Open-source Micro-Manager Plugin voor live-view beeldvorming van fluorescerende dipolen

Summary

We hebben een open-source Micro-Manager-plug-in ontwikkeld, die live-view waarneming van fluorescerende dipolen op een gestructureerde verlichtingsmicroscoop mogelijk maakt. De plug-in ondersteunt observatie van zowel 2D- als 3D-dipooloriëntatie.

Abstract

Fluorescentiepolarisatiemicroscopie (FPM) kan de positie en dipooloriëntatie van fluoroforen in beeld brengen. Ondanks de prestaties van superresolutie-fluorescentiepolarisatiemicroscopie, belemmert hun afhankelijkheid van post-acquisitie real-time observatie. Gepolariseerde gestructureerde verlichtingsmicroscopie (pSIM) biedt superresolutiebeeldvorming van fluorescerende dipolen met hoge beeldvormingssnelheid en is zeer geschikt voor toepassingen met levende cellen. We ontwikkelden een open-source implementatie voor real-time reconstructie van polarisatiebeelden en weergave van de fluorescerende dipolen. Daarnaast hebben we de methode uitgebreid om 3D-oriëntatiemapping (3DOM) te bereiken, waardoor het bruikbaar is voor complexe biologische studies. Verder hebben we een grondige inleiding gegeven tot het uitbreiden van een bestaande SIM-microscoop op polarisatiebeeldvorming en een gedetailleerde configuratiehandleiding van Micro-Manager 2.0 geleverd om de microscoop te besturen, waardoor real-time preview van gepolariseerde beeldvorming mogelijk is. Daarnaast hebben we de MATLAB-code verstrekt voor volledige reconstructie, die zowel pSIM als 3DOM omvat. Deze uitgebreide gids is bedoeld om beginners te helpen de bewerkingen snel onder de knie te krijgen en er gemakkelijk mee aan de slag te gaan.

Introduction

Fluorescentiepolarisatiemicroscopie (FPM) is naar voren gekomen als een krachtige techniek voor het gelijktijdig in beeld brengen van zowel de positie als de dipooloriëntatie van fluoroforen, en biedt diepgaande inzichten in biologische beeldvorming ^1,2. Door de oriëntatie van biomoleculen te observeren, onthult FPM de ingewikkelde rangschikking van macromoleculen zoals actine ^3,4,5, microtubuli⁵, septine⁶, ^{DNA-filament....}

Protocol

1. Uitbreiding van een bestaande gestructureerde verlichtingsmicroscoop voor polarisatiebeeldvorming

1. Bereid een SIM-microscoop voor.
   OPMERKING: We gaan ervan uit dat lezers een bepaalde basis hebben in de opstelling van de microscoop en al over een gestructureerde lichtmicroscoop beschikken. Als u geen relevante ervaring hebt, raadpleegt u dit artikel, waarin in detail wordt beschreven hoe u een SIM-microscoop¹⁶ bouwt. De polarisatiecontrole-eenheid van "HWP+WQP+LCVR" kan worden vervangen door een pizza vortex golfplaat in ons pSIM-werk⁵ of een pizza halve....

Results

De pSIM-methode kan worden uitgevoerd op SIM-microscopen op basis van de interferentie met behulp van s-gepolariseerde laserstralen. s-polarisatie-interferentie is het meest gebruikte type simkaart en genereert contrastrijke verlichtingsstrepen. Het academische prototype van een microscoopopstelling is opgenomen in het originele werk van pSIM⁵. Kort geïntroduceerd in figuur 1, genereert een ruimtelijke.......

Discussion

In ons onderzoek hebben we een plug-in ontwikkeld die het mogelijk maakt om in realtime te bekijken van twee polarisatiebeeldvormingstechnieken, pSIM en 3DOM. Beide technologieën kunnen met een kleine aanpassing worden uitgevoerd in een bestaand SIM-systeem. We hebben de gedetailleerde stappen gegeven om de pSIM- en 3DOM-microscoop te installeren en Micro-Manager in te stellen om de microscoop te besturen en te demonstreren hoe de polarisatieresultaten voor live-weergave kunnen worden ve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm Fluorescent beads	Invitrogen	F8801
4% Formaldehyde solution	Invitrogen	R37814
Camera	Tucsen	Dhyana 400BSI V3	https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)	New Century Dental	N/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	C11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted Microscope	Nikon	TE2000 E
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C
MATLAB R2019b	MathWorks	Version R2019b	https://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0	Kopin	Version 4.0	Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0	μΜanager	Version 2.0	Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated Stage	Applied Scientific Instrumentation	MIM3	https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQ	National Instruments	781325-01	Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW Laser	Coherent	1325777
Phalloidin-AF568	Invitrogen	A12380
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Poly Methyl Methacrylate	Solarbio	M9810
ProLong Diamond	Invitrogen	P36980
Spatial light modulator	Kopin	SXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stain	Invitrogen	S11368
Triton X-100	Invitrogen	HFH10
Trypsin	Gibco	25200056
λ-DNA	Invitrogen	S11368