Monitoring van de progressie van longknobbeltjes met behulp van microcomputertomografie en bloedafname in een muismodel

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte, eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het bestuderen van longknobbeltjes. Bloedafname in de submaxillaire ader en micro-CT-beeldvorming worden gebruikt als onderzoekstechnieken.

Abstract

Microcomputertomografie (micro-CT) is een realtime, intuïtieve, gevoelige en minimaal invasieve techniek voor het monitoren van veranderingen van longknobbeltjes (PN) tot longkanker (LC). De integratie van bloedafname in de submandibulaire ader maakt een snelle, stabiele en ongecompliceerde detectie mogelijk van beeldvorming en belangrijke doelwitveranderingen tijdens de progressie van PN naar LC. In deze studie hebben we een dosering van 100 mg/kg 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon toegediend aan A/J-muizen om een longadenocarcinoommodel te ontwikkelen. De ziekteprogressie bij de proefdieren werd vervolgens gevolgd door middel van submandibulaire aderbloedafname en micro-CT-test. Experimentele resultaten toonden de aanwezigheid van nodulaire foci in de longen van sommige dieren aan tegen de 10e^week, waarbij de ontwikkeling van longadenocarcinoombeelden duidelijk werd in de 21e week. Concluderend kan micro-CT pathologische veranderingen in de longen van muizen effectief waarnemen en, in combinatie met bloedafname van de submandibulaire ader, veranderingen in bloed, eiwitten en doelen dynamisch volgen. Deze methode biedt een zeer specifieke, eenvoudige en gevoelige benadering voor het screenen van geneesmiddelen, farmacokinetische tests, toxicologische experimenten en veiligheidsstudies.

Introduction

Longkanker (LC) is een ernstig neoplasma dat zijn oorsprong vindt in het bronchiale slijmvlies of de longklieren. Volgens de statistieken van 2021 veroorzaakt LC elk jaar wereldwijd ongeveer twee miljoen dodelijke slachtoffers, waarbij de incidentie en sterftecijfers stijgen¹. Vroege diagnose en interventie bij LC dragen bij aan hogere genezingspercentages, verminderde mortaliteit en lagere behandelingskosten. Longknobbeltjes (PN) zijn specifieke voorlopers van LC, gekenmerkt door gelokaliseerde, ronde en dichtere vaste of subvaste schaduwen met een diameter van ≤30 mm bij radiologische onderzoeken, zonder bewijs van longcollaps, vergroting van de mediastinale lymfeklieren of pleurale effusie². Het National Comprehensive Cancer Network (NCCN) heeft in 2022 PN gecategoriseerd op aantal, diameter en dichtheid, en combinaties geïdentificeerd zoals een geïsoleerde geslepen glazen knobbel van 5 mm in de rechterlong³. De NCCN-richtlijnen geven echter aan dat het risico op maligniteit bij PN toeneemt met de diameter en hoeveelheid van de knobbeltjes. De wijdverbreide toepassing van laaggedoseerde computertomografie heeft het aantal PN-diagnoses drastisch verhoogd, met miljoenen nieuwe gevallen die elk jaar worden geïdentificeerd⁴.

De combinatie van A/J-muizen met 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) is het meest gebruikte diermodel voor longkanker (LC)^5,6. Het gebruik van micro-CT naast bloedafname in de submandibulaire ader is een effectieve benadering voor het in realtime monitoren van veranderingen van longknobbeltjes (PN) naar LC. Inductie van chemisch carcinogeen, met name bij NNK- en A/J-muizen, is de meest voorkomende methode voor het modelleren van longkanker en heeft bewezen een effectieve benadering te zijn voor het vaststellen van carcinoom in situ ^7,8. Deze modelleringsmethode simuleert nauwkeuriger de progressie van PN naar LC in vergelijking met de okselinoculatiemethode.

Eerdere studies hebben zich gericht op statistische analyse van de morfologie van knobbeltjes en pathologische kleuring van weefselmonsters na euthanasie⁹. Deze methoden missen echter de capaciteit om de dynamische progressie van PN naar LC¹⁰ in realtime te volgen. Micro-CT, als niet-invasieve beeldvormingstechniek, biedt nauwkeurige longitudinale gegevens met een hoge resolutie, snelle beeldvorming, een lage stralingsdosis en veiligheid, waardoor het geschikt is voor het detecteren van longbeelden in realtime^11,12. Bloedafname in de submandibulaire ader is de nieuwste, eenvoudigste en snelste methode voor het verkrijgen van bloedmonsters van muizen¹³. Deze niet-invasieve techniek vereist minimale behandeling van dieren en zorgt voor snel herstel, in overeenstemming met de 3R-principes die tot doel hebben het aantal dieren dat in onderzoek wordt gebruikt te verminderen, ongemak te minimaliseren en ethische behandeling te bevorderen. Het verzamelde bloedvolume, ongeveer 0,2-0,5 ml, is voldoende voor het controleren van bloedparameters met matige behoeften¹⁴.

Het gelijktijdige gebruik van micro-CT en submandibulaire aderbloedafname maakt dynamische, real-time observatie van PN-naar-LC-progressie in beeldvorming mogelijk en de real-time detectie van belangrijke doelen in de bloedbaan¹⁵. Bovendien maakt deze aanpak real-time onderzoek van metabolieten en andere biochemicaliën mogelijk, wat, in combinatie met technieken zoals high-performance chromatografie, ons begrip van LC^16,17 vergroot.

In deze studie werden A/J-muizen in combinatie met NNK gebruikt om een in-situ longkankermuismodel te maken. Micro-CT-scans werden 4, 10 en 20 weken na de modelinductie uitgevoerd om longbeelden vast te leggen, terwijl tijdens het experiment bloed werd verzameld via submandibulaire aderbemonstering. Deze studie heeft tot doel een basis te leggen voor PN- en LC-onderzoek door submandibulaire aderbloedafname te combineren met micro-CT.

In de oncologie is micro-CT een zeer effectief hulpmiddel voor het detecteren van tumorgroei, en biedt het een techniek met hoge resolutie voor het meten van lokale schaduwfocusveranderingen op elk moment tijdens dergelijke onderzoeken^18,19. Het is echter essentieel om te erkennen dat micro-CT alleen geen informatie geeft over schaduwfocuskenmerken, de fysiologische status van het dier of niveaus van belangrijke biologische factoren. Daarom werd in deze studie submandibulaire aderbemonstering gebruikt als aanvullende methode.

Protocol

Alle dierproeven die in deze studie worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Experimental Animal Welfare Ethics Committee van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante wetten en ethische normen voor dieronderzoek (beoordelingsnummer: 2024035). Vrouwelijke ingeteelde A/JGpt-muizen (7-8 weken oud) werden op een temperatuur van 20-24 °C gehouden met een relatieve vochtigheid van 40%-70%. Ze kregen standaard diervoeder en gezuiverd water ad libitum gedurende een licht-donkercyclus van 12 uur. Vóór het experiment werd elk dier 7 dagen aan deze omgeving gewend. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Reagentia en bereiding van dieren

1. Chemicaliën en reagentia
   1. Los NNK op in zoutoplossing tot een mastermix van 10 mg/ml²⁰. Dien een enkele intraperitoneale injectie van 0,2 ml met een concentratie van 100 mg/kg toe aan de NNK-groep, terwijl een gelijk volume normale zoutoplossing wordt toegediend aan de blancogroep.
      OPMERKING: Volg Jang et ^al.21 om de timing voor micro-CT-scanning en bloedafname te bepalen.
2. Bloedafname
   OPMERKING: Om de gezondheid van de muizen te waarborgen, moet u de bloedafname beperken tot niet meer dan 0.2 ml per keer en een week wachten op herstel. Vanwege de overvloed aan haar in het submentale gebied, moet u ervoor zorgen dat het bloedmonster tijdens het verzamelen niet door haar wordt besmet.
   1. Verwijder het gezichtshaar van het dier de dag voor het experiment met een geschikt scheerapparaat.
   2. Pak de huid aan de achterkant van het hoofd van de muis stevig vast met de linkerhand om beweging te voorkomen en om het hoofd van de muis in een vaste positie te houden.
   3. Steek de bloedafnamenaald snel in de submaxillaire slagader vanuit het mandibulaire gebied achter de schuine oogkas. Houd de naald minimaal 3 s op zijn plaats voor een optimale doorbloeding. Verzamel 50-200 μL bloed.
   4. Verzamel het bloed in een EDTA-buisje. Gebruik een wattenstaafje om lichte druk op de huid uit te oefenen om het bloeden te stoppen. Zodra het bloeden is gestopt, laat u de muis los en observeert u deze gedurende 30 seconden.
   5. Schud de reageerbuis voorzichtig om ervoor te zorgen dat het bloed grondig wordt gemengd met het stollingsmiddel.
   6. Voor routinematig bloedonderzoek plaatst u het verzamelde bloed in het veterinaire routinetestinstrument voor bloed, drukt u op de afnameknop en laat u het instrument het bloed verzamelen. Noteer de weergegeven resultaten. Gooi het resterende bloed veilig weg.

2. In-vivobeeldvorming door micro-CT

NOTITIE: Verwijder altijd metalen voorwerpen, zoals oormerken, van het testdier voordat u de micro-CT-scan gebruikt. Metalen voorwerpen kunnen ernstige artefacten in de afbeelding veroorzaken. Micro-CT zendt een bepaalde hoeveelheid straling uit; Zorg ervoor dat andere experimentele resultaten niet worden beïnvloed.

1. Start het apparaat, start de micro-CT-software en voer de kalibratie en warming-up van de sonde uit. Gebruik het muisspecifieke gereedschapsbed om te scannen.
2. Maak een nieuwe database en geef deze een naam voor deze scan, of verbind deze met een bestaande database.
3. Wijzig de parameters in het installatievenster van de software. Stel het röntgenfilter in op Cu0.06 + Al0.5, met een spanning van 70 kV, een stroom van 80 μA, een gezichtsveld van 36 mm × 36 mm, 360° rotatiescanning en een scantijd van 4 min²².
4. Verdoof de muizen met 3% isofluraan voordat u²³ scant (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Open het micro-CT-weergavescherm en bevestig de muizen met plakband aan het gereedschapsbed. Zorg continu voor anesthesie met behulp van een neussonde die in het micro-CT-instrument op het gereedschapsbed wordt geplaatst.
5. Leid het dier voorzichtig in het apparaat en bewaak zijn positie in realtime. Gebruik de juiste knoppen om de positie van de muis aan te passen en zorg ervoor dat de borst volledig zichtbaar is in het gezichtsveld.
6. Draai het gereedschapsbed 90° om de muis te positioneren. Gebruik de knoppen om de positie van de muis aan te passen en ervoor te zorgen dat het longgebied zich centraal binnen het gezichtsveld bevindt. Zet het gereedschapsbed vervolgens terug in de oorspronkelijke positie.
7. Als u de scan wilt starten, selecteert u de knop Scannen . Laat het systeem de scan zonder onderbreking voltooien en vermijd het openen van het weergavescherm tijdens het proces. Observeer de transaxiale, coronale en sagittale plakjes van de reconstructie via de software.
8. Evalueer de beeldkwaliteit direct na de scan. Als er artefacten of wazige afbeeldingen verschijnen, herhaalt u de scanprocedure.
9. Haal de muizen uit het apparaat en controleer hun gezondheid om er zeker van te zijn dat ze in stabiele toestand verkeren voordat u ze terugplaatst in hun kooien.
10. Verwijder aan het einde van het experiment het plakband van het gereedschapsbed en maak vervolgens het bed schoon. Sla de gegevens op en schakel het instrument uit.
11. Breng de muizen voorzichtig terug naar hun kooien om stress te minimaliseren. Zorg ervoor dat de kooien schoon zijn en geschikt beddengoed hebben.
12. Controleer de muizen op tekenen van herstel van anesthesie. Observeer hun gedrag, mobiliteit en eetlust. Zorg voor voedsel en water als dat nodig is.
13. Zorg voor een warme omgeving voor de muizen om onderkoeling na anesthesie te voorkomen. Gebruik indien nodig verwarmingskussens of dekens.
14. Voer dagelijkse gezondheidscontroles uit voor de komende week. Let op tekenen van angst, ongewoon gedrag of verwondingen. Documenteer waarnemingen voor elke muis.
15. Als een muis tekenen van ziekte of angst vertoont, raadpleeg dan een dierenarts voor passende interventie en verzorging.
16. Zorg ervoor dat de muizen worden teruggebracht naar hun normale huisvestingsomstandigheden nadat ze volledig zijn hersteld en stabiel zijn.

3. Gegevensverwerking en -analyse

1. Gebruik statistiek- en grafieksoftware als een waardevol hulpmiddel voor gegevensanalyse en het maken van tabellen om resultaten te presenteren.
2. Open de software. Selecteer XY-grafieken uit de nieuw gemaakte gegevenstabel, voer de wekelijkse gegevens voor de NNK- en controlegroepen in en genereer een grafiek met de veranderingen in het gewicht van de muizen.
3. Open de software opnieuw, selecteer het nooddiagram uit de nieuw gemaakte gegevenstabel, voer de bloedroutinegegevens voor de NNK-groep en de controlegroep in en genereer een pictogram.
4. Selecteer de analyse-opties in software. Analyseer de algemene gegevens met behulp van eenrichtings-ANOVA, gevolgd door verificatie van de gegevens door de implementatie van een t-test. Markeer significante verschillen.
5. Sla de micro-CT-gegevens op in SimpleViewer-formaat of DICOM. Open de SimpleViewer-software en bekijk de beeldvormingsgegevens onder begeleiding van een professionele beeldvormende arts. Label de knobbeltjes en kwantificeer het schaduwvolume met behulp van de meegeleverde meetinstrumenten.

Results

Deze studie toonde de constructie aan van een stabiel longkankermodel met behulp van NNK in combinatie met A/J-muizen. Het experimentele ontwerp wordt geïllustreerd in figuur 1. Het doel was om het real-time proces van de overgang van longknobbeltjes (PN) naar longkanker (LC) in muizenlongen te observeren, met behulp van micro-CT en submandibulaire aderbloedafname. Dienovereenkomstig werden micro-CT-scans en bloedafname uit de muizenlongen uitgevoerd in de vierde, tiende en twintigste week.

De experimentele resultaten toonden aan dat de modelleringsbenadering van NNK in combinatie met A/J-muizen het pathologische proces van PN naar LC effectief nabootste. Ten eerste kan worden gesteld dat de test die in deze studie is gebruikt, geen significante invloed heeft gehad op het welzijn van de proefdieren. Zoals geïllustreerd in figuur 2, vertoonde het lichaamsgewicht van de proefdieren gedurende de voedingsperiode van 20 weken geen noemenswaardige verschillen ten opzichte van de controlegroep. Ten tweede bleek uit de resultaten van de routinematige bloedtesten op monsters van de proefdieren een significante toename van het aantal leukocyten en bloedplaatjes in de modelgroep, terwijl het aantal rode bloedcellen en hemoglobine onveranderd bleef (figuur 3). Dit geeft aan dat het transformatieproces van PN naar LC ook gepaard gaat met een geleidelijke toename van chronische ontstekingen. Belangrijk is dat zowel micro-CT-scanning als bloedafname in de submandibulaire ader de hematopoëtische functie van de proefdieren niet beschadigden, in overeenstemming met bevindingen uit tal van eerdere studies. Bovendien bracht nauwkeurige observatie van het gedrag, de vachtconditie, de ademhaling, het dieet en de waterinname van de proefdieren tijdens het onderzoek geen afwijkingen aan het licht.

Na de eerste toediening van NNK aan de proefdieren, voerden we micro-CT-scans van de longen uit op de eerste dag van de vierde, tiende en twintigste week²⁴. De resultaten gaven aan dat, in vergelijking met de controlegroep, de longtextuur van de modelgroep een geleidelijke verdikking vertoonde. Tegen de 10e^{week was} de vorming van minuscule nodulaire brandpunten waarneembaar en tegen de 20e^{week hadden} de knobbeltjes zich ontwikkeld tot waarneembare schaduwhaarden. In het licht van deze bevindingen kan worden gesteld dat de vorming van schaduwhaarden in de longen geassocieerd is met de chronische ontsteking veroorzaakt door NNK²⁵. Aangezien deze studie echter is opgezet om de veilige, efficiënte en onschadelijke ontwikkeling van PN tot LC te observeren zonder pathologische studies bij dieren te betrekken, moeten latere studies worden uitgevoerd in overeenstemming met specifieke experimentele protocollen²⁶. Figuur 4 illustreert de veranderingen in longbeeldvorming die werden waargenomen bij proefdieren in week 4, 10 en 20.

Figuur 1: Experimenteel ontwerp voor NNK-behandeling in A/J-muizen. Vijf vrouwelijke A/J-muizen werden op één tijdstip geïnjecteerd met de verbinding NNK, terwijl nog eens vijf werden geïnjecteerd met zoutoplossing als controle. Bloedmonsters werden verzameld in week 4, 10 en 20 met behulp van micro-CT-scans van de muizenlongen en bloedafname in de submaxillaire ader. De verkregen gegevens werden gekruist om de ziekteprogressie bij de muizen te evalueren. (A) Overzicht van de experimentele opzet. (B) Diagram van bloedafname van de submaxillaire slagader. (C) Schematische weergave van de micro-CT-beeldvormingsopstelling, waarbij de muis op het dierenbed is geplaatst (blauw) en het gele kader als zoeker, dat het longweefsel van de muis volledig moet bedekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gewichtsveranderingen bij muizen gedurende 20 weken. Gewichtstrends gaven aan dat NNK-behandeling bij A/J-muizen het lichaamsgewicht niet significant verminderde. Micro-CT-scanning en submaxillaire aderbloedextractie kunnen enige stress veroorzaken bij de muizen; Ze herstelden zich echter snel. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, (n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Aantal bloedcellen in de loop van de tijd. Het gehalte aan witte bloedcellen, bloedplaatjes, rode bloedcellen en hemoglobine werd gemeten bij muizen in week 4, 10 en 20. In vergelijking met de controlegroep vertoonde de NNK-groep een stijgende trend in het aantal witte bloedcellen en bloedplaatjes, terwijl de hemoglobine- en rode bloedcelspiegels niet significant veranderden. Deze bevindingen suggereren dat het transformatieproces van PN-LC geassocieerd is met verhoogde ontsteking en dat de submaxillaire aderbloedafnamemethode, uitgevoerd met tussenpozen van meer dan 4 weken, geen infectie of schade aan de hematopoëtische functie bij muizen veroorzaakt. (A) Witte bloedcellen. (B) Bloedplaatjes. (C) Rode bloedcellen. (D) Hemoglobine. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, (n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Micro-CT-scanbeelden van muizen in week 4, 10 en 20. Micro-CT-beeldvormingsresultaten tonen aan dat NNK-behandeling in A/J-muizen het transformatieproces van PN-LC effectief simuleert. Vergeleken met de controlegroep begon de NNK-groep in week 10 kenmerken van verdikking en veranderde textuur in longbeelden te vertonen. In week 20 waren robuuste schaduwhaarden waarneembaar in het longweefsel. (A) Afbeeldingen van week 4. (B) Afbeeldingen van week 10. (C) Afbeeldingen van week 20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het is belangrijk om een aantal belangrijke punten uit deze studie te herhalen. Ten eerste, hoewel het afnemen van bloed in de submandibulaire ader een procedure is met relatief weinig letsel, kan het nog steeds leiden tot een zekere mate van schade aan de dieren. Daarom is het noodzakelijk om meerdere procedures uit te voeren om de belasting van de muizen te verminderen en het proces tijdig af te ronden²⁷. Ten tweede zorgt het verwijderen van haar voorafgaand aan het afnemen van bloedmonsters voor de zuiverheid van het monster. Ten derde is het absoluut noodzakelijk om geschikte bloedvaten voor bloedafname te gebruiken. In de huidige studie werden bloedafnamevaten met EDTA gebruikt voor routinematige bloedonderzoeken. Als serum zou worden gebruikt, zouden vaten nodig zijn die speciaal zijn ontworpen voor het verzamelen van zuiver bloed²⁸. Ten vierde hebben alle anesthetica een bepaald niveau van dodelijkheid; Het minimaliseren van de anesthesie- en beeldvormingstijd kan dus de gezondheid van de muizen effectief beschermen. Ten vijfde, aangezien micro-CT een verscheidenheid aan weefsels en organen kan waarnemen, kan uit deze studie worden verwezen naar de specifieke parameterinstellingen in micro-CT-software die tijdens PN-beeldvorming wordt gebruikt, maar deze zijn mogelijk niet van toepassing op andere weefsels^29,30.

Eerdere studies waren meer geneigd om dieren op vaste tijdstippen te euthanaseren en het proces van transformatie van longknobbeltjes door pathologische kleuring te onderzoeken³¹. Deze aanpak resulteerde in een aanzienlijk aantal sterfgevallen onder proefdieren en belemmerde het real-time volgen van longveranderingen. In vergelijking met conventionele technieken bieden submandibulaire bloedafname en micro-CT verschillende voordelen, waaronder minimale schade, realtime monitoring, intuïtieve bediening en veelzijdigheid. In deze studie werd submandibulaire bloedafname gekozen als de voorkeursmethode voor het verkrijgen van bloedmonsters voor routinetests³². Bovendien kan het bloed worden gebruikt voor proteomische, serumfarmacologische en bloedbiochemische analyses.

Evenzo werd micro-CT in deze studie gebruikt om de dynamische groei van PN bij experimentele muizen te observeren zonder de noodzaak om ze te euthanaseren. Deze aanpak maakt een meer intuïtieve en nauwkeurige beoordeling van het remmende effect van het geneesmiddel op PN mogelijk, terwijl het aantal dieren dat nodig is voor het experiment aanzienlijk wordt verminderd, waardoor de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten wordt verbeterd. De combinatie van deze twee technologieën maakt het met name mogelijk om de processen van knobbelvorming, ontwikkeling en carcinogenese bij proefdieren uitgebreid te volgen, evenals de lokalisatie van veranderingen in belangrijke doelen (zoals TNF-α)³³. Dit vormt een uniek concept voor dit onderzoek naar PN en zelfs longkanker.

Niettemin moeten verschillende kwesties verder worden overwogen om de kwaliteit van toekomstig onderzoek te verbeteren. Gezien de lange experimentele periode die nodig is voor het diermodel van NNK in combinatie met A/J-muizen, is het absoluut noodzakelijk dat vroege medicijninjecties met de grootste precisie worden uitgevoerd³⁴. Ten tweede omvat de standaardmethode voor het produceren van longadenocarcinoom bij muizen NNK in coördinatie met vrouwelijke A/J-muizen, waarbij het onderliggende mechanisme is gekoppeld aan oestradiol. Daarom is het van essentieel belang om rekening te houden met de specifieke werkingsmechanismen van de betrokken therapeutische geneesmiddelen³⁵. Bovendien werd micro-CT niet gebruikt om de aard van de schaduwbrandpunten te bepalen, waardoor het gebruik van hematoxylinekleuring en fluorescentiekleuring noodzakelijk was, waarvoor de muizen nog steeds moeten worden geëuthanaseerd om longweefselmonsters te verkrijgen. Ten slotte heeft micro-CT, hoewel het het voordeel heeft van een lage blootstelling aan straling, toch bepaalde schade aan het menselijk lichaam, waardoor de nabijheid van niet-verwant personeel moet worden vermeden³⁶. Om deze problemen aan te pakken, kan de differentiatie en labeling van verschillende weefsels, luchtwegen en bloedvaten effectief worden bereikt door injectie van een contrastmiddel in de staartader. Bovendien kan micro-CT in combinatie met geneesmiddelen van nieuw materiaal (bijv. nanodeeltjes) worden gebruikt voor een nauwkeurigere behandeling. Ten slotte is micro-CT-technologie geleidelijk geïntegreerd met pathologie, zoals ruimtelijke en beeldvormende histologie, om veranderingen in longknobbeltjes dynamischer te volgen^36,37.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J muizen	GemPharmatech LLC.	N000018
0,5 mL EDTA-buisjes	Labshark	130201070
1-Butanon,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Dierenscheerder	Codos	BM010220
Isofluraan	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medisch tricoder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT-beeldvormingssysteem	PerkinElme	2020166501
Zoutmop (medicijn)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌