Methodenartikel

Extractie en weefselopruiming Voorbereiding van hersen-ruggenmergmonsters van muizen

DOI:

10.3791/67749

⸱

11 april 2025

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, 2Key Laboratory of Anesthesiology, (Shanghai Jiaotong University), Ministry of Education, 3Department of Anesthesiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een protocol voor het extraheren en voorbereiden van geklaarde monsters van de hele hersenen en het ruggenmerg met geconserveerde fluorescerende signalen, waardoor de experimentele efficiëntie en gegevensintegriteit worden verbeterd om neurowetenschappelijk onderzoek vooruit te helpen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurowetenschappelijk onderzoek gericht op het centrale zenuwstelsel vereist een grondig begrip van verschillende factoren, waaronder celdistributie, neuronale connectiviteit en moleculaire dynamiek. Traditionele methodologieën voor het onderzoeken van de hele hersenen en het ruggenmerg omvatten vaak het isoleren, doorsnijden en scannen van weefselplakjes, gevolgd door het arbeidsintensieve proces van driedimensionale beeldreconstructie. Deze conventionele aanpak kan zowel tijdrovend als omslachtig zijn. Vooruitgang in weefselopruiming en beeldvormingstechnieken voor hele organen hebben een revolutie teweeggebracht in de analyse van de hele hersenen en het ruggenmerg. Om het potentieel van deze innovatieve methoden te maximaliseren, is het essentieel om hersenmonsters te extraheren en te wissen met behoud van hun verbinding met het ruggenmerg. Dit protocol biedt een gedetailleerde en systematische gids voor het voorbereiden van hersenmonsters die zijn verbonden met het ruggenmerg, waarin de extractie- en opruimingsprocedures worden beschreven. Door deze processen te stroomlijnen, verbetert deze aanpak de experimentele efficiëntie en gegevensintegriteit aanzienlijk, waardoor de vooruitgang in neurowetenschappelijk onderzoek wordt bevorderd en uitgebreider onderzoek naar de complexiteit van het centrale zenuwstelsel mogelijk wordt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nauwkeurig in kaart brengen en analyseren van de zenuwdistributie biedt waardevolle inzichten in de structurele en functionele organisatie van het centrale zenuwstelsel, maakt de weg vrij voor innovatieve therapeutische strategieën en verbetert ons algehele begrip van neurale mechanismen. Momenteel ontbreken uitgebreide video-tutorials om onderzoekers te begeleiden bij het voorbereiden en extraheren van hersenmonsters die zijn aangesloten op het ruggenmerg en het bereiken van succesvolle weefselopruiming.

Er zijn verschillende benaderingen voor weefselopruiming beschikbaar: hydrofobe, hydrofiele, op hydrogel gebaseerde en weefselexpansie opruimingsmethoden 1,2,3. De techniek van weefselopruiming wordt veel toegepast bij de studie van organen zoals milt4, longen5, gastrocnemius-spier6, hersenen7, ruggenmerg8 en nieren9. Ons protocol geeft gedetailleerde instructies voor het bereiden van hersenmonsters die zijn aangesloten op het ruggenmerg en die zijn gelabeld met een fluorescerende marker met behulp van STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J-stammuizen. Het biedt stapsgewijze begeleiding voor monsterextractie en beschrijft het klaringsprotocol met behulp van hydrofiele kits voor het opruimen van weefsel. Dit protocol helpt onderzoekers om het hele proces onder de knie te krijgen, van de extractie van hersen-ruggenmergmonsters tot de voorbereiding en het daaropvolgende scannen. Dit zal niet alleen de experimentele efficiëntie verbeteren, maar ook de integriteit en kwaliteit van de monsters waarborgen, waardoor nauwkeurigere en betrouwbaardere gegevens worden verkregen ter ondersteuning van neurowetenschappelijk onderzoek.

Vergeleken met conventionele methoden voor doorsnede, beeldvorming en driedimensionale reconstructie 10,11, biedt de hier gepresenteerde aanpak verschillende belangrijke voordelen, zoals (1) verbeterde structurele integriteit: door de structuur van het hele orgaan te behouden, vermindert deze methode het risico op verlies van kritieke informatie die kan optreden bij doorsnede12; (2) uitgebreide gegevensverzameling: het gebruik van een weefselopruimingskit maakt het mogelijk om cellen gedetailleerd in kaart te brengen die moeilijk te bereiken zijn met traditionele technieken; (3) Efficiëntie en nauwkeurigheid: Het protocol stroomlijnt het hele proces van monsterextractie tot beeldvorming, waardoor de tijd die nodig is voor immunohistochemie of kleuringsprocedures wordt verkort en fouten in verband met secties en montage worden geminimaliseerd13.

Het protocol overwint de beperkingen van traditionele doorsnedemethoden, die vaak resulteren in onvolledige en gefragmenteerde gegevens. Door de intacte verbinding tussen hersenen en ruggenmerg te behouden en gebruik te maken van moderne methoden voor het opruimen van weefsel, biedt dit protocol een meer holistische kijk op het centrale zenuwstelsel, wat cruciaal is voor het begrijpen van complexe neurale mechanismen en functies. Het primaire doel van deze methode is om uitgebreide beeldvorming van het centrale zenuwstelsel mogelijk te maken door monsters van de hele hersenen te bereiden die zijn verbonden met het ruggenmerg, die zijn gelabeld met fluorescerende neuronale markers. Dit protocol heeft tot doel een gedetailleerde visualisatie van neurale structuren en celdistributies te vergemakkelijken met behulp van geavanceerde anatomische methoden en technieken voor het opruimen van weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De huidige studie werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Hier werden 7-8 weken oude STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J stam mannelijke muizen (C57BL/6J x CBA oorsprong) gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel) en gehuisvest in standaardkooien (22 °C ± 2 °C, 12 uur/12 uur licht/donkercyclus, voedsel en water ad libitum).

1. Perfusie

  1. Verdoof volwassen muizen diep met 1,25% tribroomethanol (0,02 ml/kg, zie materiaaltabel) toegediend via intraperitoneale injectie met behulp van een spuit van 1 ml. Controleer de diepte van de anesthesie door de teenknijpreactie.
  2. Bevestig de ledematen van de muis aan de witte acrylplaat met behulp van stalen klemmen. Snijd de huid tussen de twee dijbenen van de muis en blijf naar boven snijden tot het middenrif is bereikt. Open beide zijden van de thorax door het middenrif om het hart bloot te leggen met een schaar en een rechte tang.
  3. Steek een infuusnaald van 0,7 mm in de linkerhartkamer. Maak een incisie van 1-2 mm in het rechter atriale aanhangsel.
  4. Perfuseer met 1x PBS met 10 E/ml natriumheparine met een snelheid van 10 ml/min met een peristaltische pomp (zie materiaaltabel) om het bloed volledig te klaren. Het volledig bleek worden van de lever duidt op een succesvolle klaring.
  5. Perfuseer met 50 ml voorgekoelde 4% PFA met een peristaltische pomp met een snelheid van 10 ml/min. Controleer op tekenen zoals het krullen van de muisstaart en spiertrekkingen.
    OPMERKING: Mislukte perfusie kan de daaropvolgende opruimingsprocessen beïnvloeden.

2. Extractie van monsters

  1. Ontleed zorgvuldig de hele hersenen en het ruggenmerg met een schaar en een tang om beschadiging van het monster te voorkomen.
  2. Scheid de huid op de rug en het hoofd van de muis met behulp van een oogheelkundige schaar. Snijd de wervelkolom door op het punt waar de lijn die de bovenste achterranden van beide ledematen verbindt, de wervelkolom kruist.
  3. Verwijder spier- en vetweefsel uit de nek en rug van de muis om de wervelkolom en schedel bloot te leggen. Knip langs de middellijn tussen de linker- en rechterkant van de wervelkolom en het ruggenmerg vanaf het onderste uiteinde van het wervelkanaal met behulp van een venusschaar.
  4. Verwijder het bovenste gedeelte en de bilaterale zijden van de afgehakte wervelkolom om het ruggenmerg bloot te leggen. Herhaal de stappen totdat je de hersenverbinding bereikt.
  5. Plaats de punt van een blad van de venusschaar tussen het foramen magnum en de hersenen. Schuif en snijd langs de mid-sagittale hechting om de schedel te openen. Gebruik een tang om de schedel te verwijderen en de hersenen bloot te leggen.
  6. Verwijder het hersen-ruggenmergweefsel van de muis van het schedeluiteinde met behulp van een tang en een venusschaar.
    OPMERKING: Sneden of schade aan het oppervlak kunnen tijdens het daaropvolgende opruimen worden verergerd, wat mogelijk onvoorspelbare schade aan het monster kan veroorzaken. Ga voorzichtig om met monsters.
  7. Gebruik een ontleedtang om het ruggenmergmembraan onder de stereomicroscoop te verwijderen.
  8. Bevestig het hersen-ruggenmergmonster aan de bevestigingsplaat (zie Materiaaltabel) met behulp van hechtingen. Voeg ten minste 20 keer het monstervolume van 4% PFA toe en plaats het op een shaker bij 4 °C voor langzaam roeren. Fixeer 's nachts gedurende 16-24 uur.
    OPMERKING: Overmatige fixatie leidt tot overmatige verknoping van eiwitten, waardoor de opruimingsefficiëntie afneemt14. Onvoldoende of vertraagde fixatie kan leiden tot afbraak van antigeen en vernietiging van de weefselmorfologie.
  9. Gooi de PFA weg en was het monster 3x met 1x PBS. Zorg ervoor dat het PBS-volume ten minste 10x het samplevolume is en dompel het sample volledig onder. Elke wasbeurt duurt 2 uur met schudden op een shaker met een snelheid van maar liefst 60 tpm om resterende PFA grondig te verwijderen.

3. Weefsel opruimen

OPMERKING: Hier wordt een weefselopruimingskit gebruikt (zie Materiaaltabel).

  1. Bereid de oplossing voor het verwijderen van lipiden door Oplossing A en Oplossing B te mengen in een massaverhouding van 9:1.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat het volume van de lipidenverwijderingsoplossing meer dan 20x het volume van het monster is.
  2. Plaats het gefixeerde weefsel in een centrifugebuis van 50 ml en voeg 50 ml van de lipidenverwijderingsoplossing toe. Plaats de centrifugebuis in een shaker bij 37 °C en schud zachtjes bij 60 tpm om de lipiden te verwijderen. Vervang de lipidenverwijderingsoplossing dagelijks gedurende 3-5 dagen. Om de voltooiing te bepalen, plaatst u de centrifugebuis op een lichtbak met een schaallijn. Als de zwarte schaallijn duidelijk zichtbaar en onvervormd is door het monster, is het proces voltooid.
  3. Breng het monster in 20 ml oplossing C op een schudapparaat bij 25 °C en schud bij minder dan 60 tpm om de brekingsindex aan te passen. Vervang Oplossing C na 24 uur. Plaats de kweekschaal met het monster volledig ondergedompeld in Oplossing C op een lichtbak met een schaallijn. Als de zwarte schaallijn duidelijk zichtbaar en onvervormd is door het monster, is het matchingproces voltooid.
    OPMERKING: Voor volwassen muizenweefsels is de brekingsindexmatching doorgaans binnen 2 dagen voltooid.

4. Inbedding van weefsel

  1. Bereid de geloplossing met 147 g oplossing C in een glazen fles van 200 ml, voeg 3,0 g agarose toe, meng goed door vortexing, zet vervolgens in de magnetron tot het kookt en schakel de magnetron onmiddellijk uit. Breng de centrifugebuis over in een broedmachine bij 37 °C totdat de agarose is opgelost.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de geloplossing indien nodig vers te bereiden.
  2. Dompel het geklaarde monster in met een 2 mm diepe laag 37 °C geloplossing in de vorm en koel af in een koelkast van 4 °C gedurende 30 minuten tot het half gestold is. Plaats het monster met brekingsindex in de vorm en voeg geloplossing toe tot het waterpas of iets onder de bovenkant van het monster ligt.
  3. Plaats de vorm 2 uur terug in de koelkast van 4 °C. Voeg geloplossing toe tot het gelijk is met het oppervlak van de vorm. Dek af met een dekglaasje. Versnel het stollen in de koelkast van 4 °C gedurende 2 uur. Bewaar het ingebedde monster een nacht in de koelkast van 4 °C. Ga zo snel mogelijk verder met beeldvorming.

5. Scannen

  1. Verwijder het dekglaasje met een pincet en haal het ingebedde monster eruit. Plaats het monster in een buis van 50 ml en voeg 30 ml beeldvormingsoplossing toe om het monster volledig onder te dompelen.
  2. Breng 502-lijm aan om het monster stevig op de monsterhouder te bevestigen. Bevestig de houder op het beeldverwerkingsapparaat.
  3. Voer de scansoftware uit zoals beschreven. Selecteer het vergrotingsniveau van 4x bij het vergrotingsgedeelte. Klik op de knop Kalibratie om de kalibratiemodus te activeren.
  4. Klik op de knop Voorbeeld om de voorbeeldmodus te openen. Klik op de bewegingsknop in Z-richting om het monster langzaam omhoog te bewegen vanaf de onderkant van de monsterkamer totdat de gegenereerde lichtplaat door het monster gaat.
  5. Selecteer het juiste laserkanaal en de optie voor de verlichtingsmodus. Selecteer de richting van het scanpad voor het voorbeeld. Klik op de knop Automatisch scannen om te beginnen met het vastleggen van het monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol isoleert met succes de hele hersenen die verbonden zijn met het ruggenmerg in mannelijke muizen van de STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J-stam. Het maakt de monsters ook transparant, zorgt ervoor dat de fluorescerende signalen volledig worden bewaard en vastgelegd, wat duidelijke en gedetailleerde beelden oplevert die de integriteit van de oorspronkelijke fluorescentie behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het voorgestelde experimentele protocol omvat het gebruik van muizen waarvan de hersenen zijn verbonden met ruggenmerg dat is gelabeld met fluorescerende neurale traceringsvirussen. Dit protocol biedt uitgebreide en gedetailleerde instructies voor het voorbereiden van monsters van de hele hersenen die verbonden blijven met het ruggenmerg. Het protocol schetst elke stap nauwgezet en zorgt ervoor dat onderzoekers het proces met precisie kunnen repliceren.

Versch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 82101249 en nr. 82471204 aan XY Sun). Postdoctorale Stichting voor Onderzoek van China (subsidie nr. 2022M722125 aan XY Sun).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 ml spuitShandong Weigao Group Medical Polymer
502 lijmDeli Group
BD insulin spuitBecton, Dickinson and Company328421
Bend getande dissectiepincetJinzhongJD1050
Ronde stalen klemWeili
Fijne schaarJinzhongy00030
Hemostatisch pincet gebogen met tandJinzhongJ31020
Hemostatisch pincet recht met tandJinzhongJ31010
Infusiespuit 0,7mmKindly Group
Lichtbak schaallijnNuohai Life ScienceNH210901
Microdissectie rechte pincetJinzhongWA3020
NobeliumSoftwareNuohai Life ScienceScansoftware
paraformaldehydeBiosharpBL539A
PeristaltiekpompenNuohai Life ScienceNH1000
Peristaltiekpompen kopNuohai Life ScienceNH-15
Fosfaat gebufferde zoutoplossingServicebioG4202
NatriumheparineShanghai PharmaH31022051
STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J stam muizenJackson Laboratory007788
Rechte getande dissectiepincetJinzhongJD1060
Weefselklaringskit(hydrofiel)Nuohai Life ScienceNH-CR-210701
Weefselkweker behandeling 100mm x 20mmNEST704001
WeefselserpentinJinzhongJ21040
Natrium pentobarbitalSigma-AldrichP3761
Venus schaarJinzhongYBC010

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  3. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chem Biol. 23 (1), 137-157 (2016).
  4. Wu, M., et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 187 (12), 2935-2951.e19 (2024).
  5. Liu, T., et al. Local sympathetic innervations modulate the lung innate immune responses. Sci Adv. 6 (20), eaay1497(2020).
  6. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv. 5 (1), eaau8355(2019).
  7. Bagnoli, S., Terzibasi Tozzini, E., Cellerino, A. Whole-Brain clearing and immunofluorescence in Nothobranchius furzeri. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 698-704 (2023).
  8. Lu, T., Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. 3D imaging of supraspinal inputs to the thoracic and lumbar spinal cord mapped by retrograde tracing and light-sheet microscopy. J Neurochem. 162 (4), 352-370 (2022).
  9. Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue. J Vis Exp. (149), e60002(2019).
  10. Song, J. H., et al. Precise mapping of single neurons by calibrated 3D reconstruction of brain slices reveals topographic projection in mouse visual cortex. Cell Rep. 31 (8), 107682(2020).
  11. Fournel, R., Veruki, M. L., Hartveit, E. Digital reconstruction and quantitative morphometric analysis of bipolar cells in live rat retinal slices. J Comp Neurol. 530 (10), 1700-1728 (2022).
  12. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  13. Peng, Y. C., et al. Rapid histological assessment of prostate specimens in the three-dimensional space by hydrophilic tissue clearing and confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 70 (8), 597-608 (2022).
  14. Singhal, P., et al. Evaluation of histomorphometric changes in tissue architecture in relation to alteration in fixation protocol - An in vitro study. J Clin Diagn Res. 10 (8), ZC28-ZC32 (2016).
  15. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  16. Lee, S. H., Son, H. J. Second wave, late-stage neuroinflammation in cleared brains of aged 5xFAD Alzheimer's mice detected by macrolaser light sheet microscopy imaging. Int J Mol Sci. 24 (23), 242317058(2023).
  17. Zhao, J., Lai, H. M., Qi, Y., He, D., Sun, H. Current status of tissue clearing and the path forward in neuroscience. ACS Chem Neurosci. 12 (1), 5-29 (2021).
  18. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
  19. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385, eadm6869(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extractie van muizenbreincentraal zenuwstelselimaging van het gehele orgaanfluorescentie imagingvisualisatie van neurale structurenfixatie met paraformaldehydeverwijdering van lipidenlight sheet microscopie

Gerelateerde artikelen