Methodenartikel

Een efficiënte methode voor het extraheren van epitelie van de menselijke eileider voor analyses van één cel

DOI:

10.3791/67753

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een eendaagse methode voor de isolatie van menselijke eileiderepitheelcellen. Geïsoleerde epitheelcellen kunnen worden geplateerd in 2-dimensionale (2D) cultuur of worden gedissocieerd in eencellige suspensies en worden gebruikt in stroomafwaartse experimenten, waaronder flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke eileiders zijn intrinsiek aan de voortplanting. Het doel van de eileiders is om de doorvoer van sperma, de eicel en als de bevruchting succesvol is, het embryo mogelijk te maken. De epitheelcellen die het binnenoppervlak van eileiders bekleden, zijn een integraal onderdeel van zowel normale als abnormale eileiderprocessen, waaronder het initiëren van ziekten. Na de menopauze spelen eileiders geen belangrijke rol meer in het lichaam en verandert de samenstelling van de intra-epitheelcellen. We beschrijven een methode waarbij deze epitheelcellen met minimale stromale celcontaminatie uit verse eileiders kunnen worden geïsoleerd tot een eencellige suspensie. Deze cellen kunnen in cultuur worden gekweekt of worden gebruikt voor verdere analyse, zoals flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing. Dit isolatieprotocol kan in 4-6 uur worden bereikt en levert levensvatbare cellen op die kunnen worden gebruikt voor onmiddellijke stroomafwaartse analyse. Dit efficiënte protocol vergemakkelijkt de isolatie van eileiderepitheelcellen met een verrijkte epitheelpopulatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eileiders zijn opgebouwd uit meerdere delen. Van de eierstok tot de baarmoeder bestaat de eileider uit de fimbriae, ampulle, landengte en het intramurale gedeelte. De fimbriae strekken zich uit vanaf het einde van de eileider waar ze de eicel grijpen die door de eierstok wordt vrijgegeven. De eicel reist vervolgens via de ampulla, waar de kans het grootst is dat hij wordt bevrucht, naar de landengte en wordt uiteindelijk via het intramurale deel1 naar de baarmoeder overgebracht. Het binnenste slijmvlies van de eileider dat het transport van de eicellen vergemakkelijkt, bestaat uit een laag luminaal epitheel, inclusief trilhaarcellen en secretoire cellen. Ciliated cellen hebben de neiging om meer geconcentreerd te zijn in de fimbriae2. Ze spelen een integrale rol bij het fysiek verplaatsen van de eicel door de eileider van de eierstok naar de baarmoeder. Hun aanhangsels stellen de trilhaarcellen in staat om niet alleen de eicel te verplaatsen, maar ook om genotoxische stress na de eisprong op te ruimen3.

Secretoire eileiderepitheelcellen scheiden een vloeistof af die helpt bij de voeding en de assemblage van gameten4. Het aandeel trilhaarcellen en secretoire cellen langs het eileiderepitheel verschilt in de postmenopauzale toestand met een afname van trilhaarcellen omdat de eileider niet langer een kritieke functie vervult bij het transport5. Bovendien wordt aangenomen dat de eileiders bij afwezigheid van oestrogeen rudimentair worden 1,6. Dit verlies van trilhaarcellen in de eileider wordt gepositioneerd om het risico op het ontwikkelen van sereuze carcinomen te verhogen7. Bovendien wordt aangenomen dat secretoire epitheelcellen van de eileiders aanleiding geven tot sereus intra-epitheelcarcinoom (STIC) laesies, een bekende voorloper van het meest agressieve subtype van tubo-eierstokkanker, hooggradig sereus carcinoom 7,8.

Het doel van dit protocol is om epitheelcellen uit menselijke eileiders te isoleren en ze te dissociëren in eencellige suspensies. Dit protocol levert een verrijkte eencellige epitheelpopulatie op die voor veel analyses kan worden gebruikt. Zoals te zien is in dit manuscript, hebben we flowcytometrie-analyse uitgevoerd en cellen na isolatie in 2D geplateerd. Flowcytometrie-analyse toont de aanwezigheid van afzonderlijke cellen aan, die meestal levensvatbaar en epitheel van aard zijn. In deze analyses hebben we vier markers opgenomen, e506 voor levensvatbaarheid, EpCAM voor epitheelcellen, CD45 voor immuuncellen en CD10 voor stromale cellen. Dode cellen werden uitgesloten met behulp van de e506-levensvatbaarheidsmarker en immuuncellen werden afgeschermd met behulp van CD45. Het is mogelijk dat de suspensie een immuuncelpopulatie heeft; om echter een relatief zuivere populatie van epitheelcellen te bereiken, kunnen CD45-positieve cellen worden uitgeput met behulp van een CD45-depletiekit. Verder vermenigvuldigen de CD45-positieve cellen zich vaak niet wanneer ze in cultuur worden geplateerd. Cellen die via deze methode zijn geïsoleerd en in 2D zijn gekweekt, vertonen aanhangende geplaveide epitheelpopulaties. Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire preparaten te genereren, die kunnen worden ontwikkeld tot eencellige RNA-bibliotheken.

Onderzoek naar het definiëren van de cellulaire afstamming van eileiderepitheel, veranderingen in deze afstammingslijnen tijdens verschillende fasen van het reproductieve leven en het uitlokken van gebeurtenissen die leiden tot kwaadaardige transformatie en genese is de afgelopen vier jaar prominenter geworden 6,9,10,11,12 . Dit protocol zal het onderzoek in deze arena aanzienlijk ten goede komen door een efficiënte manier te bieden om epitheel van de eileiders te isoleren en tot afzonderlijke cellen te verwerken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is aangepast van een eerder beschreven methode voor het isoleren van baarmoederepitheelcellen13,14. Verse exemplaren van geanonimiseerde eileiders werden verzameld via ons door de IRB goedgekeurde protocol #10-0727 van de University of California, Los Angeles (UCLA) en binnen ongeveer 4-6 uur verteerd tot een eencellige suspensie.

1. Eileider verzamelen en voorbereiden

  1. Verzamel verse menselijke eileiders (figuur 1A) in dissociatiemedia (DMEM [4,5 g/l D-glucose] met 10% foetaal runderserum (FBS), 5 ml L-glutamine en 5 ml penicilline/streptomycine) in buisjes van 15 ml of 50 ml en vervoer op ijs naar het laboratorium.
  2. Breng de eileiders over in een steriel petrischaaltje met verse dissociatiemedia.
  3. Ontleed onder een ontleedmicroscoop vet, bindweefsel en alle bloedvaten rond de buizen met behulp van een fijne punttang en een Vannas Tübingen-schaar (Figuur 1B).
  4. Snijd onder de ontleedmicroscoop met een schaar door het coronale vlak van eileiders om kleine cilinders te vormen met een diameter van ~3-5 mm elk (Figuur 1C), met behulp van de fijne punttang om het weefsel te stabiliseren.

2. Isolatie en dissociatie van epitheelcellen

  1. Zuig de dissociatiemedia voorzichtig op uit de schaal.
  2. Was de stukjes tissue 2x met koude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door voorzichtig ~2 ml te pipetteren om de stukjes te bedekken en de plaat lichtjes te draaien.
  3. Zuig de laatste 1x PBS-wasbeurt op, incubeer de weefselstukjes gedurende 5 minuten in koude 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij kamertemperatuur en herhaal dit gedurende in totaal twee incubaties. Aspireer de 5mM EDTA na elke incubatie.
  4. Suspendeer de weefselfragmenten in koude 1% trypsine/Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) en incubeer gedurende 40 minuten bij 4 °C (figuur 1D).
  5. Zuig de 1% trypsine/HBSS op en was de stukjes weefsel 2x in koude dissociatiemedia om de trypsine te inactiveren.
  6. Incubeer de weefselfragmenten in 2 ml dissociatiemedia met 0,4 mg DNase gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Een langere incubatietijd kan nodig zijn, maar niet langer dan 45 minuten voordat u met stap 2.7 begint.
  7. Houd onder een ontleedmicroscoop, terwijl ze nog in de media zijn met DNase, een fragment van de eileider, het lumen evenwijdig aan de bodem van de schaal, op zijn plaats met een tang. Druk met de andere hand herhaaldelijk met een tang op het stuk van de eileider om epitheelcellen uit het lumen van de buis te verdrijven. Bevestig dat er een halo van cellen rond het weefsel wordt gezien wanneer cellen worden vrijgegeven uit het lumen van de buis. Herhaal dit voor elk fragment van de eileider in het schaaltje (Figuur 1E).
  8. Breng de media met cellen over in een steriele tube van 15 ml, was de petrischaal minstens 2x met dissociatiemedia en combineer de wasbeurten in de tube van 15 ml. Gooi de stromale buisfragmenten weg.
  9. Oogst de cellen door centrifugatie bij 500 × g gedurende 5 minuten. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet in 1 ml dissociatiemedia.
  10. Tel de cellen door 10 μl van de celsuspensie te verdelen en 1:1 te mengen met trypanblauw. Pipetteer 10 μl van het mengsel in een dialetje en plaats het in een cellenteller (figuur 1F).

3. Spijsvertering tot eencellige suspensie

  1. Resuspendeer de cellen in 9 ml dissociatiemedia, 1 ml 8 mg/ml collagenase (type 1) en 0,4 mg DNase. Incubeer bij 37 °C gedurende 30-45 minuten in een orbitale schudder bij 200 tpm (Figuur 1G).
  2. Oogst de cellen door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 minuten. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet in 5 ml dissociatiemedia om collagenase af te wassen.
  3. Leid de celsuspensie door een celzeef van 100 μm in een buis van 50 ml (Figuur 1H).
  4. Oogst de cellen door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 minuten.
  5. Als de celpellet rood lijkt, voer dan een lysis van rode bloedcellen (RBC) uit zoals beschreven in de stappen 3.6-3.8. Als de celpellet niet rood is, gaat u verder met stap 3.9.
  6. Verdun 500 μL RBC-lysisbuffer in 4,5 ml ultrapuur water.
  7. Zuig de media op, voeg 5 ml van de verdunde RBC-lysisbuffer toe en incubeer gedurende 3 minuten op ijs.
  8. Om RBC-lysis te stoppen, voegt u 45 ml 1x PBS toe aan de buis van 50 ml.
  9. Oogst de cellen door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 minuten.
  10. Tel de cellen door 10 μL van de celsuspensie te verdelen en 1:1 te mengen met trypanblauw. Pipetteer 10 μl van het mengsel in een dialetje en plaats het in de cellenteller (figuur 1I).

4. Flowcytometrie kleuring

  1. Aliquot 250.000 cellen in twee afzonderlijke 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem voor primaire geconjugeerde antilichamen en isotypecontrole om te gebruiken voor cytometrie van de oppervlaktemarkerstroom.
    OPMERKING: Er kunnen minder cellen worden gebruikt om plaats te bieden aan het aantal cellen en het aantal cellen dat nodig is voor downstream-analyse. Om optimale flowresultaten te bereiken, moeten minimaal 50.000 cellen in de analyse worden opgenomen.
  2. Verdun het antilichaam (bijv. anti-humaan EpCAM en CD10) en isotype volgens de door de fabrikant aanbevolen verdunning in 1x PBS. Voeg fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof (e506) en een geconjugeerd anti-humaan CD45-antilichaam toe om levende menselijke immuuncellen buiten beschouwing te laten. Maak voldoende antilichaammengsel voor minimaal 50 μL per buisje. Laat in het donker op ijs staan tot stap 4.4.
  3. Was de cellen met 1 ml 1x PBS. Oogst de cellen door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  4. Aspireer de 1x PBS. Resuspendeer de pellet in het antilichaam- of isotypepaneel en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4 °C.
  5. Na de incubatie verdunnen in 1 ml 1x PBS en de cellen oogsten door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  6. Zuig de 1x PBS op en suspendeer de celpellet in 200 μL 1x PBS.

5. Gegevensverzameling van flowcytometrie

  1. Log in op de FACS-machine.
    OPMERKING: We presenteren het protocol met behulp van de flowcytometer waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel). Houd u voor andere flowcytometers aan de instructies van de fabrikant. De spanningsinstelling van de flowcytometer is vooraf geconfigureerd voor optimale prestaties met menselijke PBMC's, waardoor het niet nodig is om de spanning aan te passen voor elke FACS-run.
  2. Als de machine zich in de acquisitiemodus bevindt, gaat u verder met stap 5.3. Als de machine zich in de gegevensanalysemodus bevindt, schakelt u over naar de acquisitiemodus door op de aan/uit-knop in de rechterbovenhoek te drukken. Wanneer een pop-up wordt weergegeven, drukt u op de knop met de tekst Acquisitiemodus.
  3. Als de machine linksonder Kalibratie vereist aangeeft, gaat u verder met stap 5.3.1. Als het apparaat Kalibratie ok aangeeft, gaat u verder met stap 5.4.
    1. Om de machine te kalibreren, haalt u de kalibratieparels uit de koelkast en vortex van 4 °C.
    2. Plaats 1 druppel kalibratiekorrels in een buis van 5 ml polystyreen met ronde bodem en plaats de buis in de enkele buishouder.
    3. Druk op de barcodeknop rechtsboven en scan de kalibratie kralenfles. Er verschijnt een pop-up. Als alles is ingesteld, klikt u op Ja | OK en laat de kalibratie uitvoeren.
    4. Als de kalibratie is geslaagd, meldt u zich af en meldt u zich weer aan bij de acquisitiemodus . Ga verder met stap 5.4.
  4. Klik linksboven op openen | nieuwe werkruimte .
  5. Selecteer chill 5 rek; Selecteer drie van de putten. Selecteer de eerste put en geef deze een beschrijving (bijv. FTX Ab). Selecteer het volgende vak en geef het een unieke beschrijving (bijv. FTX Iso). Selecteer het laatste putje en geef het de beschrijving bleekmiddel.
    OPMERKING: Voeg altijd een bleekmonster toe na elke 4-5 experimentele monsters om ervoor te zorgen dat de celmonsters tijdig worden gereinigd.
  6. Selecteer alle putjes en stel de experimentele omstandigheden als volgt in: instrumentinstellingen: Menselijke PBMC's; Debiet: hoog; Mengsteekproef: het zachte mengen; Modus: standaard; Monster totaal volume 200 μL; Monsteropname 150 μL; Annotatie: input-antilichamen en hun fluorofoorlabeling.
  7. Selecteer bewerken | opties en geef het bestand een naam onder description| apply | ok.
  8. Haal het rek uit de koelkast en plaats het op de lade met de barcode naar de machine gericht. Plaats de monsterbuisjes in het rek om de volgorde van de monsters op het scherm weer te geven en druk op de afspeelknop om het experiment te starten.
  9. Zodra het experiment is voltooid, sluit u de USB-poort aan, selecteert u Bestand | kopiëren, vouwt u de persoonlijke map uit, selecteert u het experiment en klikt u op kopiëren en uitwerpen.
  10. Gebruik na het verzamelen van de gegevens software om het gegevensblad te analyseren.
  11. Begin met de isotype-controle. Gebruik de polygoontool om cellen te selecteren in het SSC-diagram (voorwaartse verstrooiing) versus zijverstrooiing.
  12. Sluit dode cellen af door de Y-as te veranderen in e506 en de X-as in FSC. Gebruik de polygoontool om de e506-negatieve levende celpopulatie te selecteren.
  13. Dubbelklik op de geselecteerde populatie. Verander de Y-as in menselijke CD45. Gebruik de polygoontool om de celpopulatie te selecteren. Dit is de menselijke CD45-negatieve celpopulatie.
  14. Dubbelklik op de CD45-negatieve celpopulatie. Verander de Y-as in histogram en de X-as in menselijke EpCAM. Gebruik het hulpmiddel voor het selecteren van het bereik om op het einde van het histogram te klikken en selecteer de lege ruimte tot het einde van de grafiek. Dit vertegenwoordigt de EpCAM-positieve populatie. Herhaal dit voor menselijke CD10-kleuring.
  15. Sleep isotype gating onder de werkruimte voor antilichamen. CD45-positieve cellen worden afgeschermd en er worden EpCAM-positieve en CD10-positieve populaties geselecteerd.
  16. Als u representatieve histogrammen wilt maken, selecteert u lay-outeditor. Sleep de gewenste histogrammen naar de lay-outpagina. Om de kleuring van isotypen en antilichamen te vergelijken, legt u het isotypehistogram over het antilichaamhistogram. Poort de positieve cellen op basis van de isotypecontrole.

6. Immunocytochemie

  1. Kweek cellen na de laatste isolatiestap in de gewenste kamerglasdia tot ze samenvloeien.
  2. Om de cellen te fixeren, voegt u 500 μL koude 4% paraformaldehyde (PFA) toe en broedt u gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Zuig de 4% PFA op en was 3x met 1x PBS.
  4. Om de cellen te permeabiliseren, voegt u ten minste 200 μL 0,25% Triton-X in PBS toe en incubeert u gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Bereid tijdens de permeabilisatie de blokkeerbuffer voor (4% normaal geitenserum [NGS] voor antilichamen die niet bij geiten worden geproduceerd).
  6. Zuig de 0,25% Triton-X op en was 3x met 1x PBS.
  7. Voeg minimaal 200 μL blokkeerbuffer toe (4% NGS in PBS). Blok gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. Bereid primaire antilichaamverdunningen in 1% NGS in 1x PBS volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  9. Voeg na het blokkeren ten minste 200 μl van de primaire antilichaamoplossing toe. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Sommige primaire antilichamen kunnen de voorkeur geven aan een incubatie van 4 °C 's nachts; Controleer het gegevensblad van antilichamen.
  10. Bereid secundaire antilichaamoplossingen in 1% NGS in 1x PBS. Wikkel de buisjes in aluminiumfolie en bereid oplossingen in het donker, aangezien de secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn. Bewaar in het donker tot het klaar is.
  11. Na incubatie van primaire antilichamen 3x wassen met 1x PBS.
  12. Voeg ten minste 200 μl van de secundaire antilichaamoplossing toe. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Probeer tijdens de volgende stappen de dia zoveel mogelijk in het donker te houden.
  13. Na incubatie van secundaire antilichamen 3x wassen met 1x PBS.
  14. Verwijder de kamers door ze eenvoudig met de hand te verwijderen of door het gereedschap te gebruiken dat bij de geleiders wordt geleverd. Volg de aanwijzingen op de verpakking van de kamerdia voor verwijdering.
  15. Voeg een druppel 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) montageserum toe en plaats een dekglaasje op de bovenkant. Beperk het aantal bubbels en zorg ervoor dat alle cellen bedekt zijn. Optionele stap: gebruik nagellak langs de randen om het dekglaasje af te dichten.
  16. Leg de dia plat in een glaasdoos om te drogen en plaats op 4 °C tot het beeldvorming is.
  17. Afbeelding op een microscoop uitgerust met de juiste fluorescentie op basis van secundaire antilichaamconjugatie om een schoon beeld te garanderen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben zeven eileidercollecties opgenomen waar we een verrijkte epitheelcelpopulatie hebben geïsoleerd (Figuur 2A en Aanvullende Figuur S1A). Om de levensvatbaarheid en epitheelcelverrijking van deze eencellige suspensiemethode te beoordelen, werd flowcytometrie uitgevoerd. Om de levensvatbaarheid van de cellen te meten, werden cellen gekleurd met de levensvatbaarheidsmarker, e506. Dit maakte het ook mogelijk om al het vuil en dode cellen te verwijderen wanneer ze werden geanalyseerd.

Om de samenstelling van cellen die via deze methode werden geïsoleerd te bepalen, werden monsters gekleurd met een epitheelcelmarker (EpCAM), een stromale celmarker (CD10) en een immuuncelmarker (CD45). Zoals te zien is in figuur 2B, hebben we een levensvatbare en verrijkte epitheelcelpopulatie geïsoleerd uit eileiderweefsel. De levensvatbaarheid van de steekproef bedroeg gemiddeld 82%. Voor alle monsters zagen we, na het uitsluiten van CD45-positieve cellen, een verrijkte epitheelcelpopulatie met EpCAM-positieve cellen van gemiddeld 80% van de steekproef. Er was enige stromale celbesmetting, maar gemiddeld slechts 7,8%. Figuur 2C toont geïsoleerde cellen in 2D 4-6 dagen na het plateren. Het is duidelijk dat epitheelcellen werden geïsoleerd toen ze consistente aanhangende geplaveide clusters vormden. In aanvullende figuur S1B werden cellen na isolatie geplateerd en gedurende 2-6 dagen gekweekt. Immunocytochemie werd gebruikt om de cellen die in cultuur groeiden te karakteriseren. De meeste cellen in de cultuur kleurden positief voor EpCAM en de secretoire celmarker, PAX8. Slechts enkele cellen werden geïdentificeerd als vimentine-positief. Ciliated cellen werden in cultuur gezien, zoals vastgelegd op video, getoond in aanvullende video S1.

figure-results-1
Figuur 1: Experimenteel schema. (A) Eileiders worden verworven. (B) Overtollig vet en bindweefsel worden verwijderd. (C) Buizen worden in stukjes van ~3-5 mm gesneden. (D) De stukken worden gewassen in PBS, vervolgens 2x gedurende 5 minuten geïncubeerd in EDTA en gedurende 40 minuten geïncubeerd in 1% trypsine bij 4 °C. (E) Met behulp van twee tangen, één om vast te houden en één om te duwen, worden epitheelcellen uit de stukken van de eileider verdreven. (F) Breng de cellen over naar een buis van 15 ml, draai en tel. (G) Resuspenderen in DMEM, collagenase en DNase. Verwerk gedurende 30-45 min. (H) Zeef met een zeef van 100 μm. (I) Oogst door centrifugeren en tellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Karakterisering van geïsoleerde epitheelcellen. (A) Tabel met klinische informatie van de patiënt en resultaten van flowcytometrie. (B) Flowcytometrie werd uitgevoerd na isolatie om aan te tonen dat een verrijkte populatie van epitheelcellen (EpCAM-positief) was geïsoleerd. Isotype negatieve controle wordt aangegeven in zwart en het experimentele resultaat wordt aangegeven in roze. (C) Cellen werden na isolatie geplateerd. De foto's zijn 4-6 dagen na het plateren gemaakt. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: AUB = Abnormale baarmoederbloeding; EIN = Endometrium-intra-epitheliale neoplasie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Aanvullende karakterisering van geïsoleerde epitheelcellen in kweek. (A) Tabel met klinische informatie van de patiënt. (B) Geïsoleerde cellen werden gekweekt en gekleurd voor EpCAM, een secretoire celmarker (PAX8) en een stromale celmarker (Vimentin) 2-6 dagen na het uitplateren om het celtype in cultuur te karakteriseren. Schaal balken = 50 μm. Afkortingen: EIN: Endometrium, intra-epitheliale neoplasie; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende video S1: Er werden video's gemaakt van kloppende trilhaarcellen met een vergroting van 30x om trilhaarcellen in kweek te demonstreren. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is veel belangstelling voor het bestuderen van eileiderepitheel, aangezien eileiders een belangrijke rol spelen bij de voortplanting en de plaats van oorsprong zijn voor de meeste HGSOC. Daartoe hebben veel onderzoekers protocollen beschreven om eileidercellen te isoleren in zowel menselijke als muismodellen 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. De methode die we beschrijven om eileiderepitheelcellen te extraheren en te verrijken, draagt bij aan bestaande protocollen voor het isoleren van eileidercellen. Hoewel er overlappingen bestaan binnen deze protocollen, zijn er twee algemene soorten methoden gerapporteerd bij muizen en mensen. De eerste omvat het fijnhakken en enzymatisch verteren van de hele eileider, wat een totale celsuspensie van 10,12,15,16,17 geeft. De tweede omvat vervellen met agitatie of schrapen, wat resulteert in vellen weefsel 11,18,19,20,21. Met beide methoden kunnen epitheelcellen worden geanalyseerd via stroomafwaartse experimenten zoals flowcytometrie, sequencing en in-vitrocultuur. Een groot voordeel van onze methode is dat het protocol een populatie van eileidercellen oplevert die al verrijkt zijn voor epitheelcellen door enzymatische vertering en mechanische duwstappen. Deze populatie verrijkt voor epitheel kan verder worden verteerd, wat resulteert in een eencellige suspensie die kan worden gebruikt voor vele toepassingen, zoals flowcytometrie, 2D-cultuur, immunocytochemie en eencellige RNA-sequencing.

De belangrijkste stappen die we hebben gevonden om de celopbrengst te beïnvloeden, zijn onder meer de duur waarvoor de eileiderfragmenten incuberen in 1% trypsine/HBSS en DMEM/DNase. Overincubatie in beide oplossingen zal de cellen afbreken en de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk verminderen. Onvoldoende incubatietijd zal echter het vermogen van de onderzoeker om veel epitheelcellen naar buiten te duwen tijdens protocolstap 2.6 remmen, omdat ze aan elkaar zullen blijven hechten. Het is ook belangrijk om een trypsineoplossing van 1% te gebruiken, omdat zowel lagere als hogere concentraties trypsineoplossingen de opbrengst van levensvatbare eileiderepitheelcellen verminderden. Door chemische en mechanische isolatie en een verteringsstap (protocolstap 3.1) te combineren, kunnen we de periode die nodig is om van weefsel naar eencellige suspensie te gaan, exponentieel verkorten. Dit zorgt voor een goede levensvatbaarheid en tijd om downstream-analyses op dezelfde dag uit te voeren.

In protocolstap 1.4 is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de gesneden stukken eileider 3-5 mm dik zijn. Als de stukken te groot zijn, zal het moeilijk zijn om protocolstap 2.7 uit te voeren en uiteindelijk de celopbrengst te verminderen, omdat een langere incubatietijd in DMEM/DNase nodig zal zijn.

Hoewel de celsuspensie verrijkt is voor epitheelcellen, is stromale celcontaminatie onvermijdelijk. Als het preparaat puur epitheelcellen moet zijn, kan sorteren met behulp van flowcytometrie en de markers die we hebben beschreven, worden uitgevoerd om epitheelcellen te isoleren en stromale cellen uit te putten.

In dit onderzoek werden postmenopauzale eileiders gebruikt. Deze methode is echter met succes toegepast in ons laboratorium op premenopauzale eileiders. Het belangrijkste verschil tussen pre- en postmenopauzale eileiders is de samenstelling van trilhaar- en secretoire epitheelcellen1. Dit protocol werkt voor alle voortplantingsstadia.

Dit efficiënte protocol zal het onderzoeken van celtypen van het eileiderepitheel vergemakkelijken, inclusief het afbakenen van cellulaire lijnen, hun dynamische veranderingen tijdens reproductieve cycli en na de menopauze, en hun rol bij het initiëren van hooggradige sereuze eierstokkanker.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs Ruegg L, James-Allan LB en DiBernardo G worden gedeeltelijk ondersteund door de projecten van de Greater Los Angeles Veterans Association 1I01BX006019-01A2 en I01BX006411-01 tot Memarzadeh S. Auteur Ochoa C wordt ondersteund door UCLA Eli en Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Rose Hills Foundation Graduate Scholarship Training Program. We willen het Translational Pathology Core Laboratory van UCLA en in het bijzonder Ko Kiehle en Chloe Yin bedanken voor hun hulp bij het verkrijgen van weefsel. We willen ook Ken Yamauchi en de BSCRC Microscopy core bedanken voor hun hulp bij beeldvorming. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com (overeenkomstnummer JL27QWDYNT). Tot slot willen we Felicia Cordea en de BSCRC-flowcytometriekern bedanken voor hun hulp bij flowcytometrie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% Trypsin Thermo Scientific J63993.09
100 µm Cell StrainerCorning431752
4% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710-S
5 mL round bottom tubesCorning352008
60 mm cell culture plateCorning CLS430589-500EA
6-well Cell Culture PlateCorning353046
Anti-CD10BioLegend312212
Anti-CD326 (Ep-CAM)BioLegend324218
Anti-CD45 BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anti-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2
Chamber Slide SystemThermo Scientific 154917PK
Collagenase Thermo Scientific 17100017
DMEMThermo Scientific 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
Fine point forceps VWR102091-526Elke fijne punttang naar keuze zal werken
Fixable Viability Dye eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo software version 9 BD BiosciencesData analyse software
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific 14175-095
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec
MACSQuant Calibration BeadsMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Stemcell Technologies5620
Normal Goat SerumFisher ScientificPI31873
PBS Thermo Scientific 14190-144
Penicillin-Streptomyocin Gibco15140-122
PerCP Conjugated CD45BioLegend304026
Red Blood Cell lysis buffer Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100 
Triton X-100Thermo Scientific BP151-100
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools15003-08
VECTASHIELD with DAPIFisher ScientificNC9524612

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crow, J., Amso, N. N., Lewin, J., Shaw, R. W. Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause. Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).
  2. Patek, E., Nilsson, L., Johannisson, E. Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause. Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).
  3. Coan, M., et al. Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer. Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).
  4. Leese, H., Tay, J., Reischl, J., Downing, S. Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).
  5. Donnez, J., Casanas-Roux, F., Ferin, J., Thomas, K. Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years. Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).
  6. Lengyel, E., et al. A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).
  7. Tao, T., et al. Loss of tubal ciliated cells as a risk for "ovarian" or pelvic serous carcinoma. Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).
  8. Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).
  9. Hu, Z., et al. The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells. Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).
  10. Dinh, H. Q., et al. Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube. Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).
  11. Ulrich, N., et al. Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq. Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).
  12. Brand, J., et al. Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer. iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).
  13. Memarzadeh, S., et al. Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).
  14. Cunha, G. R. Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice. J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).
  15. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).
  16. Karst, A. M., Drapkin, R. Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells. Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).
  17. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).
  18. Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation. J Vis Exp. (177), e63168(2021).
  19. Feng, L., et al. Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells. Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).
  20. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).
  21. Fotheringham, S., Levanon, K., Drapkin, R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. (51), e2728(2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van epitheelcellenenkelcel suspensiesingle cell RNA sequencingflowcytometriemechanische digestieenzymatische digestieEpCAM positieve cellencontaminatie door stromale celleneierstokkanker

Gerelateerde artikelen