn in de loop der jaren bestudeerd met behulp van technieken zoals ELISA, Surface Plasmon Resonance (SPR), Isothermische Titratie Calorimetrie (ITC), Fluorescentiepolarisatie (FP), Röntgenkristallografie, Nucleaire Magnetische Resonantie (NMR) Spectroscopie, Microschaal Thermoforese (MST), Resonantie Energieoverdracht (bijv. BRET of FRET), Confocale Microscopie, Elektronenmicroscopie, Cryo-Elektronenmicroscopie (Cryo-EM) en Atoomkrachtmicroscopie (AFM)16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Sommige van deze benaderingen impliceren het gebruik van reportergenen, gelabelde recombinante eiwitten of chimere moleculen, knock-out-, knockdown- of overexpressiemodellen. Als alternatief kunnen computationele tools receptor-ligandinteracties en bindingsplaatsen voorspellen en worden ze vaak gebruikt in combinatie met biologische benaderingen om een uitgebreid begrip van de interacties te krijgen 29,30,31. Hier worden twee alternatieven beschreven om biochemische interactie te detecteren en ook een sectie over het fluorescerend labelen van bacteriën. Er wordt een protocol gepresenteerd dat de studie van receptor-pathogeen interacties in vitro mogelijk maakt, met name het evalueren van de SLAMF1-M. tuberculose-betrokkenheid door middel van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie, twee meestal beschikbare en routinematig gebruikte technieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij van menselijke monocyten afgeleide macrofagen betrokken zijn, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki (2013) en in overeenstemming met de ethische commissie van UNNOBA (COENOBA). Voorafgaand aan de monsterafname is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. De verdeling van de man/vrouw-groep was 13/6 en de mediane leeftijd was 32 jaar, met een interkwartielbereik (IQR) van 18-75 jaar. De aanwezigheid van eerdere pathologieën, comorbiditeiten of een positieve diagnose voor tuberculose werden gedefinieerd als uitsluitingscriteria. De details van de reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Van monocyten afgeleide macrofaagcultuur en stimulatie

  1. Bloedafname
    1. Verkrijg 60 ml bloed van gezonde donoren door venapunctie in een gehepariniseerde spuit.
      OPMERKING: Bloedextractie moet worden uitgevoerd door een biochemicus of aderlatingstechnicus.
    2. Gooi de naald in de afvalcontainer voor scherpe voorwerpen weg en al het materiaal dat in contact is geweest met het bloed van donoren in de container voor pathologisch afval.
  2. Isolatie van monocyten en generatie van macrofagen
    1. Breng het bloed voorzichtig over in buisjes van 50 ml en verdun het voor de helft met een zoutoplossing.
    2. Voer centrifugatie uit op een media met dichtheidsgradiënt om perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) te verkrijgen.
    3. Verzamel de PBMC's uit de witachtige halo.
    4. Voer twee wasbeurten uit met zoutoplossing op 400 x g gedurende 10 minuten en een laatste wasbeurt op 200 x g gedurende 15 minuten op 20 °C om bloedplaatjes te verwijderen.
    5. Bepaal het aantal PBMC's in een celtelkamer en voer CD14-positieve magnetische selectie uit met CD14-kralen.
      NOTITIE: Volg tijdens de magnetische selectie zorgvuldig de instructies van de fabrikant. Bovendien kan men de zuiverheid van geïsoleerde monocyten controleren met behulp van flowcytometrie.
    6. Resuspendeer de geïsoleerde cellen in RPMI 1640 en bepaal het aantal monocyten in een celtelkamer.
    7. Zaad 500 μL van 1 × 106/ ml CD14 positieve geselecteerde monocyten per putje in een celkweekplaat met 24 putjes in serumafwezigheid om therapietrouw te bevorderen.
    8. Verwijder na 2 uur niet-aanhangende cellen door ze te wassen met voorverwarmde RPMI 1640.
    9. Om macrofagen te differentiëren, kweekt u de aanhangende monocyten gedurende nog eens 16-18 uur ('s nachts) in 1 ml volledige media (RPMI 1640-medium aangevuld met L-glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine).
    10. Verander de volgende dag het kweekmedium. Verwijder het medium, was met 1 ml 1x PBS en voeg 1 ml volledige media toe.
    11. Stimuleer de macrofagen met gesonificeerde M. tuberculosis (M. tuberculosis antigens (Ags)) gedurende 24 uur. Gebruik 10 μL M . tuberculosis Ags (10 μL = 1 × 106 bacteriën) per 1 × 106 van monocyten afgeleide macrofagen.
      OPMERKING: 10 μL M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 bacteriën, gekwantificeerd door OD 600nm in spectrofotometer, rekening houdend met een OD van 1 als 1 x 108 bacteriën/ml. Gebruik BSL2 bioveiligheidskasten en een incubator bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 voor alle kweekstappen.
  3. Bevestiging van SLAMF1-expressie
    1. Verzamel de macrofagen uit een enkel putje. Plaats de kweekplaat op een koude ondergrond. Maak de cellen los met behulp van op- en neergaande bewegingen door twee keer achter elkaar 1 ml koude FACS (1x PBS + 2% FBS) toe te voegen. Gebruik een cytometriebuisje met ronde bodem voor de verzameling.
    2. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg door het te dumpen.
    3. Kleur de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker met een fluorofoorgekoppeld anti-humaan SLAMF1-antilichaam. Vortex na toevoeging van 1,25 μL van het antilichaam.
    4. Was de cellen om het teveel aan antilichamen te elimineren met behulp van FACS, suspendeer de pellet opnieuw in FACS en verkrijg het monster met behulp van een flowcytometer.
      OPMERKING: 1,25 μL anti-SLAMF1-antilichaam komt overeen met 0,0625 μg dat wordt gebruikt om 0,5 x 106 macrofagen te labelen. De titratie van het antilichaam wordt echter sterk aanbevolen, evenals het uitvoeren van de overeenkomstige isotype- of fluorescentie-minus één (FMO)-controle.

2. Bereiding van totaal celeiwitextract

  1. Bereiding van de lysisbuffer
    1. Bereid een buffer voor op de radio-immunoprecipitatietest (RIPA) met NaCl 150 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, SDS 1%, Triton X-100 1% en natriumdeoxycholaat 1%.
    2. Vul de RIPA-buffer aan met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en proteaseremmers zoals Pepstatine A en Leupeptin.
  2. Celverzameling en eiwitisolatie
    1. Gooi het volledige RPMI uit de platenputten met behulp van een P1000-pipet en oogst macrofagen door op en neer te pipetteren met koude 1x PBS.
    2. Breng de cellen over naar microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Verzamel één putje per microbuisje.
    3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg.
    4. Voeg 1 ml koude PBS toe en herhaal stap 2.2.2 en 2.2.3 om de cellen in dezelfde microcentrifugebuis te verzamelen.
    5. Resuspendeer de celpellets in 100 μL 1x PBS en voeg vier buisjes samen. Herhaal stap 2.2.3. Elke buis bevat 2 x 106 macrofagen.
    6. Voeg 100 μL gesupplementeerde RIPA buffer toe en incubeer de suspensie gedurende 1 uur op ijs, waarbij u elke 10 minuten vortex.
    7. Centrifugeren op 14.000 x g gedurende 15 min. Vang het bovenstaande op en bewaar tot gebruik bij -20 °C.

3. M. tuberculose -SLAMF1 interactie door flowcytometrie

  1. Verknoping van eiwitten en bacteriën
    1. Incubeer 1 × 106 hele geïnactiveerde M. tuberculosiscellen (WCMtb, M. tuberculosis geïnactiveerd door gammastraling) met eiwitextract van 1 x 106 macrofagen (50 μL) 's nachts bij 4 °C in een roterende microbuishouder.
      OPMERKING: 10 μL WCMtb = 1 × 106 bacteriën, gekwantificeerd door OD 600nm in spectrofotometer, rekening houdend met een OD van 1 als 1 x 108 bacteriën/ml.
    2. Voeg de volgende dag 500 μL 1% formaldehyde verdund in 1x PBS toe. Incubeer gedurende 15 minuten onder roeren (shaker) bij kamertemperatuur (RT).
    3. Voeg 25 μL 0,125 M glycine verdund in water toe. Incubeer gedurende 5 minuten onder agitatie (shaker) bij RT.
    4. Tweemaal wassen met 1 ml 1x PBS op 14.000 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande tussen de wasstappen weg.
    5. Resuspendeer de pellet en incubeer de suspensie in 500 μl 2 mM ethyleenglycol bis (succinimidylsuccinaat) (EGS) crosslinker verdund in een 1:1 mengsel van ijsazijn:water gedurende 1 uur bij RT.
      OPMERKING: De bereiding van de reagentia op het moment van gebruik wordt ten zeerste aanbevolen. Voor de bereiding van de EGS moeten ijsazijn en water in gelijke verhoudingen worden gemengd en tot 70 °C worden verwarmd. Als de oplossing niet heet is, wordt de EGS niet volledig geresuspendeerd.
  2. SLAMF1 kleuring
    1. Herhaal stap 3.1.4 met 500 μL 1x PBS in de eerste wasbeurt en 1 ml in de tweede.
    2. Kleur het eiwit-bacteriecomplex gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker met een anti-humaan SLAMF1-antilichaam (zoals in stap 1.3.3) door het antilichaam toe te voegen aan de microbuis en vortexing. Gebruik de hoeveelheid antilichaam die geschikt is voor 1 x 106 cellen (2,5 μL of 0,125 μg).
    3. Was de cellen om het teveel aan antilichamen te verwijderen met behulp van FACS, suspendeer de pellet in FACS en verkrijg het monster in een flowcytometer (zoals in stap 1.3.4).
      OPMERKING: Voer de bijbehorende isotype- of FMO-besturing uit.

4. Etikettering van M. tuberculose-antigenen

  1. Resuspendeer Rhodamine B in ethanol in een voorraadconcentratie van 5 mg/ml (1000x). Bewaren bij -20 °C tot gebruik.
  2. Voeg 1 μl Rhodamine B per 100 μl M. tuberculosis Ags toe in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
  3. Incubeer gedurende 45 minuten bij RT onder continue agitatie (vortex).
  4. Was minstens 3 keer op 14.000 x g gedurende 5 minuten op 24 °C met 1 ml 1x PBS tot het bovenstaande transparant is. De pellet (Mtb-R Ags) zal er lichtroze uitzien.
  5. Resuspendeer de Mtb-R Ags in 100 μL 1x PBS om het oorspronkelijke volume te herstellen.
    OPMERKING: Werken onder steriele omstandigheden wordt aanbevolen. Zorg ervoor dat de kleuring onmiddellijk wordt uitgevoerd voordat experimenten worden uitgevoerd.

5. M. tuberculosis -SLAMF1 interactie door fluorescentiemicroscopie

  1. Bacterie-eiwit verknoping
    1. Breng ronde dekglaasjes van 12 mm aan in kweekplaten met 24 putjes (1 dekglaasje per putje) met behulp van een chirurgisch pincet met ronde neus.
      OPMERKING: Reinig de dekglaasjes grondig met 70% ethanol. Indien gewenst kunnen ze gedurende 30 minuten worden geautoclaveerd of gesteriliseerd onder UV-licht.
    2. Incubeer het dekglaasje een nacht bij 4 °C met 400 μl 10 μg/ml Poly-D-lysine. Dek de plaat af met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.
    3. Haal de volgende dag het bord uit de koelkast en was het dekglaasje twee keer met 1 ml water.
    4. Laat het dekglaasje drogen.
    5. Verdun 20 μL (2 x 106) Mtb-R Ags in 180 μL 1x PBS. De laatste 200 μL is voldoende om een dekglaasje volledig te bedekken.
    6. Incubeer het dekglaasje met Mtb-R Ags gedurende 1 uur bij 37 °C in een celincubator.
    7. Gooi de resterende vloeistof weg en was twee keer met 1 ml 1x PBS.
      OPMERKING: In deze stap kan de juiste hechting van Mtb-R op het dekglaasje worden gecontroleerd met een fluorescentiemicroscoop met behulp van de filters die overeenkomen met het rode kanaal.
    8. Voeg 400 μL blokkeerbuffer toe (10% FBS in 1x PBS) gedurende 30 minuten bij RT in agitatie (shaker).
    9. Was tweemaal met 400 μL blokkeerbuffer.
    10. Incubeer met 100 μL eiwitextract verdund in 300 μL 1x PBS gedurende 2 uur bij RT in agitatie (shaker).
    11. Voeg 400 μL 1% formaldehyde verdund in 1x PBS toe. Incubeer gedurende 15 minuten onder agitatie (shaker) bij RT.
    12. Voeg 500 μL glycine 0,125 M verdund in water toe. Incubeer gedurende 5 minuten onder agitatie (shaker) bij RT.
    13. Tweemaal wassen met 1 ml 1x PBS.
    14. Voeg 400 μL 2 mM EGS toe gedurende 1 uur bij RT in agitatie (shaker).
    15. Herhaal stap 5.1.13
      OPMERKING: De bereiding van de reagentia op het moment van gebruik wordt ten zeerste aanbevolen.
  2. SLAMF1 kleuring
    1. Wikkel het deksel van de kweekplaat in paraffinefolie.
    2. Voeg een druppel van 60 μL eerder getitreerd anti-SLAMF1 primair antilichaam (1:75 verdunning) toe op het met paraffinefilm bedekte deksel.
    3. Verwijder het dekglaasje voorzichtig van de plaat met behulp van een gebogen chirurgisch pincet en naalden met fijne punt.
      NOTITIE: Om het verwijderen van dekglaasjes te vergemakkelijken, kan de naald in een hoek van ongeveer 45° worden gebogen.
    4. Keer het dekglaasje om over de druppel met het antilichaam. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker.
    5. Til het dekglaasje op en was twee keer met de blokkeerbuffer.
    6. Keer het dekglaasje om over een nieuwe druppel met het secundaire antilichaam (verdunning 1:200). Incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker.
    7. Herhaal stap 5.2.5.
    8. Verwijder de overtollige vloeistof en monteer het dekglaasje op een druppel montagevloeistof die op een glazen schuif is geplaatst.
    9. Observeer onder de fluorescentiemicroscoop met behulp van geschikte filters.
      OPMERKING: Werken onder steriele omstandigheden wordt aanbevolen. Verdun de antilichamen in de blokkeerbuffer. Behandel het dekglaasje voorzichtig om krassen te voorkomen die de waarneming onder de microscoop kunnen belemmeren. Een montagevloeistof die geschikt is voor fluorescentie wordt sterk aanbevolen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk wordt een protocol verstrekt dat de evaluatie van de interactie van M. tuberculosis met de immuunreceptor SLAMF1 in menselijke macrofagen mogelijk maakt (Figuur 1). Hiertoe werd perifeer bloed van gezonde donoren verkregen. Vervolgens werden PBMC's gescheiden door centrifugatie over de dichtheidsgradiëntmedia en werden de monocyten geïsoleerd door magnetische positieve selectie (≥95% zuiverheid, Figuur 2A,B<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie biedt een nuttige gids voor het bestuderen van de biochemische interactie tussen M. tuberculosis en microbiële sensoren die tot expressie komen in menselijke macrofagen, een sleutelceltype dat betrokken is bij de gastheerrespons tijdens tuberculose. De verstrekte protocollen zullen relevant zijn voor het ontcijferen van moleculen die een rol spelen bij het binnendringen van M. tuberculosis in fagocyten.

Het karakteriseren van biom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (subsidienummers SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 aan V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, subsidienummers PICT-2012-2459 en PICT A 2017-1896 aan V.P. en PICT-2021-I-INVI-00584 aan A.B.); Florencio Fiorini Stichting; en Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, subsidienummer PIO 15720150100010CO aan V.P.). Wij danken Natalia Menite en Gastón Villafañe voor de technische ondersteuning. We danken Dr. Paula Barrionuevo en Dr. Luciana Balboa voor de wetenschappelijke discussie tijdens de publicatie die aanleiding gaf tot de ontwikkeling van de assays die in dit werk worden gepresenteerd. Tot slot danken we Dr. Estermann voor zijn advies over cross-linking protocollen, Lic. Moroni voor zijn advies over het werken met Poly-Lysine en Lic. Moriconi voor zijn hulp bij schematische figuren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488 secundair antilichaamInvitrogenA21121Voor fluorescentiemicroscopie
anti-SLAMF1 FITC antilichaam eBioscience11-1509-42Voor flowcytometrie
anti-SLAMF1 PE antilichaam BioLegend306308Voor flowcytometrie
anti-SLAMF1 primair antilichaam BioLegend306302Voor fluorescentiemicroscopie
Aqua-Poly/MountPolysciences18606-20Montagemedia
CD14 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-097-052Voor monocyten isolatie
Dekglasjes 12mmHDA-Voor interactieonderzoek door microscopie
EGSThermoFisher Scientific 21565Voor crosslinking behandeling
FACSCanto IIBD Biosciences338960Flow cytometer met BD FACSDiva software
Fetaal Rundserum Natocor-Ingeactiveerd en bestraald, voor macrofagencultuur
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144003Voor PBMCs scheiding
Fiji/ImageJOpen Source software-Voor micrograafanalyse
FlowJo 7.6.2 Tree Star-Voor flowcytometrieanalyse
FormaldehydeMerckK47740803613Voor crosslinking behandeling
GlasplaatjesGlass Klass-Voor interactieonderzoek door microscopie
GlycineSigmaG8898Voor crosslinking behandeling
Imager.A2Carl Zeiss430005-9901-000Fluorescentiemicroscoop met Colibri 7 verlichtingsmodule
iMarkBIO-RAD1681130Microplaat absorptiemeter 
L-glutamineSigma Aldrich49419Voor macrofagencultuur
M. tuberculosis, stam H37Rv, gamma-bestraalde hele cellen BEI Resources, NIAID, NIHNR-14819Voor interactieonderzoek
M. tuberculosis, stam H37Rv, hele cel lysaatBEI Resources, NIAID, NIHNR-14822Voor macrofagen stimulatie en interactieonderzoek
Neofuge 13RHeal ForceNeofuge 13RHoge snelheid gekoelde centrifuge voor eiwitextractie
Penicilline/StreptomycineGibco15140122Voor macrofagencultuur
PMSFThermoFisher Scientific36978Voor eiwitisolatie
Poly-D-LysineSigma AldrichA-003-MVoor dekglasjesbehandeling
Protease Inhibitor CocktailSigma Aldrich P8340Voor eiwitisolatie
Rhodamine B Sigma Aldrich 21955Voor M. tuberculosis kleuring
RPMI 1640Gibco11875093Voor macrofagencultuur
Sorvall ST 16/16R centrifugeThermoFisher Scientific75004240Voor PBMCs en monocyten isolatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global Tuberculosis Report 2023. , World Health Organization. Available at: https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2023).
  2. Ahmad, F., et al. Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis. Front Immunol. 13, 882130(2022).
  3. Bo, H., et al. Mycobacterium tuberculosis-macrophage interaction: Molecular updates. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1187205(2023).
  4. Papp, A. C., et al. AmpliSeq transcriptome analysis of human alveolar and monocyte-derived macrophages over time in response to Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS One. 13 (5), e0198069(2018).
  5. Zhai, W., Wu, F., Zhang, Y., Fu, Y., Liu, Z. The immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis. Int J Mol Sci. 20 (2), 340(2019).
  6. Van Crevel, R., Ottenhoff, T. H. M., Van der Meer, J. W. M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 294-309 (2002).
  7. Mortaz, E., et al. Interaction of pattern recognition receptors with Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol. 35 (1), 1-10 (2015).
  8. Stamm, C. E., Collins, A. C., Shiloh, M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. Immunol Rev. 264 (1), 204-219 (2015).
  9. Zihad, S. M. N. K., et al. Role of pattern recognition receptors in sensing Mycobacterium tuberculosis. Heliyon. 9 (10), e20636(2023).
  10. Barbero, A. M., et al. SLAMF1 signaling induces Mycobacterium tuberculosis uptake leading to endolysosomal maturation in human macrophages. J Leukoc Biol. 109 (8), 257-273 (2021).
  11. Pasquinelli, V., et al. Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein interrupts IFN-γ production in human tuberculosis. J Immunol. 172 (2), 1177-1185 (2004).
  12. Pasquinelli, V., et al. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases contributes to interferon-γ production in response to Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (2), 340-350 (2012).
  13. Pasquinelli, V., et al. IFN-γ production during active tuberculosis is regulated by mechanisms that involve IL-17, SLAM, and CREB. J Infect Dis. 199 (5), 661-665 (2009).
  14. Pellegrini, J. M., et al. Neutrophil autophagy during human active tuberculosis is modulated by SLAMF1. Autophagy. 17 (2), 423-426 (2021).
  15. Song, T., Dong, C., Xiong, S. Signaling lymphocyte-activation molecule SLAMF1 augments mycobacteria BCG-induced inflammatory response and facilitates bacterial clearance. Int J Med Microbiol. 305 (6), 572-580 (2015).
  16. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor-ligand interaction. J Vis Exp. (132), e57032(2018).
  17. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterization of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 43-55 (2014).
  18. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. J Pharm Biomed Anal. 87, 296-304 (2014).
  19. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  20. García-Nafría, J., Tate, C. G. Cryo-electron microscopy: Moving beyond X-ray crystal structures for drug receptors and drug development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 60, 51-71 (2020).
  21. Asami, J., Shimizu, T. Structural and functional understanding of the toll-like receptors. Protein Sci. 30 (4), 761-772 (2021).
  22. Phạm, T. T. T., Rainey, J. K. On-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy to probe cell surface interactions. Biochem Cell Biol. 99 (6), 683-692 (2021).
  23. El Deeb, S., et al. Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters. Methods Appl Fluoresc. 10 (4), 045001(2022).
  24. El Khamlichi, C., et al. Bioluminescence resonance energy transfer as a method to study protein-protein interactions: Application to G protein-coupled receptor biology. Molecules. 24 (3), 505(2019).
  25. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods Enzymol. 545, 103-125 (2014).
  26. Park, A. M. W., Schirmer, P. S. H. Atomic force microscopy: A multifaceted tool to study membrane proteins and their interactions with ligands. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 74-89 (2014).
  27. Zalejski, J., Sun, J., Sharma, A. Unravelling the mystery inside cells by using single-molecule fluorescence imaging. J Imaging. 9 (9), 183(2023).
  28. Zheng, S., Zou, M., Shao, Y., Wu, H., Wang, X. Two-dimensional measurements of receptor-ligand interactions. Front Mol Biosci. 10, 1075587(2023).
  29. Zlotnikov, I. D., Kudryashova, E. V. Computer simulation of the receptor-ligand interactions of mannose receptor CD206 in comparison with the lectin concanavalin A model. Biochemistry (Moscow). 87 (1), 54-69 (2022).
  30. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: A case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 7604567(2018).
  31. Farina, B., et al. A novel approach for studying receptor-ligand interactions on living cells' surface by using NUS/T1ρ-NMR methodologies combined with computational techniques: The RGDechi15D-αvβ5 integrin complex. Comput Struct Biotechnol J. 19, 3303-3318 (2021).
  32. Driessen, N. N., et al. Role of phosphatidylinositol mannosides in the interaction between mycobacteria and DC-SIGN. Infect Immun. 77 (10), 4538-4547 (2009).
  33. Bansal, K., et al. Src homology 3-interacting domain of Rv1917c of Mycobacterium tuberculosis induces selective maturation of human dendritic cells by regulating PI3K-MAPK-NF-κB signaling and drives Th2 immune responses. J Biol Chem. 285 (47), 36511-36522 (2010).
  34. Xu, Y., et al. PPE57 induces activation of macrophages and drives Th1-type immune responses through TLR2. J Mol Med. 93 (6), 645-662 (2015).
  35. Olesen, R., et al. DC-SIGN (CD209), pentraxin 3 and vitamin D receptor gene variants associate with pulmonary tuberculosis risk in West Africans. Genes Immun. 8, 456-467 (2007).
  36. Berger, S. B., et al. SLAM is a microbial sensor that regulates bacterial phagosome functions in macrophages. Nat Immunol. 11 (10), 920-927 (2010).
  37. Degos, C., et al. Omp25-dependent engagement of SLAMF1 by Brucella abortus in dendritic cells limits acute inflammation and favours bacterial persistence in vivo. Cell Microbiol. 22 (4), e13156(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SLAMF1 interactieflowcytometriefluorescentiemicroscopiemacrophage prote ne extractenpathogeen immunereceptorcrosslinking behandelingmonocyt afgeleide macrofagenpathogeen receptorinteractie

Gerelateerde artikelen