Dubbele CRISPR-interferentiestrategie voor het richten op synthetische dodelijke interacties tussen niet-coderende RNA's in kankercellen

Samenvatting

Deze studie presenteert een dubbel CRISPRi-systeem gericht op lange niet-coderende RNA's in melanoomcellen. Het maakt combinatorische genknockdown en synthetische letale screening mogelijk, waarbij kankerspecifieke lncRNA-interacties worden geïdentificeerd voor mogelijke therapeutische strategieën.

Samenvatting

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) vertegenwoordigen een enorme en functioneel diverse klasse van RNA-moleculen, waarvan er meer dan 100.000 zijn voorspeld in het menselijk genoom. Hoewel lncRNA's minder geconserveerd zijn bij verschillende soorten in vergelijking met eiwitcoderende genen, spelen ze een cruciale rol bij genregulatie, chromatine-interacties en kankerprogressie. Hun betrokkenheid bij kanker maakt ze tot veelbelovende therapeutische doelen. CRISPR-interferentie (CRISPRi), waarbij gebruik wordt gemaakt van katalytisch inactief Cas9 gefuseerd met een transcriptionele repressor zoals KRAB-MeCP2, biedt een nauwkeurige methode voor het richten op nucleaire lncRNA's en het beoordelen van hun functies. Deze studie introduceert een dubbel CRISPRi-systeem met behulp van orthogonale CRISPRi-technologieën van Staphylococcus aureus en Streptococcus pyogenes op basis van dCas9-KRAB-MeCP2, geoptimaliseerd voor combinatorische targeting van lncRNA's in menselijke melanoomcellen. Het protocol vergemakkelijkt combinatorische genknockdown of synthetische letale screening van lncRNA-paren en biedt een nieuw hulpmiddel voor kankeronderzoek. Door synthetische letaliteit tussen lncRNA's te onderzoeken, kan deze benadering helpen bij het identificeren van lncRNA-interacties die cruciaal zijn voor de overleving van kankercellen, en nieuwe therapeutische strategieën bieden. De functionaliteit van het duale systeem wordt gedemonstreerd, wat het potentieel ervan benadrukt bij het identificeren van kritieke kankerspecifieke lncRNA-interacties.

Inleiding

Hoewel minder dan 3% van het menselijk genoom codeert voor eiwitten, wordt ongeveer 80% van het genoom getranscribeerd ^1,2. Onder de niet-coderende transcriptie-eenheden worden tienduizenden geclassificeerd als lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) van meer dan 200 nucleotiden, en het totale aantal menselijke lncRNA's wordt geschat op meer dan 100,000 ^3,4. In tegenstelling tot coderende genen zijn lncRNA's minder geconserveerd bij verschillende soorten. Aangezien mensen 99% van hun genoom delen met primaten zoals chimpansees, wordt verondersteld dat lncRNA's een veel grotere invloed hebben op de fenotypische evolutie ^5,6. Deze bevindingen duiden op belangrijke cellulaire functies van lncRNA's. Hoewel de regulatie van lncRNA's en hun interacties met RNA-bindende eiwitten en andere RNA's nog onvolledig worden begrepen, en veel lncRNA's nog niet volledig zijn geannoteerd, is het duidelijk dat lncRNA's cel- en weefselspecifieke expressiepatronen vertonen bij gezondheid en ziekte, zoals kanker 7,8,9,10. Ze zijn betrokken bij diverse functies, waaronder regulatie van gentranscriptie, betrokkenheid bij chromatine-interacties¹¹, RNA-verwerking¹², RNA-stabilisatie¹³ en regulatie van translatie¹⁴.

Bij kanker beïnvloeden zeer diverse celtypespecifieke lncRNA's de ontwikkeling en metastase van tumoren door genexpressie te reguleren, wat hun potentieel als waardevolle therapeutische doelen benadrukt¹⁵. Naast de detectie van lncRNA's als biomarkers in tumormonsters¹⁶, heeft het richten op tumorspecifieke lncRNA's om hun stroomafwaartse functies te verstoren een aanzienlijk potentieel in zowel klinische toepassingen als fundamenteel onderzoek. Op RNA gebaseerde benaderingen om de rol van lncRNA's op te helderen, omvatten antisense-oligonucleotiden (ASO's), korte haarspeld-RNA's en kleine storende RNA's (siRNA's)^17,18. Hoewel siRNA vaak wordt gebruikt voor gen-uitschakelingsschermen, is de op siRNA gebaseerde knockdown beperkt tot het cytoplasma¹⁹. lncRNA werkt echter vaak in de kern.

Als alternatief kan Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-interferentie (CRISPRi) worden gebruikt om lncRNA's in menselijke kankers te remmen²⁰. Bovendien kunnen genoombrede CRISPRi-schermen eenvoudig worden geprogrammeerd en zich richten op een breed scala aan coderende en niet-coderende genen om hun functionele impact te onderzoeken^21,22. In CRISPRi wordt een katalytisch deficiënt Cas9 (dCas9) gefuseerd met een transcriptioneel repressordomein, zoals het Krüppel-associated box (KRAB) domein²³. Genonderdrukking door dCas9-KRAB wordt geleid door een gids-RNA (gRNA) naar het interessegebied. CRISPRi controleert genen op DNA-niveau, wat leidt tot hogere efficiëntie en gewenste verlies-off-functie fenotypes in tegenstelling tot RNA-interferentie, die actief is op post-transcriptioneel niveau²⁴. Als reactie op de beperkte werkzaamheid van KRAB bij het uitschakelen van doelwitten, werd een fusie van KRAB en MeCP2 met dCas9 geïntroduceerd als een effectievere repressiestrategie²⁵.

Hoewel uitschakeling van één gen de levensvatbaarheid van kanker kan beïnvloeden, kunnen synthetische dubbele of meervoudige dodelijke interacties kankercellen redden van celdood²⁶. Bij synthetische letaliteit zijn twee of meer genen betrokken, die elk de functie van de andere kunnen compenseren. Om problemen met knockdown-schermen met één gen op te lossen, bieden dubbele CRISPR-strategieën gericht op dodelijke eiwitcoderende genparen een veelbelovende aanpak²⁷.

Hier presenteren we een protocol voor het combinatorische gebruik van orthogonale CRISPRi-gebaseerde targeting van lncRNA of andere niet-coderende RNA-paren met behulp van Staphylococcus aureus en Streptococcus pyogenes dCas9 gefuseerd met KRAB-MeCP2 in menselijke melanoomcellen (zie figuur 1). Het protocol kan worden gebruikt voor combinatorische klassieke CRISPR-knockdown of als CRISPRi-gebaseerde screening van synthetische letale paren bij kanker. Het gebruik van twee verschillende dCas9-soorten, SpCas9 en SaCas9, in de CRISPRi-benadering maakt het mogelijk om onafhankelijk te richten op verschillende genomische loci met minimale kruisreactiviteit, waardoor de specificiteit en flexibiliteit worden verbeterd en tegelijkertijd een hoge selectiviteit op het doelwit wordt gegarandeerd. Er worden verschillende protospacer-aangrenzende motieven (PAM's) gebruikt: NGG voor SpCas9 en NNGRRT voor SaCas9. Het dubbele dCas9-systeem pakt uitdagingen zoals beperkte sgRNA-compatibiliteit aan door nauwkeurige, gelijktijdige modulatie mogelijk te maken en de concurrentie van het sgRNA-RNP-complex te verminderen bij gebruik van een enkel type dCas9. Deze innovatie verbetert de robuustheid en veelzijdigheid van dubbele sgRNA-bibliotheekscreening. Concluderend bieden we een volledig functioneel dubbel CRISPRi-systeem in melanoomcellen als kankermodel.

Figuur 1: Schema van het dubbele CRISPRi-systeem om synthetische letale interacties van niet-coderende RNA's aan te pakken. (A) Kloonprocedure van de dubbele gRNA-vector. (B) HEK293-cellen werden getransfecteerd met envelopplasmide VSV-G, verpakkingsplasmide PAX2 en transfervector om lentivirussen te produceren voor daaropvolgende transductie in 501-mel-cellen. Lentivirussen die de genetische informatie bevatten voor SpdCas9-KRAB-MeCP2 (blauw) en SadCas9-KRAB-MeCP2 (rood) werden tegelijkertijd geïntegreerd in 501-mel-cellen. Na antibioticaselectie werd een tweede lentivirale transductie uitgevoerd om de gewenste dubbele gRNA's (olijfgroen) te integreren. (C) 501-melcellen die de dCas9-varianten tot expressie brengen, interageren met hun overeenkomstige gRNA's om de genexpressie van het doelwit tot zwijgen te brengen, wat resulteert in de dood van kankercellen. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

De menselijke melanoomcellijn 501-mel (RRID: CVCL_4633) werd vriendelijk ter beschikking gesteld door het Aifantis Lab (New York University). De Lenti-X 293T HEK-cellijn is gekocht bij Takara Bio. Deze cellijnen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 °C in een 5% CO₂ -atmosfeer onder steriele omstandigheden. Cellen werden gepasseerd totdat ze 80%-90% confluentie bereikten. Cellijnen werden regelmatig getest op mycoplasma-besmetting.

1. Ontwerpen van gRNA's met behulp van een online gRNA-ontwerpplatform

1. Ontwerp één gRNA specifiek voor SpCas9 en één gRNA specifiek voor SaCas9 voor elk doel-lncRNA om te evalueren welke variant superieure knockdown-resultaten oplevert.
2. Richt je op de gewenste lncRNA's, hier RP11-120D5.1 (RP11) en XLOC_030781 (XLOC), met behulp van het meest efficiënte gRNA voor elke S. pyogenes (gRNA-sp) Cas9 en S. aureus (gRNA-sa) Cas9.
   OPMERKING: De S. pyogenes gRNA's kunnen worden geëxtraheerd uit Petroulia et ^al.28.
3. Volg locatiespecifieke aanbevelingen om prioriteit te geven aan de hoogste activiteit op het doel, uitgedrukt in hoge scores op het doel, terwijl overeenkomsten buiten het doel worden geminimaliseerd, zoals gesuggereerd door gRNA-ontwerptools.
   1. Kies het genoom GRCh38 (hg, Homo sapiens). Selecteer de PAM-site voor de specifieke SpCas9 (NGG) en SaCas9 (NNGRRT).
   2. Gebruik de off-target scoringsmethode van Hsu et ^al.29. Plaats de gRNA's binnen een venster van -150 bp tot +50 bp rond de transcriptionele startplaats voor optimale prestaties.
   3. Kies gRNA's met de hoogste on-target en off-target score (zie aanvullende tabel 1).
4. Combineer een niet-gericht of vervormd controle-gRNA, hier tegen Rosa26, met elk doel-gRNA om een dubbele gRNA-vector te creëren, gericht op één lncRNA. De combinatie van doel-gRNA's in één plasmide maakt plaatsspecifieke modificatie van beide doellocaties mogelijk.
   OPMERKING: De dubbele gRNA-vector die controle-gRNA en doel-gRNA herbergt, maakt het mogelijk om één doel-lncRNA uit te schakelen, terwijl dubbele gRNA-vectoren die gRNA's bevatten die gericht zijn op locaties, gelijktijdige uitschakeling van gerichte lncRNA's mogelijk maken.

2. gRNA-klonen

1. Voer een overlappende extensie-PCR uit met behulp van twee DNA-fragmenten die de gRNA-sequentie bevatten. Gebruik de U6 voorwaartse primer en H1 omgekeerde primer (zie aanvullende tabel 2) voor amplificatie zoals beschreven door Najm et al.27.
   1. Zet een 50 μL PCR-reactie op met 25 μL 2x High-fidelity PCR-mastermix met HF-buffer en 1 μL van elk DNA-fragment dat de S. pyogenes of S. aureus gRNA bevat. Voer de reactie uit onder de volgende cyclusomstandigheden: eerste denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s, gevolgd door 15 denaturatiecycli bij 98 °C gedurende 5 s, gloeien bij 55 °C gedurende 10 s en rek bij 72 °C gedurende 15 s.
   2. Voeg 2,5 μl U6 forward primer en 2,5 μl H1 reverse primer toe na het voltooien van de eerste 15 cycli en onderwerp de reactie aan nog eens 20 cycli onder dezelfde omstandigheden, met een laatste verlenging gedurende 5 minuten bij 72 °C.
   3. Zuiver de PCR-producten met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Verteer 1 μg van het gemodificeerde plasmide met 1 μl BsmB1-restrictie-enzym en 1 μl 10x buffer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een reactie van 10 μl.
   5. Kloon de PCR-producten in het verteerde dual-gRNA-Zeo-GFP-plasmide (zie aanvullende figuur 1 en aanvullend bestand 1) met behulp van een hifi-DNA-assemblagereactieprotocol zoals beschreven door anderen³⁰.
   6. Transformeer chemisch competente E. coli-cellen door 50 μL bacteriecultuur te mengen met 4 μL montageproduct volgens de instructies van de fabrikant.

3. Productie van lentivirussen

LET OP: Behandel actieve lentivirussen bij alle stappen en volg de toepasselijke veiligheidsrichtlijnen. Voer werkzaamheden met virussen altijd uit in een veiligheidskast van klasse 2 om gevaren door onvermijdelijke aërosolvorming te voorkomen. Voer alle werkzaamheden buiten de veiligheidskast, zoals centrifugeren, uit in aërosoldichte containers en rotoren die zijn goedgekeurd voor gebruik met organismen van risicogroep 2. Draag te allen tijde geschikte beschermende kleding, waaronder een laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril, in de werkruimte. De werkoppervlakken moeten worden behandeld met een desinfecterende oplossing en ander afval moet ook worden behandeld met een desinfecterende oplossing, zodat ze ten minste 240 minuten in de afgesloten kast onder UV-licht kunnen blijven. Gebruikte serologische pipetten en pipetpunten moeten worden afgespoeld in een desinfecterende oplossing voordat ze in autoclaveerbare flessen worden weggegooid. Daarna dient het afval in de S2 afvalcontainer te worden gedeponeerd. Het S2-afval wordt gedeactiveerd door middel van autoclaveren. Getransduceerde cellijnen kunnen onder S1-omstandigheden niet eerder dan 2 dagen na transductie worden gehanteerd en alleen na ten minste twee volledige veranderingen van het kweekmedium met een virusvrij medium.

1. Tel Lenti-X 293T HEK-cellen door 10 μL cellen te mengen met 10 μL Trypan blauwe oplossing in een hemocytometer. Plaat 4 x 10⁶ Lenti-X 293T HEK cellen per 10 cm plaat om de volgende dag ~80% confluency te bereiken.
2. Werk vanaf deze stap in een laboratorium van klasse 2. Meng 500 μL van een geschikt transfectiemedium met 11,25 μg overdrachtsvector SpdCas9-KRAB-MeCP2 (zie Aanvullend Bestand 2), 5,5 μg envelopplasmide VSV-G, en 16,5 μg pPAX2-vector. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik voor de tweede dCas9-variant de overdrachtsvector SadCas9-KRAB-MeCP2 (zie aanvullend bestand 3).
3. Meng in een aparte buis 500 μL gereduceerd serummedium met 36 μL PEI-reagens (voorraad: 1 mg/ml). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Meng de mengsels en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het mengsel voorzichtig druppelsgewijs toe aan het celmedium (6 ml) en incubeer een nacht bij 37 °C en 5% CO₂ . Zorg ervoor dat cellen gehecht blijven om verminderde lentivirale opbrengst te voorkomen.
5. Gooi het medium na 12-15 uur met behulp van een serologische pipet weg in een autoclaveerbare afvalfles. Spoel vanaf nu verbruiksartikelen, waaronder serologische pipetten en pipetpunten, af met de desinfecterende oplossing voordat u ze bij het autoclaafafval gooit. Voeg 5 ml vers DMEM-medium toe aan de getransfecteerde cellen met behulp van een nieuwe pipet.
6. Oogst lentivirussen door het bovenstaande met behulp van een serologische pipet over te brengen naar een canonieke buis van 50 ml 48 uur na transfectie. Bewaar de canonical tube in de koelkast. Voeg 5 ml vers medium toe aan de cellen en incubeer de cellen nog 24 uur.
7. Herhaal de verzameling lentivirussen door het bovenstaande over te brengen naar dezelfde canonieke buis van 50 ml die de eerste oogst bevat. Voeg opnieuw 5 ml vers medium toe, incubeer gedurende 24 uur en breng het bovenstaande daarna over in de canonieke buis van 50 ml. Bewaar de gecombineerde supernatanten van de eerste, tweede en derde oogst in de canonieke buis van 50 ml bij 4 °C tot filtratie en centrifugatie.
8. Centrifugeer het gecombineerde supernatans gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °C in aërosoldichte recipiënten en rotoren die zijn goedgekeurd voor gebruik met organismen van risicogroep 2 om losgeraakte cellen en puin te pellets. Filtreer het bovenstaande door spuitfilters van 0,2 μm die geschikt zijn voor steriele celcultuur.
9. Concentraat het gefilterde supernatans bij 1.000 x g en 4 °C met behulp van een centrifugaalfiltereenheid met een geschikte grenswaarde voor het molecuulgewicht van 100 kDa tot ongeveer 500 μl. Bewaar virushoeveelheden van 50-100 μl bij -80 °C tot verder gebruik.

4. Lentivirustransductie en selectie van stabiele getransfecteerde cellen

LET OP: Voer altijd werkzaamheden met virussen uit in een veiligheidskast van klasse 2.

1. Plaat 501-mel cellen in een plaat met 6 putjes op 2 x 10⁵ cellen/putje met een eindkweekvolume van 2 ml, 1 dag voor transductie.
2. Vervang het kweekmedium door 2 ml voorverwarmd DMEM-medium aangevuld met polybreen in een eindconcentratie van 6 μg/ml.
3. Vanaf nu is werk in het lab van klasse 2 vereist. Voeg tegelijkertijd 50 μL lentivirussen met SpdCas9-KRAB-MeCP2 en SadCas9-KRAB-MeCP2 toe aan de cellen. Spoel verbruiksartikelen, inclusief serologische pipetten en pipetpunten, af met de desinfecterende oplossing voordat u ze bij het autoclaafafval gooit. Schud de plaat voorzichtig en incubeer bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ .
4. Gooi het medium met behulp van een serologische pipet weg in een autoclaveerbare fles en voeg 16 uur na de transductie 2 ml vers medium met blasticidine (10 μg/ml) en puromycine (2 μg/ml) toe.
5. Ga door met de selectie door het medium na 2 dagen te vervangen door vers medium van 2 ml dat blasticidine (10 μg/ml) en puromycine (2 μg/ml) bevat. Behandel getransduceerde cellen onder S1-omstandigheden na 7 dagen na transductie.
   OPMERKING: Antibioticaselectie moet worden uitgevoerd totdat alle niet-getransduceerde controlecellen zijn afgestorven. Afhankelijk van de weerstandscassette in de overdrachtsvector kunnen alternatieve selectiestrategieën worden gebruikt. Optimaliseer indien nodig de antibioticaconcentraties met behulp van een dodingscurve. Uitgebreide selectie van eencellige klonen door middel van flowcytometrie of seriële verdunning en plating, gevolgd door eiwitkwantificering, kan nodig zijn om celpopulaties te verkrijgen die dCas9-fusies in voldoende mate tot expressie brengen.

5. Eiwitkwantificering en Western blot-analyse

1. Tel stabiele getransfecteerde 501-melcellen door 10 μL cellen te mengen met 10 μL Trypan Blue-oplossing in een hemocytometer. Centrifugeer 1 x 10⁶ van de cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml ijskoude PBS.
2. Herhaal de centrifugatie en suspendeer de celpellet in 50 μl RIPA buffer met proteaseremmers. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs en verwijder celresten door centrifugeren bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar het bovenstaande bij -20 °C of gebruik het onmiddellijk voor de kwantificering van het eiwit, zoals door anderen beschreven³¹.
3. Meng 10 μg eiwit met 4 x LDS-buffer, 50 mM DTT en vul tot 20 μL met gedestilleerd water. Scheid de eiwitten op een 10% scheidingsgel met behulp van SDS-PAGE op basis van Tris/glycine bij 135 V gedurende 1 uur, zoals eerder beschreven³². Breng eiwitten over naar een PVDF-membraan bij 90 V gedurende 90 minuten met een overdracht in een natte tank.
4. Incubeer het membraan in blokkeerbuffer (5% magere melk in TBS-T) gedurende 1 uur bij 180 tpm bij kamertemperatuur.
5. Voeg 1:10.000 anti-GAPDH monoklonaal antilichaam van de muis toe aan de blokkeerbuffer als interne controle. Voeg het primaire antilichaam anti-Cas9 (S. pyogenes) of anti-Cas9 (S. aureus) toe in de verdunning 1:1.000 in de blokkeerbuffer en incubeer een nacht bij 4 °C onder voorzichtig schudden.
6. Was het membraan 3x met TBST-buffer gedurende 10 minuten elk. Incubeer met secundair anti-muis HRP-antilichaam (1:10.000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
7. Was 3x met TBST-buffer gedurende 10 minuten elk. Detecteer signalen met behulp van ECL-substraat en een beeldvormingssysteem.

6. Dubbele levensvatbaarheidstest voor LncRNA-repressie

LET OP: Voer altijd werkzaamheden met virussen uit in een veiligheidskast van klasse 2.

1. Zaad 0,1 x 10⁵ cellen met stabiel getransfecteerd SadCas9-KRAB en SpdCas9-KRAB 7 dagen na transductie in een plaat met 96 putjes in 100 μL voorverwarmd DMEM-medium 1 dag voor transductie.
2. Vervang op de dag van transductie het kweekmedium door 100 μL voorverwarmd DMEM-medium aangevuld met polybreen in een eindconcentratie van 6 μg/ml. Vanaf nu is werk in het lab van klasse 2 vereist. Voeg het juiste volume lentivirussen toe aan de cellen.
   OPMERKING: Het volume lentivirussen dat de dubbele gRNA-vector bevat, moet worden onderzocht met behulp van GFP om een lineaire curve te genereren door lentivirussen te titreren.
3. Vervang het medium 16 uur na transductie door vers medium dat 500 μg/ml Zeocin, 5 μg/ml blasticidine en 1 μg/ml puromycine bevat.
4. Voer luminescentiedetectie 5 dagen na de transductie uit met behulp van een cellevensvatbaarheidstest volgens de instructies van de fabrikant.

Resultaten

De expressiecassettes van SadCas9-KRAB-MeCP2 en SpdCas9-KRAB-MeCP2 werden gelijktijdig geïntegreerd in 501-melcellen door middel van transductie met gelijke hoeveelheden lentivirussen. Aangezien dit CRISPRi-protocol gebaseerd is op de expressie van dCas9-KRAB-MeCP2-varianten, is westerse blot-analyse ideaal om hun aanwezigheid op eiwitniveau te bevestigen. Na de verrijking van positief getransfecteerde cellen werden monsters verzameld voor Western blot-analyse om de aanwezigheid van de dCas9-KRAB-MeCP2-orthesen te bevestigen. Na succesvolle transductie wordt een enkele band verwacht die overeenkomt met het SpdCas9-KRAB-MeCP2-fusie-eiwit (202 kDa) en het SadCas9-KRAB-MeCP2-fusie-eiwit (170 kDa) en dit werd bevestigd, zoals weergegeven in figuur 2A, met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de respectieve Cas9-orthologen. Als Western blot echter niet haalbaar is, kan qPCR worden gebruikt om de fusie-eiwitten op mRNA-niveau te verifiëren.

Zodra 501-melcellen die de functionele repressoren stabiel tot expressie brengen, waren gegenereerd, werd een tweede lentivirale transductie uitgevoerd met behulp van een dubbele gRNA-vector. Van RP11 en XLOC werd eerder aangetoond dat ze werden opgereguleerd in kortetermijnculturen van gemetastaseerd melanoom, en individuele CRISPRi-targeting toonde hun impact op proliferatie en celoverleving^{aan 28}. Daarom hebben we dit lncRNA-paar geselecteerd voor evaluatie als een proof-of-concept synthetische letale niet-coderende RNA-combinatie, anticiperend op een cumulatief, gemakkelijk waarneembaar groeifenotype in de gemodificeerde cellen.

Om de effecten van dubbele CRISPRi in kankercellen te onderzoeken met behulp van levensvatbaarheidstests, moeten beide gerichte lncRNA's effectief worden onderdrukt. qPCR is de meest geschikte methode om deze onderdrukking te bevestigen door hun transcriptieniveaus te meten. We evalueerden de functionaliteit van het ontwikkelde dubbele CRISPRi-protocol door RNA-niveaus te bepalen en de levensvatbaarheid van de cel te onderzoeken bij het richten op het potentieel dodelijke RP11- en XLOC-paar. Daarom werden verschillende gRNA's gericht op RP11 en XLOC geïntroduceerd om de doel-RNA-niveaus te verlagen. De onderdrukking van RNA werd onderzocht met behulp van doelwitspecifieke gRNA's voor SadCas9-KRAB-MeCP2 of SpdCas9-KRAB-MeCP2, individueel getest en in combinatie met een controle-gRNA gericht op Rosa26 (zie figuur 2B). Hoewel gRNA's die zich richten op XLOC of RP11 individueel hun respectievelijke doelen effectief onderdrukten, werd gelijktijdige knockdown van zowel XLOC als RP11 alleen bereikt met het XLOC-sa/RP11-sp-paar.

Aangezien zowel XLOC- als RP11-RNA-niveaus met succes werden verlaagd in de 501-mel-cellijn met het geselecteerde XLOC-sa/RP11-sp gRNA-paar, werd een dubbele lncRNA-repressie-levensvatbaarheidstest uitgevoerd (zie figuur 2C). Na 5 dagen was de levensvatbaarheid van de cellen 81% en 89% van de Rosa26-controle wanneer de doelgRNA's afzonderlijk werden gebruikt. De combinatie van RP11-sp en XLOC-sa resulteerde in een verdere significante vermindering in vergelijking met RP11-sp alleen, met een levensvatbaarheid van de cellen op 59% van de Rosa26-controle.

Figuur 2: Functionaliteit van het dubbele lncRNA-repressiesysteem. (A) Western blot-analyse werd uitgevoerd om de dCas9-KRAB-MeCP2-varianten te detecteren in gemodificeerde 501-mel-cellen met behulp van anti-Cas9-antilichamen. 501-mel wildtype (WT) cellen zonder transductie werden gebruikt als controle (zie aanvullende figuur 3, aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5, aanvullende figuur 6 voor de ruwe vlek). (B) qPCR-gebaseerde analyse van RP11- en XLOC-RNA-niveaus ten opzichte van Rosa26-controlecellen na de transductie van dubbele gRNA's in gemodificeerde 501-mel-cellen. GAPDH werd gebruikt als het huishoudgen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. (C) De levensvatbaarheidstest met dubbele lncRNA-repressie werd uitgevoerd na integratie van dubbele gRNA's in gemodificeerde 501-melcellen in drie onafhankelijke transducties. Luminescentiewaarden werden genormaliseerd naar de Rosa26-controle. De resultaten van de levensvatbaarheid worden uitgedrukt als het gemiddelde (n = 3) ± SEM. Er werd een ongepaarde t-test uitgevoerd. Een sterretje (*) geeft een significant verschil aan bij p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Plasmidekaart. De kaart is gemaakt met Benchling (https://benchling.com/). De gebruikte plasmiden in het protocol zijn gewijzigd van Addgene #96921 en #110824. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Aanvullende Figuur 2: Western blot analyse van
dCas9-KRAB-uitdrukking. (A) SadCas9-KRAB-expressie in 501-melcellen 6 dagen na transfectie. (B) Sequentiële transductie van SadCas9-KRAB en SpdCas9-KRAB in 501-mel-cellen leidde tot verminderde SadCas9-KRAB-expressie 3 weken na transfectie. (C) Gelijktijdige transductie van SadCas9-KRAB en SpdCas9-KRAB in 501-mel-cellen resulteerde in verminderde SadCas9-KRAB-expressie 3 weken na transfectie. (D) SpdCas9-KRAB-expressie kon worden waargenomen na gelijktijdige transductie van SadCas9-KRAB en SpdCas9-KRAB. LV. Het volume van lentivirussen dat in μL wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Ruwe gegevens van Western blot SaCas9-KRAB. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Ruwe gegevens van Western blot SpCas9-KRAB. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: GAPDH_SpCas9-KRAB ruwe gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: GAPDH_SaCas9-KRAB ruwe gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Gebruikte gids-RNA-sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Gebruikte DNA-sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: FASTA-bestand van dual-grna-zeo-gfp. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: FASTA-bestand van dSpCas9-krab-mecp2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: FASTA-bestand van dSaCas9-krab-mecp2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze studie hebben we een dubbele lncRNA-targetingstrategie geïmplementeerd in melanoomcellen met behulp van CRISPRi op basis van dCas9-KRAB-MeCP2 van twee orthogonale soorten. Door gebruik te maken van dit systeem hebben we met succes een synthetisch dodelijk paar lncRNA's, RP11 en XLOC, onderdrukt, wat leidde tot verhoogde celdood, in tegenstelling tot wanneer ze afzonderlijk werden onderdrukt. CRISPRi-systemen brengen echter een risico met zich mee van off-target genonderdrukking, wat mogelijk de interpretatie van de resultaten beïnvloedt. Hoewel er geen experimentele validatie werd uitgevoerd, hebben we potentiële off-target effecten geminimaliseerd tijdens het gRNA-ontwerp in silico.

Variabiliteit in transductie-efficiëntie kan van invloed zijn op de reproduceerbaarheid. Daarom hebben we de transductie geoptimaliseerd door gelijke hoeveelheden lentivirussen toe te passen, bepaald door middel van een standaard curvekalibratie met behulp van variërende lentivirusconcentraties. De grotere laadomvang van de nieuw ontworpen vector kan echter beperkingen opleggen aan de efficiëntie van lentivirale verpakkingen, waardoor de transductie-efficiëntie mogelijk wordt verminderd, met name in moeilijk te transduceren cellijnen. Als gevolg hiervan kan het bereiken van voldoende transductie en robuuste dCas9-expressie in bepaalde gevallen hoge virale titers vereisen. Bovendien kan onvoldoende knockdown worden omzeild door regelmatig de dCas9-KRAB-MeCP2-eiwitniveaus en RNA-expressie van gerichte lncRNA's te controleren. Als alternatief zijn er dCas9-versies beschikbaar met slechts één repressorsysteem om deze beperking te overwinnen, maar met de kosten van verminderde efficiëntie²⁵.

Alleen de XLOC-sa-RP11-sp-combinatie vertoonde succesvolle activiteit, terwijl de omgekeerde XLOC-sp-RP11-sa-configuratie niet effectief was. Een plausibele verklaring voor dit verschil in knockdown-effectiviteit is de wisselwerking tussen PAM-specificiteit en chromatinetoegankelijkheid³³. Aangezien SaCas9 en SpCas9 verschillende PAM-sequenties herkennen, kan de doellocatie voor SpCas9 in de XLOC-sp-RP11-sa-oriëntatie een optimale PAM missen, waardoor de bindingsaffiniteit en de daaropvolgende activiteit worden verminderd. Bovendien zou de ruimtelijke rangschikking van de twee dCas9-fusie-eiwitvarianten de chromatine-architectuur en toegankelijkheid kunnen beïnvloeden^34,35, waardoor de rekrutering van de transcriptiemachinerie of bijbehorende regulerende factoren in de XLOC-sp-RP11-sa-configuratie mogelijk wordt beperkt. Deze bevindingen suggereren dat de relatieve positionering van SaCas9 en SpCas9 binnen een bepaalde genomische context een kritische invloed kan hebben op hun functionele werkzaamheid, een aspect dat verder onderzoek rechtvaardigt naar geoptimaliseerde CRISPR-gebaseerde modulatiestrategieën.

Het ontwikkelde protocol is aanpasbaar voor het richten op of screenen van andere synthetische letale niet-coderende RNA-paren door de dubbele gRNA-vector te wijzigen. Zodra een interessante cellijn beide dCas9-varianten stabiel tot expressie brengt, worden verschillende benaderingen haalbaar. Hoewel RNAi, ASO's en shRNA's kunnen worden gebruikt voor gen-uitschakeling, biedt CRISPRi een eenvoudigere screeningmethodologie en is de combinatie met kleine chemische verbindingen of remmers ook denkbaar. Door de dubbele gRNA-vector te vervangen door een dubbele gRNA-bibliotheek, maakt dit protocol de systematische screening van synthetische letale paren of andere genetische afhankelijkheden in kankercellen mogelijk, waardoor de precisie van het richten op kankercellen wordt verbeterd.

Hoewel we integratie van de dCas9-KRAB-MeCP2-varianten hebben bereikt door middel van lentivirale transductie, kunnen alternatieve stabiele transfectiemethoden ook worden gebruikt om de gewenste enzymen in 501-mel-cellen op te nemen. Dit is met name relevant, omdat, naar onze ervaring, het uitschakelen van grote constructies zoals dCas9-KRAB-MeCP2 in de loop van de tijd kan plaatsvinden^36,37. Als alternatief bleek dCas9-KRAB een kleiner alternatief^{te zijn 23}. Onze ervaring is dat transductie met de kleinere dCas9-KRAB-fusie-eiwitten afgeleid van Cas9-orthologen leidde tot verminderde eiwitexpressie tijdens langdurige teelt (zie aanvullende figuur 2). Daarom moet een consistente eiwitexpressie regelmatig op terugkerende tijdstippen worden gecontroleerd. Bovendien kan het transduceren van twee grote fusie-eiwitten samen met selectiemarkers en dubbele gRNA-expressiecassettes cellulaire stress veroorzaken of lentivirale verpakkingscapaciteiten bereiken.

Het bereiken van 100% knockdown-efficiëntie in dubbele CRISPRi kan een uitdaging zijn vanwege een suboptimaal gRNA-ontwerp of onvoldoende dCas9-expressie. Om dit aan te pakken, moeten meerdere gRNA's per doelwit worden getest met behulp van geavanceerde ontwerptools om de meest effectieve sequenties te identificeren. Bovendien kan het optimaliseren van dCas9-KRAB-MeCP2-expressie door middel van verbeterd vectorontwerp en karakterisering van klonale cellijnen de knockdown-efficiëntie verbeteren.

Alternatieve strategieën voor de integratie van het CRISPRi-systeem omvatten het gebruik van transposasevectoren of CRISPR-gestuurde integratie om een stabiele insertie te bereiken in veilige havengenomische sites, die bekend staan om het behoud van stabiele expressie in de loop van de tijd³⁸. Veel celtypen, waaronder melanoomcellen, zijn echter een uitdaging om te transfecteren³⁹, waardoor lentivirale transductie de voorkeursmethode is. Elektroporatie van enzymen op basis van transposase of Cas kan een alternatief bieden om de dCas9-KRAB-MeCP2-constructen te integreren in melanoomcellen⁴⁰. Het implementeren van een induceerbaar knock-outsysteem zou voordelig zijn voor het activeren van dCas9-KRAB-MeCP2-expressie als dat nodig is, in plaats van constitutieve expressie om cellulaire stress te minimaliseren.

Ten slotte is de ontwikkelde benadering niet beperkt tot melanoomcellen, maar kan deze worden uitgebreid tot elk celtype waar synthetische letaliteit wordt onderzocht. Deze aanpak is expliciet bedoeld om te worden opgeschaald naar de screeningsmodaliteit van de gRNA-bibliotheek. Vanwege de verhoogde combinatorische complexiteit, bijvoorbeeld met meer dan drie gRNA's per genenpaar, inclusief controles en ten minste 300x dekking, kan echter praktisch alleen een subtranscriptomische fractie van tot expressie gebrachte lncRNA's worden aangepakt. Daarom moeten gebruikers kandidaten zorgvuldig voorselecteren door rekening te houden met factoren zoals lncRNA-expressieniveaus en hun bekende relevantie in specifieke cellulaire contexten voordat ze doorgaan met de bibliotheekscreening. Desalniettemin maakt de combinatorische veelzijdigheid van deze benadering het een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van synthetische letale interacties en andere genetische afhankelijkheden van lncRNA's bij verschillende soorten kanker en mogelijk andere ziekten. Dit breidt de momenteel beschikbare toolkit uit voor het bestuderen van deze netwerkinteracties in cellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO	Millipore	UFC910024
anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology	48989
anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) monoclonal antibody	Cell Signaling Technology	14697
anti-GAPDH mouse monoclonal antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-Mouse IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	A9044
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Blasticidine S hydrochloride	Sigma Aldrich	15205-25MG
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Centrifuge	Eppendorf	5415R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
Clarity Western ECL Substrate, 500 mL	Bio-Rad	1705061
CO2 Incubator Model CB 170	Binder
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001
Esp3I (BsmB1) restriction enzyme	Thermo Scientific	ER0451
Falcon 10 mL Serological Pipet	Corning	356551
Falcon 25 mL Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 5 mL Serological Pipet	Corning	356543
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F9665-500ML
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), high glucose, pyruvate	Gibco	41966029
Human melanoma cell line 501-mel	was kindly provided by the Aifantis Lab (New York University)	RRID: CVCL_4633
Immobilon -P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Lenti-X 293T HEK cell line	Takara Bio	632180
Mini Trans-Blot Cell system	Bio-Rad
Mini-PROTEAN Tetra Handcast System	Bio-Rad
NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction	New England Biolabs	E2621
Non-fat milk powder	Biomol	54650
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Invitrogen	NP0008
One Shot Stbl Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C737303
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062
PCR Tubes 0.5 ml (Flat Cap)	VWR International	732-3207
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	45000-446
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	Thermo Scientific	F531L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Polybrene	Sigma Aldrich	TR-1003-G
Polyethylenimine, branched	Sigma Aldrich	408727
Puromycin dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	sc-108071A
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
SafeSeal Microcentrifuge Tube 1.5 mL	Sarstedt	72,706
Sodium chloride, 5 M Aqua Solution, RNase Free	Alfa Aesar	J60434.AE
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771
Syringe Filter PES 33mm 0.2 μM	Fisher Scientific	15206869
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	8,33,902
TC Plate 6 Well, Standard, F	Sarstedt	83,39,20,005
Tris base	Roche	10708976001
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P9416-50ML