Methodenartikel

Zuivering van het sarco-endoplasmatisch reticulum ca2+-ATPase uit de spier van konijnen

DOI:

10.3791/67748

⸱

21 maart 2025

1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een verbeterde SERCA-zuiveringsmethode, waarbij het disacharide trehalose in de laatste centrifugatiestap wordt opgenomen. Dit koolhydraat stabiliseert eiwitten onder zware omstandigheden. De gezuiverde SERCA was katalytisch actief en vertoonde een hoge zuiverheid, waardoor het geschikt was voor structurele en functionele studies.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sommige P-type ATPases, zoals sarco/endoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), zijn inherent labiele membraaneiwitten die tijdens de zuivering specifieke fysisch-chemische omstandigheden vereisen om ze te verkrijgen met een hoge zuiverheid en structurele kwaliteit en in een katalytisch actieve vorm. Het disacharide trehalose is een compatibele opgeloste stof die in hoge concentraties in het gistcytoplasma wordt gesynthetiseerd en geaccumuleerd om de membranen en eiwitten te stabiliseren. Het gebruik van trehalose als additief in het protocol voor de zuivering van plasmamembraan H+-ATPase resulteert in een hoogwaardig preparaat, waarvan de hexamere structuur wordt aangetoond door biochemische analytische methoden. Trehalose kan daarom worden gebruikt als een stabiliserend additief voor de zuivering van membraaneiwitten (P-ATPases). Dit protocol beschrijft de wijziging van het klassieke protocol voor SERCA-zuivering door SERCA te onderwerpen aan centrifugatie op een trehaloseconcentratiegradiënt. De opname van dit koolhydraat leidde tot de zuivering van SERCA in een katalytisch actieve vorm met een hoge zuiverheid en, belangrijker nog, in een stabiele vorm. Gedeeltelijke biochemische karakterisering van de gezuiverde SERCA (SDS-PAGE, enzymkinetiek, FITC-labeling, circulaire dichroïsmespectroscopie) toonde aan dat het enzym geschikt is voor functionele en structurele studies. Het gebruik van trehalose in het zuiveringsprotocol van P-type ATPases en andere labiele membraan- (en cytosolische) eiwitten wordt voorgesteld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten/enzymen zijn essentiële biologische componenten van cellen omdat ze een cruciale rol spelen in verschillende processen 1,2,3. Enkele van de functies kunnen het transport van ionen en moleculen in en uit de cel/interne compartimenten (actief/passief), cel-celherkenning, intercellulaire binding, verankering/bevestiging en detectie van de externe omgeving omvatten door integratie met de signaaltransductiemachine onder normale en zware fysische en chemische omstandigheden (hoog zout, laag water, hoge temperatuur, resistentie tegen geneesmiddelen, enz.)3 Daarom is de bepaling van de driedimensionale (3D) structuur van membraaneiwitten en/of enzymen van groot belang geworden voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek 4,7,6. Belangrijk is dat membraaneiwitten/enzymen op grote schaal zijn gebruikt als doelwit voor de ontdekking van geneesmiddelen (natuurlijk of door ontwerp)7,8,9. Dat wil zeggen, membraaneiwitten hebben een inherent belang voor de gezondheid 9,10,11.

Het hydrofobe karakter van membraaneiwitten/enzymen is de technisch meest uitdagende fysisch-chemische eigenschap voor het experimenteel laboratorium 12,13,14, zeker bij het werken met oligomere en/of zeer labiele integrale membraaneiwitten 15,16. De isolatie van de juiste hoeveelheden van het membraaneiwit/enzym met de hoogst mogelijke kwaliteit voor functionele experimentele assays en structurele studies is zeer wenselijk17. Membraaneiwitten, die inherent hydrofoob zijn, zijn erg moeilijk te zuiveren, en de keuze van het wasmiddel is meestal een van de belangrijkste zaken waarmee rekening moet worden gehouden 17,18,19,20. In dit opzicht veroorzaken de laboratoriummethoden die worden gebruikt om membraaneiwitten te isoleren doorgaans een zekere mate van schade aan de 3D-structurele rangschikking van het eiwit21. Sommige van deze methoden omvatten het gebruik van (a) sonicatie (ultrasone golven met hoge frequentie/energie), (b) eiwitoplosbare wasmiddelen (hard, gemiddeld of zacht)22, (c) relatief hoge drukken in kolomchromatografie en ultracentrifugatie met hoge snelheid23, (d) precipiterende moleculen, (e) spijsverteringsenzymen en andere21. Al deze processen kunnen bijdragen aan of de belangrijkste oorzaak zijn van eiwitdestabilisatie tijdens de zuivering21. In dit opzicht lijken sommige protocollen relatief goed te werken voor een bepaald membraaneiwit. Optimalisatie is echter altijd welkom bij het gebruik van nieuwe moderne assays of methoden die een hogere kwaliteit van membraaneiwitpreparaat vereisen om bevredigende resultaten te verkrijgen24. Optimalisatiestappen kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het verbeteren van het constructieontwerp, het vinden van optimale omstandigheden voor de expressie van membraaneiwitten, het vaststellen van betere hanteringsomstandigheden (d.w.z. pH, temperatuur, enz.), het vinden van het beste compatibele wasmiddel, het aanpassen van zuiveringsstappen zoals sonicatietijd, centrifugatiesnelheid, het herformuleren van bufferoplossingen door stabilisatoren toe te voegen, enz.25,26,27. Daarom is elke verandering in de zuiveringsmethodologie die leidt tot een toename van de kwaliteit (zuiverheid) en activiteit van het gezuiverde membraaneiwit/enzym belangrijk.

In de P-type ATPase-familie lijkt het gistplasmamembraan H+-ATPase een van de meest labiele leden te zijn28,29. Het H+-ATPase verliest zijn ATP-hydrolyserende werking bij uitdroging (vriesdrogen), hitteschok, enz.28,29. Het gebruik van trehalose als eiwitstabilisator werd getest in de isolatie van het plasmamembraan H+-ATPase uit de gist K. lactis30,31; het verkregen H+-ATPase-preparaat was van hoge zuiverheid en katalytisch actief. Belangrijk is dat hierdoor de oligomere toestand van het enzym kon worden opgelost door middel van biochemische methoden, waardoor werd onthuld dat het een hexamator was en later werd bevestigd door cryo-elektronenmicroscopie 31,32,33,34,35. Daarom lijkt het waarschijnlijk dat de delicate driedimensionale (3D) rangschikking van membraaneiwitten onder relatief zware omstandigheden tijdens de zuivering verloren kan gaan36. Bifasische inactivatiekinetiek wordt waargenomen voor H+-ATPase tijdens warmtegemedieerde inactivatie29. In gistcellen, net als in veel andere organismen, hoopt het disacharide trehalose zich op in hoge concentraties onder omgevingsstressomstandigheden 37,38,39. Trehalose behoudt de integriteit van het membraan en de transportfunctie door eiwitten (zowel in het membraan ingebed als cytosolisch) en celmembranen te stabiliseren40,41. Het stabiliserende mechanisme van trehalose is uitgebreid bestudeerd door verschillende groepen en door ons laboratorium 42,43,44,45. Experimenten met de H+-ATPase en andere enzymen hebben aangetoond dat trehalose de meest effectieve eiwitstabilisator is onder mono- en disachariden28,29. Dit leidde tot opname in het H+-ATPase zuiveringsprotocol30. Onlangs is trehalose ook gebruikt bij de zuivering van het sarcoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) uit de snelle spiertrekkingen van konijnen met goede resultaten in eiwitzuiverheid en activiteit46. Daarom lijkt trehalose een goed en geschikt additief te zijn voor de zuivering van P-type ATPases en waarschijnlijk andere membraan- en cytosolische eiwitten.

Voor P-ATPases is het bestaan van structurele cytoplasmatische domeinen een experimenteel voordeel, vooral voor studies naar substraat/ligandinteractie47; ATP-binding is bestudeerd in zeer zuivere recombinante N-domeinen47,48,49, waardoor de technische overwegingen voor zuivering van hele membraanenzymen 47,48,50, onder andere 51, worden geëlimineerd. Helaas vereisen sommige functionele (katalytische/energieconversie) en structurele (subeenheidsrangschikking en interactie met andere eiwitten) studies nog steeds het hele P-ATPase 52,53. In dit opzicht is de zuivering van SERCA bereikt door verschillende onderzoeksgroepen 54,55,56,57,58. Er kunnen echter nog steeds verbeteringen worden doorgevoerd46, bijvoorbeeld het vergroten van de intactheid van het gezuiverde ATPase59, het vermijden van eiwitdenaturatie/verstoring van eiwitcomplexen25, het verhogen van de oplosbaarheid zonder denaturatie van het membraaneiwit (d.w.z. het vermijden van de vorming van macromoleculaire aggregaten)60, leiden tot een betere compatibiliteit met assays en andere downstream-analytische methoden61 Bovendien, als er nieuwe experimentele strategieën, additieven, enzymremmers, enz. in de wetenschappelijke literatuurverschijnen 61,62,63,64,65,66, moeten ze soms worden getest met het hele P-ATPase. Dit werk beschrijft het protocol voor de zuivering van SERCA en het gebruik van trehalose als additief om de eiwitstructuur en de ATPase-activiteit te stabiliseren; d.w.z., naast het verhogen van de enzym (structurele) kwaliteit, helpt trehalose het verlies van enzymstructuur en -activiteit tijdens enzymisolatie en -opslag te voorkomen, wat helpt om biologisch materiaal te besparen en zo het aantal enzymzuiveringen te verminderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met internationale en lokale (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) richtlijnen voor de omgang met dieren in experimentele laboratoria 51,67,68. Spierweefsel werd verkregen van wildtype Oryctolagus cuniculus van een lokale dierenverwerkingseenheid (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Een dierenarts met expertise in het beheer van proefdieren voerde de eerste spierdissectie en -verwerking uit. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Isolatie van sarcoplasmatisch reticulum van snelle spiertrekkingen bij konijnen (timing, 7 - 9 uur)

OPMERKING: Voor details over de procedure, zie Champeil et al.69.

  1. Verkrijg snel spierweefsel (~70 g van beide achterpoten per dier) van wildtype Oryctolagus cuniculus.
    OPMERKING: Voorafgaande visuele identificatie van de te ontleden spieren is vereist70,71.
  2. Macereer de snelle spier in een blender door deze in drie volumes van 100 mM KCl te suspenderen, met 1 minuut aan en 1 minuut in ijskoude rust, herhaal drie keer72.
  3. Verwijder de weefselresten door centrifugeren (1500 × g) bij 4 °C gedurende 5 minuten; Indien nodig wordt een tweede centrifugatie (4200 × g) uitgevoerd.
  4. Verzamel het bovenstaande en homogeniseer het met behulp van een tissueslijper (10 slagen bij lage snelheid, d.w.z. 500-1.500 tpm)72,73. Centrifugeer het homogenaat (10.000 × g) gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het homogeniseren, aangezien het gebruik van een relatief hoge snelheid kan leiden tot schade aan het systeem en de bediener.
  5. Centrifugeer het bovenstaande (met het sarcoplasmatisch reticulum) (33.000 × g) gedurende 120 minuten bij 4 °C.
  6. Suspendeer de pellets in 40 ml 0,5 M sacharose en centrifugeer (12.000 × g) bij 4 °C gedurende 15 min. Verdun het bovenstaande (0,6 M KCl en 0,15 M sacharose) en centrifugeer de suspensie (34.000 × g) bij 4 °C gedurende 165 min.
  7. Suspendeer de pellet met de vellen sarcoplasmatisch reticulumblaasjes (SRV's) in 0,3 M sucrose, 0,1 M KCl en 5 mM Tris-HCl, pH 7,0. Bepaal de eiwitconcentratie door de Lowry-test74 en humaan serumalbumine als eiwitstandaard te gebruiken.
  8. Verdeel de SRV's (30-32 mg/ml) in een volume van 1 ml. Bewaar de SRV-monsters bij -72 °C voor verdere verwerking.
    OPMERKING: De eiwitopbrengst is 100-110 mg SRV per dier.

2. SERCA-zuivering (timing, 18 - 20 uur)

OPMERKING: Voor details over de procedure, zie Rivera-Morán et al.46.

  1. Verdun de SRV-suspensie tot 2 mg eiwit/ml met ijskoud 75 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M KCl, 6 mM EDTA, 1 mM EGTA en 0,1% (m/v) deoxycholaat (DOC). Incubeer de SRV's suspensie op ijs gedurende 10 minuten en schud zachtjes. Centrifugeer de SRV-suspensie (100.000 × g) gedurende 60 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: DOC moet druppel voor druppel worden toegevoegd.
  2. Suspendeer de pellets in <3 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M KCl, 45% glycerol (v/v) en 2 mM EDTA. Homogeniseer de suspensie en stel in op een eindvolume van 10 ml. Bepaal de eiwitconcentratie en pas deze vervolgens aan op 6,5 mg/ml. Voeg azolectine toe in 5 mg/ml en 0,85 (g/m) Zwittergent 3-14.
    OPMERKING: Azolectine en Zwittergent 3-14 moeten druppelsgewijs worden toegevoegd.
  3. Homogeniseer de suspensie en centrifugeer (100.000 × g) bij 4 °C gedurende 60 min. Verzamel het bovenstaande en verdun 1:2 met 2 mM EGTA (pH 7,2).
  4. Giet de suspensie voorzichtig op een discontinue trehaloseconcentratiegradiënt (45, 40, 35 en 30% g/v) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholaat en 1 mg/ml azolectine. Centrifugeer (100.000 × g) bij 4 °C gedurende 14 uur. Vang de transparante, licht gelige korrel op die op de bodem van de buisjes is gevormd.
    OPMERKING: Zowel de vorming van de trehalosegradiënt als de toevoeging van de monstersuspensie moeten worden uitgevoerd met behulp van geschikte technieken. Centrifugeren 's nachts wordt aanbevolen.
  5. Suspendeer de pellet voorzichtig in een klein volume (<1,5 ml) van 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 m KCl, 45% glycerol en 2 mM EDTA. Bepaal de eiwitconcentratie. Pas de eiwitconcentratie door verdunning aan tot 2 mg/ml. Neem aliquots (~50 μL) van de suspensie en bewaar de gezuiverde SERCA bij -72 °C tot gebruik.
  6. Voer SDS-PAGE uit van de gezuiverde SERCA72 en van eiwitmonsters die in verschillende zuiveringsstappen zijn genomen. Bevlek de gel met Coomassie Blue72.
    OPMERKING: Het gebruik van 0,6 M trehalose in plaats van glycerol in de suspensiebuffer verhoogt de stabiliteit van het enzym tijdens opslag en vries-dooicycli28,29.

3. Test voor ATPase-activiteit (timing, 1 - 2 uur)

  1. Enzymgekoppelde test: ATPase-Piruvate kinase-lactaat dehydrogenase
    1. Bereid het reactiemengsel (1 ml): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolpyruvaat, 250 μM NADH. Neem variabele ATP-concentraties op (0,001 tot 0,25 mM).
    2. Homogeniseer de reactietest zorgvuldig door middel van vortexing. Incubeer de reactietest bij 37 ◦C gedurende 10 minuten. Voeg 0,9 U L-lactaatdehydrogenase (LDH) en 1,5 U pyruvaatkinase (PK) toe.
    3. Start de ATPase-reactie door toevoeging van 10 μg SERCA.
    4. Bepaal de vorming van NADH. Volg de verandering in absorptie-intensiteit elke seconde gedurende 600 s bij een golflengte (λ) van 340 nm in de loop van de tijd met behulp van een spectrofotometer met een gethermostatiseerde celhouder.
      OPMERKING: Het tijdsinterval voor de extinctiemeting kan variëren, maar probeer zoveel mogelijk gegevenspunten vast te leggen om de eerste rechte lijn van de ATPase-reactie te tekenen.
  2. Bepaal de snelheid van ATP-hydrolyse
    OPMERKING: Voor details over de procedure, zie Rivera-Morán et al.46.
    1. Bereken de hellingswaarde (Δabs/min) van het lineaire gedeelte in elke gevormde curve. Gebruik de molaire extinctiecoëfficiënt (ε) van NADH (λ = 6.220 M−1·cm−1) om de ATPase-activiteit te bepalen (μmol ATP gehydrolyseerd/min.mg prot.)
  3. Bepaal de kinetische parameters Km en Vmax
    1. Zet de snelheidsgegevens uit tegen de ATP-concentratie met behulp van data-analyse en grafische software.
    2. Pas de gegevens aan door niet-lineaire regressie naar de Michaelis-Menten-vergelijking (Eq. 1)46:
      figure-protocol-1
      waarbij v de snelheid is, Vmax de maximale snelheid, [S] de ATP-concentratie en Km de constante van Michaelis-Menten.
    3. Bepaal Km en Vmax door iteratie.
      OPMERKING: De opname van DOC kan de ATPase-snelheidsrespons verhogen; het testen van verschillende concentraties DOC wordt aanbevolen om het optimum te vinden.

4. Labeltest van SERCA met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (timing, 30 - 45 min, alleen voor FITC-labeling)

OPMERKING: Voor details over de procedure, zie 54,75,76.

  1. Suspendeer SERCA (20 μg) in 50 μL (eindvolume) etiketteringsbuffer (100 mM KCl, 5 mM MgCl2 en 30 mM Tris-HCl, pH 8,9) die 1 mM FITC bevat. Mengen door vortexing.
  2. Incubeer de monsters op verschillende tijdstippen (15 min, 10 min, 7 min, 5 min en 2 min) in het donker en bij kamertemperatuur.
  3. Stop de etiketteringsreactie door 1 volume ijskoude stopbuffer toe te voegen (480 mM sucrose en 48 mM MOPS, pH 7,0), bevattende ATP (5 mM). Incubeer 5 minuten op ijs in het donker.
  4. Onderwerp de FIRCA-gelabelde SERCA aan SDS-PAGE72. Stel de heldere gels bloot aan UV-licht (λ = 302 nm). Fotodocument het resultaat.
  5. Kleur de gel aan met Coomassie blauw. Fotodocument het resultaat.
    OPMERKING: Het uitvoeren van FITC-labeling in een donkere kamer kan de kwaliteit van het fluorescentiesignaal verbeteren.

5. Circulair dichroïsme (CD) spectra (timing, 30 min)

OPMERKING: Voor details over de procedure, zie11,77.

  1. Suspendeer SERCA (3 μM) in 400 μl 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) bij 25 °C.
  2. Laad het monster in een cel met een padlengte van 0,1 cm. Stel het ver-UV-spectra λ-bereik in tussen 190-260 nm. Stel de interne resolutie en de bandbreedte in op 1 nm.
  3. Neem het CD-signaal op met 50 nm/min bij 25 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SDS-PAGE van SERCA in verschillende stadia van zuivering (Figuur 1). De blauw gekleurde gel van Coomassie vertoont de verrijking van de SERCA-eiwitband (schijnbaar molecuulgewicht >100 kDa) naarmate het zuiveringsprotocol vordert. De eiwitband die overeenkomt met SERCA vertoont een zuiverheid van >90% na centrifugatie op een trehaloseconcentratiegradiënt. Grafiek van ATP-hydrolysesnelheid versus ATP-concentratie (Figuur 2A

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste moleculen en ionen kunnen de celmembranen niet vrij passeren, bijv. proton (H+) vereist een membraantransporter in het plasmamembraan van een verscheidenheid aan organismen en organellen zoals mitochondriën83,84. Celmembranen zijn selectief en de moleculen en ionen die de celmembranen doorkruisen zijn divers, dus er zijn verschillende soorten membraaneiwitten in de cel te vinden, zoals (a) ABC-transporters, (...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur verklaart dat hij geen concurrerende financiële belangen heeft.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur erkent de hulp van Edmundo Mata-Morales bij het bewerken van de video, VM, Valentín de la Cruz-Torres bij het zuiveren van de SRV's, Miguel A. Rivera-Moran bij de zuivering en analyse van SERCA, en Juan C. Gonzalez-Castro, Franco E. Juarez, Alejandra Nevarez, Nicolas Rocha-Vizuet en Jocelin I. Ramírez-Alonso bij de videoproductie. Er zijn geen fondsen, subsidies of andere ondersteuning ontvangen om dit onderzoek uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ATPSigma-Aldrich CorpA2383
Azolectin from soybeanSigma-Aldrich Corp44924
Benchtop UV transilluminator Cole-ParmerEW-97623-08Duale intensiteit De hoge instelling is ideaal voor analytische documentatie. De lage instelling vermindert photonicking of fotobleken van gelmonsters tijdens het doen van voorbereidend werk.
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich Corp223506
Coolpix B500 camera Nikon CorpS210
Coomassie brilliant blue G-250Bio-Rad1610406
Dodecyl maltosideSigma-Aldrich CorpD4641
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidSigma-Aldrich CorpE4378
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate Sigma-Aldrich CorpE6511
Fluorescein isothiocyanateSigma-Aldrich CorpF3651
KClJT Baker7447-40-7
MgCl2 • 6H2OSigma-Aldrich CorpM9272
MOPSSigma-Aldrich CorpM1254
NADHChem-Impex International Inc230
N-tetradecyl-N,N- dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonateSigma-Aldrich CorpD0431
Phosphoenolpyruvate (PEP)Chem-Impex International Inc9711
Rabbit muscle lactate dehydrogenaseRoche10003557103
Rabbit muscle pyruvate kinaseSigma-Aldrich CorpP1506
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich CorpD6750
Sodium dodecyl sulfateBio-Rad1610302
Spectropolarimeter Jasco Corp.Jasco J1500 
SucroseSigma-Aldrich Corp84100
TrehaloseSigma-Aldrich CorpT0167Dihydraat
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochlorideSigma-Aldrich Corp857645
UltracentrifugeBeckmanOptima XPN
UV/VIS spectrofotometer Agilent Technologies8453De Agilent 8453 UV-Vis spectrofotometer gebruikt een fotodiode-array voor gelijktijdige meting van het volledige ultra-violette tot zichtbare lichtspectrum
WiseStir HS- 30EDaihan Scientific Co.DH.WOS01010Ideaal voor alle disperging en homogenisatietoepassingen, ontworpen voor weefselmolen.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schuberth, C., Wedlich-Söldner, R. Building a patchwork - The yeast plasma membrane as model to study lateral domain formation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (4), 767-774 (2015).
  2. Douglas, L. M., Konopka, J. B. Fungal membrane organization: The eisosome concept. Annu Rev Microbiol. 68 (1), 377-393 (2014).
  3. Borrell, J. H., Domènech, Ò, Keough, K. M. W. Membrane protein - Lipid interactions: Physics and Chemistry in the Bilayer. , Springer International Publishing. (2016).
  4. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. The next generation in membrane protein structure determination. , Springer International Publishing. (2016).
  5. White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459 (7245), 344-346 (2009).
  6. Lacapère, J. -J. Membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. , Humana Press. 459(1002).
  7. Palmgren, M. G. Plant plasma membrane H+-ATPases: Powerhouses for nutrient uptake. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52 (1), 817-845 (2001).
  8. Yatime, L., et al. P-type ATPases as drug targets: Tools for medicine and science. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1787 (4), 207-220 (2009).
  9. Drews, J. Tetrahydrobiopterin biosynthesis as an off-target of sulfa drugs. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  10. Xu, Z., Meshcheryakov, V. A., Poce, G., Chng, S. -S. MmpL3 is the flippase for mycolic acids in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (30), 7993-7998 (2017).
  11. Siligardi, G., Hussain, R., Patching, S. G., Phillips-Jones, M. K. Ligand- and drug-binding studies of membrane proteins revealed through circular dichroism spectroscopy. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1 PARTA), 34-42 (2014).
  12. Rawlings, A. E. Membrane proteins: Always an insoluble problem. Biochem Soc Trans. 44 (3), 790-795 (2016).
  13. Popot, J. -L. Membrane proteins in aqueous solutions. , Springer International Publishing. 708(2018).
  14. Palmgren, M. G., Sommarin, M., Ulvskov, P., Larsson, C. Effect of detergents on the H+-ATPase activity of inside-out and right-side-out plant plasma membrane vesicles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1021 (2), 133-140 (1990).
  15. McBride, Z., Chen, D., Reick, C., Xie, J., Szymanski, D. B. Global analysis of membrane-associated protein oligomerization using protein correlation profiling. Mol Cell Proteomics. 16 (11), 1972-1989 (2017).
  16. Yoneda, J. S., et al. Multimeric species in equilibrium in detergent-solubilized Na, K-ATPase. Int J Biol Macromol. 89, 238-245 (2016).
  17. Ohlendieck, K. Extraction of membrane proteins. Protein Purif Protocols. 59, 283-294 (2004).
  18. Champeil, P., et al. A robust method to screen detergents for membrane protein stabilization, revisited. Anal Biochem. 511, 31-35 (2016).
  19. Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biol Proced Online. 18, 4(2016).
  20. le Maire, M., et al. Gel chromatography and analytical ultracentrifugation to determine the extent of detergent binding and aggregation, and Stokes radius of membrane proteins using sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase as an example. Nat Protoc. 3 (11), 1782-1795 (2008).
  21. Du, M., et al. Progress, applications, challenges and prospects of protein purification technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1-26 (2022).
  22. Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46 (2), 73-82 (2008).
  23. Harding, S. E. Analytical ultracentrifugation as a matrix-free probe for the study of kinase related cellular and bacterial membrane proteins and glycans. Molecules. 26, 6080(2021).
  24. Chen, Y. -C., et al. Thermal stability, storage and release of proteins with tailored fit in silica. Sci Rep. 7 (1), 46568(2017).
  25. Montigny, C. C., Arnou, B., Marchal, E., Champeil, P. Use of glycerol-containing media to study the intrinsic fluorescence properties of detergent-solubilized native or expressed SERCA1a. Biochemistry. 47 (46), 12159-12174 (2008).
  26. Simongini, M., Puglisi, A., Genovese, F., Hochkoeppler, A. Trehalose counteracts the dissociation of tetrameric rabbit lactate dehydrogenase induced by acidic pH conditions. Arch Biochem Biophys. 740, 109584(2023).
  27. Shivanna, B. D., Rowe, E. S. Preservation of the native structure and function of Ca2+-ATPase from sarcoplasmic reticulum: Solubilization and reconstitution by new short-chain phospholipid detergent 1,2-diheptanoyl-sn-phosphatidylcholine. Biochem J. 325 (2), 533-542 (1997).
  28. Sampedro, J. G., Guerra, G., Pardo, J. P., Uribe, S. Trehalose-mediated protection of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis during freeze-drying and rehydration. Cryobiology. 37 (2), 131-138 (1998).
  29. Sampedro, J. G., Cortés, P., Muñoz-Clares, R. A., Fernández, A., Uribe, S. Thermal inactivation of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Protection by Trehalose. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1544 (1-2), 64-73 (2001).
  30. Sampedro, J. G., et al. Fluorescence quenching by nucleotides of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Biochemistry. 46 (18), 5616-5622 (2007).
  31. Ruiz-Granados, Y. G., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  32. Zhao, P., Zhao, C., Chen, D., Yun, C., Li, H., Bai, L. Structure and activation mechanism of the hexameric plasma membrane H+-ATPase. Nat Commun. 12 (1), 6439(2021).
  33. Auer, M., Scarborough, G. A., Kühlbrandt, W. Surface crystallization of the plasma membrane H+-ATPase on a carbon support film for electron crystallography. J Mol Biol. 287 (5), 961-968 (1999).
  34. Hennessey, J. P., Scarborough, G. A. Secondary structure of the Neurospora CRASSA plasma membrane H+-ATPase as estimated by circular dichroism. J Biol Chem. 263 (7), 3123-3130 (1988).
  35. Scarborough, G. A. Crystallization, structure and dynamics of the proton-translocating P-type ATPase. J Exp Biol. 203 (Pt 1), 147-154 (2000).
  36. Sumida, K. H., et al. Improving protein expression, stability, and function with proteinMPNN. J Am Chem Soc. 146 (3), 2054-2061 (2024).
  37. Eleutherio, E., Panek, A., De Mesquita, J. F., Trevisol, E., Magalhães, R. Revisiting yeast trehalose metabolism. Curr Genet. 61 (3), 263-274 (2015).
  38. Attfield, P. V. Trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae during exposure to agents that induce heat shock response. FEBS Lett. 225 (1-2), 259-263 (1987).
  39. Marunde, M. R., et al. Improved tolerance to salt and water stress in Drosophila melanogaster cells conferred by late embryogenesis abundant protein. J Insect Physiol. 59 (4), 377-386 (2013).
  40. Crowe, J. H. Anhydrobiosis: An unsolved problem with applications in human welfare. Subcell Biochem. 71, 263-280 (2015).
  41. Crowe, J. H., Crowe, L. M., Chapman, D. Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms: The role of trehalose. Science. 223 (4637), 701-703 (1984).
  42. Sampedro, J. G., Rivera-Moran, M. A., Uribe-Carvajal, S. Kramers' theory and the dependence of enzyme dynamics on trehalose-mediated viscosity. Catalysts. 10 (6), 1-19 (2020).
  43. Sampedro, J. G., Uribe, S. Trehalose-enzyme interactions result in structure stabilization and activity inhibition. The role of viscosity. Mol Cell Biochem. 256 - 257 (1-2), 319-327 (2004).
  44. Crowe, J. H. Trehalose as a "chemical chaperone": Fact and fantasy. Adv Exp Med Biol. 594, 143-158 (2007).
  45. Crowe, J. H., Carpenter, J. F., Crowe, L. M., Anchordoguy, T. J. Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules. Cryobiology. 27 (3), 219-231 (1990).
  46. Rivera-Morán, M. A., Sampedro, J. G. Isolation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from rabbit fast-twitch muscle. Methods Protoc. 6 (5), 102(2023).
  47. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  48. Ramírez-Alonso, J. I., Sampedro, J. G. Effect of cations on ATP binding to the N-domain of Na+, K+-ATPase. J Fluoresc. , (2024).
  49. De la Cruz-Torres, V., Cataño, V., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS Interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. J Fluoresc. 30 (3), 483-496 (2020).
  50. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. J Fluoresc. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  51. Kiani, A. K., et al. Ethical considerations regarding animal experimentation. J Prev Med Hyg. 63 (2 Suppl 3), E255-E266 (2022).
  52. Ruiz-Granados, Y., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  53. Wang, S., et al. Structural basis for sarcolipin's regulation of muscle thermogenesis by the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Sci Adv. 7 (48), eabi7154(2021).
  54. Champeil, P., et al. ATP regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Metal-free ATP and 8-bromo-ATP bind with high affinity to the catalytic site of phosphorylated ATPase and accelerate dephosphorylation. J Biol Chem. 263 (25), 12288-12294 (1988).
  55. Møller, J. V., Olesen, C. Preparation of Ca(2+)-ATPase1a enzyme from rabbit sarcoplasmic reticulum. Methods Mol Biol. 1377, 11-17 (2016).
  56. Wuytack, F., De Schutter, G., Casteels, R. Partial purification of (Ca2+ + Mg2+)-dependent ATPase from pig smooth muscle and reconstitution of an ATP-dependent Ca2+-transport system. Biochem J. 198 (2), 265-271 (1981).
  57. Mandal, A., et al. Solubilization, purification and reconstitution of Ca2+-ATPase from bovine pulmonary artery smooth muscle microsomes by different detergents: Preservation of native structure and function of the enzyme by DHPC. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1760 (1), 20-31 (2006).
  58. Inesi, G., Ma, H., Hua, S., Toyoshima, C. Characterization of Ca2+ ATPase residues involved in substrate and cation binding. Ann NY Acad Sci. 986 (1), 63-71 (2003).
  59. Van Winkle, W. B., Pitts, B. J., Entman, M. L. Rapid purification of canine cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. J Biol Chem. 253 (24), 8671-8673 (1978).
  60. Ruiz-Granados, Y. G., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  61. Teramoto, N., Sachinvala, N. D., Shibata, M. Trehalose and trehalose-based polymers for environmentally benign, biocompatible, and bioactive materials. Molecules. 13 (8), 1773-1816 (2008).
  62. Dao, T. T., et al. Demethoxycurcumin is a potent inhibitor of P-type ATPases from diverse kingdoms of life. PLOS ONE. 11 (9), e0163260(2016).
  63. Bleeker, N. P., Cornea, R. L., Thomas, D. D., Xing, C. A novel SERCA inhibitor demonstrates synergy with classic SERCA inhibitors and targets multidrug-resistant AML. Mol Pharmaceutics. 10 (11), 4358-4366 (2013).
  64. Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem Soc Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
  65. Tadini-Buoninsegni, F., Smeazzetto, S., Gualdani, R., Moncelli, M. R. Drug interactions with the Ca2+-ATPase from Sarco(Endo)Plasmic Reticulum (SERCA). Front Mol Biosci. 5, 36(2018).
  66. Clausen, J. D., et al. Elucidation of antimicrobial activity and mechanism of action by N-substituted carbazole derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 27 (19), 4564-4570 (2017).
  67. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 Edition, Members of the Panel on Euthanasia AVMA Staff Consultants. , AVMA. Schaumburg, IL. (2020).
  68. de Aluja, A. S. Laboratory animals and official Mexican norms (NOM-062-ZOO-1999). Gac Med Mex. 138 (3), 295-298 (2002).
  69. Champeil, P., Buschlen-Boucly, S., Bastide, F., Gary-Bobo, C. Sarcoplasmic reticulum ATPase. Spin labeling detection of ligand-induced changes in the relative reactivities of certain sulfhydryl groups. J Biol Chem. 253 (4), 1179-1186 (1978).
  70. Skalec, A., Janeczek, M., Czerski, A. Anatomy and histology of the rabbit common calcanean tendon. J Vet Med Series C: Anat Histol Embryol. 48 (5), 466-475 (2019).
  71. Janes, L. E., Mioton, L. M., Fracol, M. E., Ko, J. H. An in vivo comparison: Novel mesh suture versus traditional suture-based repair in a rabbit tendon model. J Hand Surg Glob Online. 4 (1), 32-39 (2022).
  72. Bollag, D. M., Rozycki, M. D., Edelstein, S. J. Protein Methods. , Wiley. (1996).
  73. Gagné, F. Tissue preparation and subcellular fractionation techniques. Biochem Ecotoxicol. , 21-31 (2014).
  74. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  75. Autry, J. M., Rubin, J. E., Svensson, B., Li, J. L., Thomas, D. D. Nucleotide activation of the Ca-ATPase. J Biol Chem. 287 (46), 39070-39082 (2012).
  76. Winters, D. L., Autry, J. M., Svensson, B., Thomas, D. D. Interdomain fluorescence resonance energy transfer in SERCA probed by cyan-fluorescent protein fused to the actuator domain. Biochemistry. 47 (14), 4246-4256 (2008).
  77. Miles, A. J., Wallace, B. A. Circular dichroism spectroscopy of membrane proteins. Chem Soc Rev. 14 (45), 1130-1135 (2016).
  78. Scofano, H. M., Vieyra, A., de Meis, L. Substrate regulation of the sarcoplasmic reticulum ATPase. Transient kinetic studies. J Biol Chem. 254 (20), 10227-10231 (1979).
  79. Yamamoto, T., Tonomura, Y. Reaction mechanism of the Ca++-dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle: I. Kinetic studies. J Biochem. 62 (5), 558-575 (1967).
  80. Murphy, A. J. Affinity labeling of the active site of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 946 (1), 57-65 (1988).
  81. Csermely, P., Katopis, C., Wallace, B. A., Martonosi, A. The E1→E2 transition of Ca2+-transporting ATPase in sarcoplasmic reticulum occurs without major changes in secondary structure. A circular-dichroism study. Biochem J. 241 (3), 663-669 (1987).
  82. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  83. Scarborough, G. A. The plasma membrane proton-translocating ATPase. Cell Mol Life Sci. 57 (6), 871-883 (2000).
  84. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  85. Kanai, R., Vilsen, B., Cornelius, F., Toyoshima, C. Crystal structures of Na+, K+-ATPase reveal the mechanism that converts the K+-bound form to Na+-bound form and opens and closes the cytoplasmic gate. FEBS Lett. 597 (15), 1957-1976 (2023).
  86. Palmgren, M. P-type ATPases: Many more enigmas left to solve. J Biol Chem. 299 (11), 105352(2023).
  87. Frauenfelder, H. Ask not what physics can do for biology-Ask what biology can do for physics. Phys Biol. 11 (5), 053004(2014).
  88. Frauenfelder, H. The physics of proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, Springer. New York. New York, NY. (2010).
  89. Narhi, L. O. Biophysics for Therapeutic Protein Development. , Springer Science+Business Media. (2013).
  90. East, J. M. Purification of a membrane protein (Ca2+/Mg2+-ATPase) and its reconstitution into lipid vesicles. Methods Mol Biol. 27, 87-94 (1994).
  91. Lee, E. -H., et al. Enhancement of enzyme activity and stability by poly(γ-glutamic acid). Polymer J. 42 (10), 818-822 (2010).
  92. Norrild, R. K., et al. Increasing protein stability by inferring substitution effects from high-throughput experiments. Cell Rep Methods. 2 (11), 100333(2022).
  93. Song, Z., Zhang, Q., Wu, W., Pu, Z., Yu, H. Rational design of enzyme activity and enantioselectivity. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1-14 (2023).
  94. Jidenko, M., Lenoir, G., Fuentes, J. M., le Maire, M., Jaxel, C. Expression in yeast and purification of a membrane protein, SERCA1a, using a biotinylated acceptor domain. Protein Expr Purif. 48 (1), 32-42 (2006).
  95. Hua, S., Ma, H., Lewis, D., Inesi, G., Toyoshima, C. Functional role of "N" (nucleotide) and "P" (phosphorylation) domain interactions in the sarcoplasmic reticulum (SERCA) ATPase. Biochemistry. 41 (7), 2264-2272 (2002).
  96. Pang, Y. -H., Chen, J. -W. Anisodamine causes the changes of structure and function in the transmembrane domain of the Ca2+-ATPase from sarcoplasmic reticulum. Biosci Biotechnol Biochem. 68 (1), 126-131 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SERCA zuiveringsarcoplasmatisch reticulumtrehalose stabilisatieP type ATPasesmembraaneiwitzuiveringSDS PAGE analysecirculair dichro smeATPase activiteitsassayFITC labeling

Gerelateerde artikelen