Method Article

Open-source Micro-Manager Plugin voor live-view beeldvorming van fluorescerende dipolen

DOI:

10.3791/67755

⸱

March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een open-source Micro-Manager-plug-in ontwikkeld, die live-view waarneming van fluorescerende dipolen op een gestructureerde verlichtingsmicroscoop mogelijk maakt. De plug-in ondersteunt observatie van zowel 2D- als 3D-dipooloriëntatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentiepolarisatiemicroscopie (FPM) kan de positie en dipooloriëntatie van fluoroforen in beeld brengen. Ondanks de prestaties van superresolutie-fluorescentiepolarisatiemicroscopie, belemmert hun afhankelijkheid van post-acquisitie real-time observatie. Gepolariseerde gestructureerde verlichtingsmicroscopie (pSIM) biedt superresolutiebeeldvorming van fluorescerende dipolen met hoge beeldvormingssnelheid en is zeer geschikt voor toepassingen met levende cellen. We ontwikkelden een open-source implementatie voor real-time reconstructie van polarisatiebeelden en weergave van de fluorescerende dipolen. Daarnaast hebben we de methode uitgebreid om 3D-oriëntatiemapping (3DOM) te bereiken, waardoor het bruikbaar is voor complexe biologische studies. Verder hebben we een grondige inleiding gegeven tot het uitbreiden van een bestaande SIM-microscoop op polarisatiebeeldvorming en een gedetailleerde configuratiehandleiding van Micro-Manager 2.0 geleverd om de microscoop te besturen, waardoor real-time preview van gepolariseerde beeldvorming mogelijk is. Daarnaast hebben we de MATLAB-code verstrekt voor volledige reconstructie, die zowel pSIM als 3DOM omvat. Deze uitgebreide gids is bedoeld om beginners te helpen de bewerkingen snel onder de knie te krijgen en er gemakkelijk mee aan de slag te gaan.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentiepolarisatiemicroscopie (FPM) is naar voren gekomen als een krachtige techniek voor het gelijktijdig in beeld brengen van zowel de positie als de dipooloriëntatie van fluoroforen, en biedt diepgaande inzichten in biologische beeldvorming 1,2. Door de oriëntatie van biomoleculen te observeren, onthult FPM de ingewikkelde rangschikking van macromoleculen zoals actine 3,4,5, microtubuli5, septine6, DNA-filament 7-9, kernporiecomplex10 en membraaneiwitten11. De snelle, niet-invasieve en live-cell compatibele mogelijkheden maken het mogelijk om de moleculaire rotatiedynamiek te volgen met een hoge temporele resolutie11,12. Wanneer geïntegreerd met bioforce-sondes, brengt FPM niet alleen krachtgroottes in kaart bij subcellulaire resolutie, maar meet het ook krachtrichtingen, waardoor ons begrip van biomechanische processen wordt vergroot door de richting van krachtente onthullen 13.

In de afgelopen decennia heeft de superresolutie fluorescentiepolarisatiemicroscopie een snelle evolutie doorgemaakt. Een opmerkelijke vooruitgang op dit gebied is lokalisatiemicroscopie met één molecuuloriëntatie, ook wel SMOLM genoemd, die zowel de positie als de oriëntatie van fluoroforen kan lokaliseren, waardoor multidimensionale lokalisatie mogelijk wordt. Polarisatiemeting in SMOLM kan worden uitgevoerd met behulp van polarisatie-excitatiemodulatie7, meerkanaals gepolariseerde detectie3 of gemanipuleerde polarisatiegevoelige puntspreidingsfunctie (PSF)14. Ondanks dat SMOLM een ruimtelijke resolutie in de orde van grootte van tientallen nanometers bereikt en de polarisatie van afzonderlijke moleculen meet, lijdt het aan een langere beeldvormingstijd. Dit komt door de zich herhalende cycli van fluorofoor knipperen en lokalisatie, die een uitdaging vormen voor beeldvorming met videosnelheid en toepassingen met levende cellen.

Gepolariseerde gestructureerde verlichtingsmicroscopie (pSIM) daarentegen biedt een ruimtelijke resolutie van ongeveer 100 nm, in combinatie met de verwerving van polarisatie-informatie met dezelfde SIM-dataset. Met name pSIM kan beeldsnelheden met videosnelheid bereiken en is zeer compatibel met beeldvorming van live-cellen, zonder strenge eisen aan fluorescerende moleculen. Onlangs heeft pSIM met succes de actineringstructuur in het membraan-geassocieerde periodieke skelet (MPS)5 onthuld en het in kaart brengen van biologische krachten met superresolutie mogelijk gemaakt13.

pSIM vereist echter beeldreconstructie na acquisitie, waardoor real-time visualisatie van polarisatieresultaten wordt voorkomen. Deze vertraging belemmert de onmiddellijke observatie van biologische fenomenen, waardoor onderzoekers niet snel biologische fenomenen kunnen vastleggen die van belang zijn en real-time aanpassingen kunnen maken aan monsters en beeldvormingsomstandigheden. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een open-source implementatie ontwikkeld die het verkrijgen van afbeeldingen en het in realtime reconstrueren en weergeven van polarisatieresultaten mogelijk maakt, op basis van het ImageJ- en Micro-Manager-platform (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Hoewel pSIM beperkt was tot het verstrekken van 2D-polarisatie-informatie in het vlak, hebben we onlangs de mogelijkheden ervan uitgebreid om 3D-oriëntatiemapping te bereiken met behulp van bijna dezelfde apparatuur15, ook wel 3D-oriëntatiemapping (3DOM) genoemd. Deze open-source software biedt ook de controle, reconstructie en visualisatie van 3DOM. De reconstructie- en visualisatiemodules zijn ook compatibel met de applicatie voor het volgen van de oriëntatie van één molecuul. Al deze functionaliteiten vergroten het nut van polarisatiebeeldvorming in complexe biologische studies.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uitbreiding van een bestaande gestructureerde verlichtingsmicroscoop voor polarisatiebeeldvorming

  1. Bereid een SIM-microscoop voor.
    OPMERKING: We gaan ervan uit dat lezers een bepaalde basis hebben in de opstelling van de microscoop en al over een gestructureerde lichtmicroscoop beschikken. Als u geen relevante ervaring hebt, raadpleegt u dit artikel, waarin in detail wordt beschreven hoe u een SIM-microscoop16 bouwt. De polarisatiecontrole-eenheid van "HWP+WQP+LCVR" kan worden vervangen door een pizza vortex golfplaat in ons pSIM-werk5 of een pizza halve golfplaat17.
  2. Meet polarisatie-extinctieverhoudingen van drie streeprichtingen door verschillende patronen op de ruimtelijke lichtmodulator (SLM) te laden. Plaats en draai een polarisator direct na het objectief en gebruik een vermogensmeter om het laservermogen te meten. Draai voor pSIM de golfplaat om de s-polarisatie van drie richtingen met een extinctieverhouding > 10 te behouden.
  3. Draai voor 3DOM de HWP2 om de p-polarisatie van zes richtingen te behouden. Vervang het ruimtelijke SIM-masker door het ruimtelijke 3DOM-masker om stralen van 1-orde in zes richtingen door te laten (zie afbeelding 1B).
    OPMERKING: s-polarisatie is vereist in pSIM, terwijl p-polarisatie vereist is in 3DOM. Gedetailleerde installatie is elders opgenomen voor pSIM5 en 3DOM15.

2. Micro-Manager instellen

  1. Download de Micro-Manager 2.0-versie van de officiële website, installeer de software door de instructies te volgen.
  2. Bereid de bijbehorende apparaatstuurprogramma's en software voor om verbinding te maken met het Micro-Manager-systeem. Gebruik in dit microscoopsysteem Micro-Manager om de camera, de translationele trap, de laser, de DAQ-kaart en de microscoop te besturen.
    OPMERKING: De ondersteunde instrumenten worden vermeld in https://micro-manager.org/Device_Support. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over de aan te sluiten instrumenten. Installeer stuurprogramma's of officiële/ondersteunende software en sluit het instrument aan op de computer met behulp van een USB-kabel.
  3. Voeg de instrumenten toe aan Micro-Manager met behulp van de wizard Hardwareconfiguratie.
    1. Open de software en selecteer Geen in de eerste vervolgkeuzelijst.
    2. Selecteer apparaten | Wizard Hardwareconfiguratie... | Maak een nieuwe configuratie en klik op Volgende om de configuratiepagina te openen.
    3. Zoek de invoegtoepassing Camera / Laser / Stage / DAQ / microscoop in de vervolgkeuzelijst met hardware en klik op Toevoegen | Akkoord | Volgende.
    4. Ga naar Standaardapparaten selecteren en kies de instelling voor automatische sluiter. Stel de standaardcamera, de standaardsluiter en de standaardfocusfase in. Klik op Volgende totdat Configuratie opslaan en afsluiten is bereikt en sla de naam van het configuratiebestand op. Klik op Voltooien.
  4. Algemene sjablooninstellingen
    1. Sla een sjabloon op voor de livemodus en de SIM-snapmodus.
    2. Stel de belichtingstijd en triggermodus als volgt in: kies Groep '+' in Configuratie-instellingen, noem de groepsnaam 'Modus', selecteer Belichting en triggermodus, klik op OK.
    3. Kies Voorinstelling '+' om verschillende voorinstellingen toe te voegen voor de groep 'Modus'. Noem een voorinstelling 'live' voor de belichtingsinstellingen in de live-modus en een andere 'SIM' voor de SIM-modus. Stel bijvoorbeeld in de 'live'-modus de belichtingstijd in op 15 ms, terwijl u voor de SIM-snapmodus 10 ms instelt voor de belichtingstijd en de triggermodus standaard (overlap) is.
      OPMERKING: Een configuratiebestand (MMConfig_psim_demo.cfg) is opgenomen in onze coderepository, die direct door Micro-Manager 2.0 kan worden geladen.

3. Systeemkalibratie met fluorescerende kralen

  1. Dompel de dekglaasjes onder in 75% ethanol, spoel de dekglaasjes 3x af met gedeïoniseerd water (ddH2O) en droog ze af.
  2. Vortex de 100 nm fluorescerende bollen (verdund tot 1:1.000 met fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]) en pipetteer de suspensie rechtstreeks op de dekglaasjes. Incubeer gedurende 5-10 minuten in een donkere omgeving en was vervolgens voorzichtig met PBS.
  3. Voeg 20 μL montagemedium toe aan het microscoopglaasje en plaats het dekglaasje eroverheen, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Houd de temperatuur op 4 °C en houd de dia in het donker, zodat de dia met 100 nm fluorescerende kralen is voorbereid voor systeemkalibratie.
  4. Verkrijg voor pSIM drie afbeeldingen van de drie verschillende fasen van fluorescerende kralen. Een aangepaste MATLAB-code (Bead_calib.m) neemt de beelden als invoer en voert twee kalibratiebeelden (calib1.tif, calib2.tif) uit voor verdere analyse.
    OPMERKING: Zoals eerder aangetoond5, kan het pSIM-experiment op de meeste commerciële systemen worden uitgevoerd. Op zelfgebouwde of in de handel verkrijgbare SIM-microscopen is systeemkalibratie vereist om de meetfout van fluorescerende dipolen te elimineren, veroorzaakt door de niet-uniforme verlichting tijdens drie patroonrichtingen. Het kalibratie-experiment gaat uit van de isotrope polarisatie van fluorescerende kralen en vereist alleen de onbewerkte beelden tijdens SIM-acquisitie. Gedetailleerde kalibratieprocedure is opgenomen in ons oorspronkelijke werk5. De uitvoer van twee kalibratiebeelden calib1.tif en calib2.tif is vereist voor pSIM-reconstructie, die de pixelgewijze verlichtingsenergie van patroonrichting 2 aangeeft; 3 verwijst naar patroonrichting 1.

4. Monsterbereiding: actine in vaste cellen

  1. Dompel de dekglaasjes onder in 75% ethanol, spoel de dekglaasjes 3x af met ddH2O. Plaats de dekglaasjes in een celkweekplaat met zes putjes.
  2. Kweek U2OS-cellen (ATCC HTB-96 cellijn) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v/v) Foetaal Runderserum (FBS) bij 37 °C en 5% CO2 op dekglaasjes tot ze ongeveer 75% samenvloeiing bereiken.
  3. Was de cellen voorzichtig 3x met PBS. Breng voor celfixatie 4% paraformaldehyde aan gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen na fixatie 3x opnieuw met PBS.
  4. Om de membraanpermeabiliteit te verbeteren, behandelt u de cellen met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten en wast u de cellen vervolgens 3x met PBS.
  5. Los fluorescerend falloïdine op met 150 μL DMSO voor stockoplossing (66μM). Bereid de phalloïdine-kleurstofoplossing door 5 μl van de stockoplossing te verdunnen met 995 μl PBS. Incubeer de cellen in het donker met Phalloidin-kleurstofoplossing bij kamertemperatuur gedurende ~1 uur. Was de cellen 3 x 3 minuten met PBS.
  6. Voeg 20 μL montagemedium toe aan het microscoopglaasje. Plaats het dekglaasje voorzichtig op de dia zonder luchtbellen. Bewaar het glaasje bij 4 °C en bewaar het op een donkere plaats.

5. Monstervoorbereiding: in-vitro λ-DNA

  1. Los 0,5 g polymethylmethacrylaat op in 10 ml prothesebasismaterialen. Breng na grondige oplossing de oplossing gelijkmatig aan op het oppervlak van de objectglaasje en wacht tot deze is verdampt om een film te vormen.
  2. Verdun 0,3 μL λ-DNA en 32 μL 1.000x SYTOX Orange Nucleic Acid Stain in 968 μL PBS. Voeg 1 μL van de bereide oplossing toe aan het objectglaasje en laat het drogen.
  3. Sluit het dekglaasje af op het glaasje met het houdertje om het monster te beschermen en te bewaren. Bewaar het glaasje bij 4 °C in een donkere omgeving.

6. Beeldvorming

  1. Plaats het dekglaasje op de samplehouder en stel het in de live-modus in op het brandpuntsvlak. Selecteer een ROI van 512 x 512 pixels en pas de belichtingstijd en laserintensiteit aan.
  2. Open de onafhankelijke besturingssoftware van de ruimtelijke lichtmodulator en kies het juiste verlichtingspatroonvolgordepad voor pSIM / 3DOM of live-modus.
    OPMERKING: Voor pSIM omvat het verlichtingspatroon drie verschillende polarisatiehoeken en drie verschillende fasen. Voor 3DOM omvat het verlichtingspatroon zes verschillende polarisatiehoeken.
  3. Selecteer de SIM-opnamemodus, selecteer Multi-D Acq., kies Tijdpunten en stel het aantal (9 of 6 afbeeldingen voor pSIM of 3DOM) en interval (0 ms) in het geopende venster in. Klik op Verkrijgen!
  4. Klik op TriggerSLM.bsh (een configuratiebestand is opgenomen in onze coderepository), de MyDaq-acquisitiekaart activeert de ruimtelijke lichtmodulator om de foto's te maken.

7. Live-view plugin van pSIM en 3DOM

  1. Configureer de FakeCamera en het toegangspad voor afbeeldingen: laad de scrip (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) door op Apparaten | Laad Hardware Configuratie.... Configureer de lokale directory van afbeeldingen in Apparaten | Apparaten Eigenschapsbrowser... | Camera-Path-masker (Figuur 2A-C).
    OPMERKING: Het acquisitiegedeelte van het script is afhankelijk van de hardware-instellingen, dus we hebben een versie (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) geleverd met behulp van het FakeCamera-apparaat om lokale afbeeldingen op de harde schijf te lezen voor demonstratie. Gebruikers kunnen wijzigingen aanbrengen in onze versie. Vergeet niet om het leespad van de afbeelding (Camera-Path-masker) te wijzigen.
  2. Stel het paneel Snelle toegang in door op Extra | Paneel voor snelle toegang | Maak een nieuw deelvenster. Klik op het pictogram Instellingen in de linkerbenedenhoek, drug 'Run Script' naar het bovenste gedeelte, dat de 'psim.bsh' en '3DOM.bsh' kan laden (Figuur 2D).
    OPMERKING: Het Quick Access Panel-systeem stelt gebruikers in staat om aangepaste vensters te maken en eenvoudig toegang te krijgen tot de bedieningselementen in Micro-Manager, wat het vaakst nodig is. 'Live', 'Snap' of andere kanalen kunnen ook worden toegevoegd, zoals weergegeven in afbeelding 2D.
  3. Neem pSIM als voorbeeld, voer real-time reconstructie van polarisatiebeelden uit door op 'psim.bsh' te klikken; observeer de real-time gereconstrueerde beelden met polarisatieresultaten (Figuur 2E). Vergeet niet om het pad van de kalibratiebeelden in het bestand 'psim.bsh' te wijzigen (calibPath = " pad naar bestand met kalibratiebeelden").
    OPMERKING: De live-view plugin is een beanshell script (psim.bsh en 3DOM.bsh), dat kan worden uitgevoerd in het Script Panel. De plug-in verkrijgt negen afbeeldingen voor pSIM of zes afbeeldingen voor 3DOM en berekent de resultaten van de oriëntatietoewijzing op basis van de breedveldafbeeldingen. De afbeeldingen van de oriëntatiemapping worden weergegeven om real-time polarisatie-informatie te bieden, wat onmiddellijke inspectie mogelijk maakt, ondanks de lage resolutie.

8. Gegevensanalyse met reconstructie met superresolutie

  1. Installeer MATLAB R2019b vanaf de website (zie de materiaaltabel).
  2. Open de software; voor pSIM-reconstructie verkrijgt u negen afbeeldingen, bestaande uit drie verschillende fasen voor elk van de drie oriëntatiehoeken. Zorg ervoor dat de namen van de negen afbeeldingen '1.tif' tot '9.tif' zijn, plaats ze in het bestand met de naam 'Input' en voer het programma met de naam 'PSIM.m' uit. Bekijk het gereconstrueerde groothoekbeeld, de SIM-afbeelding en het pSIM-beeld met het kleurenwiel.
    OPMERKING: De reconstructie voor pSIM heeft twee stappen nodig: een SIM-stap en een PM-stap. De gegevens worden geanalyseerd door een op maat geschreven MATLAB-programma voor eenvoudigere foutopsporing. Haal de reconstructiecode op uit de map 'reconsr' in GitHub.
  3. Leg voor 3DOM zes verschillende polarisatierichtingen vast. Voeg zes afbeeldingen samen, noem het resulterende bestand 'Raw_data.tif' en voer het programma met de naam 'Recon_3DOM.m' uit. Bekijk het gereconstrueerde groothoekbeeld en het 3DOM-beeld met azimutale resultaten en de polaire hoekresultaten.
    LET OP: Tijdens het reconstructieproces kan er een fout optreden '--'functie of variabele 'bfopen' wordt niet herkend'. 'BFOPEN' is een functie in de bio-formaten bibliotheek en wordt vaak gebruikt voor het openen en lezen van afbeeldingsbestanden. Voer addpath ('path_to_bioformats_toolbox') in het MATLAB-opdrachtvenster in. Vervang 'path_to_bioformats_toolbox' door het werkelijke pad van de bibliotheekmap. We hebben ook de afhankelijkheid van Bio-Formats toegevoegd aan de GitHub-repository.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pSIM-methode kan worden uitgevoerd op SIM-microscopen op basis van de interferentie met behulp van s-gepolariseerde laserstralen. s-polarisatie-interferentie is het meest gebruikte type simkaart en genereert contrastrijke verlichtingsstrepen. Het academische prototype van een microscoopopstelling is opgenomen in het originele werk van pSIM5. Kort geïntroduceerd in figuur 1, genereert een ruimtelijke...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In ons onderzoek hebben we een plug-in ontwikkeld die het mogelijk maakt om in realtime te bekijken van twee polarisatiebeeldvormingstechnieken, pSIM en 3DOM. Beide technologieën kunnen met een kleine aanpassing worden uitgevoerd in een bestaand SIM-systeem. We hebben de gedetailleerde stappen gegeven om de pSIM- en 3DOM-microscoop te installeren en Micro-Manager in te stellen om de microscoop te besturen en te demonstreren hoe de polarisatieresultaten voor live-weergave kunnen worden ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2022YFC3401100).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 nm Fluorescent beadsInvitrogenF8801
4% Formaldehyde solutionInvitrogenR37814
CameraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Denture base materials (Type I Thermally setting type, liquid)New Century DentalN/A
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Inverted MicroscopeNikonTE2000 E
Fetal Bovine SerumGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersion R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersion 4.0Software of Spatial light modulator
Micro-Manager 2.0μΜanagerVersion 2.0Download Micro-Manager Latest Release
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Software and Driver Downloads - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
Phosphate buffered salineCorning21-040-CV
Poly Methyl MethacrylateSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Spatial light modulatorKopinSXGA-12
SYTOX orange nucleic acid stainInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TrypsinGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging to single-molecule 3D orientation and localization microscopy. Optica. 10 (11), 1486-1510 (2023).
  3. Valades Cruz, C. A., et al. Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy. Pro Natl Acad Sci USA. 113 (7), E820-E828 (2016).
  4. Zhanghao, K., et al. Super-resolution dipole orientation mapping via polarization demodulation. Light Sci Appli. 5 (10), e16166(2016).
  5. Zhanghao, K., et al. Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy. Nat Commun. 10 (1), 4694(2019).
  6. Vrabioiu, A. M., Mitchison, T. J. Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy. Nature. 443 (7110), 466-469 (2006).
  7. Backer, A. S., Lee, M. Y., Moerner, W. E. Enhanced DNA imaging using super-resolution microscopy and simultaneous single-molecule orientation measurements. Optica. 3 (6), 659-666 (2016).
  8. Backer, A. S., et al. Single-molecule polarization microscopy of DNA intercalators sheds light on the structure of S-DNA. Sci Adv. 5 (3), eaav1083(2019).
  9. Hulleman, C. N., et al. Simultaneous orientation and 3D localization microscopy with a Vortex point spread function. Nat Commun. 12 (1), 5934(2021).
  10. Kampmann, M., Atkinson, C. E., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Mapping the orientation of nuclear pore proteins in living cells with polarized fluorescence microscopy. Nat Struct Mol Biol. 18 (6), 643-649 (2011).
  11. Lazar, J., Bondar, A., Timr, S., Firestein, S. J. Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function. Nat Methods. 8 (8), 684-690 (2011).
  12. Dong, B., et al. Parallel Three-Dimensional Tracking of Quantum Rods Using Polarization-Sensitive Spectroscopic Photon Localization Microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1747-1752 (2017).
  13. Blanchard, A., et al. Turn-key mapping of cell receptor force orientation and magnitude using a commercial structured illumination microscope. Nat Commun. 12 (1), 4693(2021).
  14. Toprak, E., et al. Defocused orientation and position imaging (DOPI) of myosin V. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (17), 6495-6499 (2006).
  15. Zhong, S., et al. Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution using polarization modulation. PhotoniX. 5 (1), 12(2024).
  16. Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J Vis Exp. (111), e53988(2016).
  17. Huang, X., et al. long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol. 36 (5), 451-459 (2018).
  18. Ando, R., et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nat Methods. 21 (4), 648-656 (2024).
  19. Hirano, M., et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 40 (7), 1132-1142 (2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Polarization MicroscopyPolarized Structured IlluminationSuper Resolution ImagingFluorescent DipolesLive Cell ImagingMicro Manager PluginReal Time Reconstruction3D Orientation MappingPolarization ImagingMATLAB Reconstruction Code
Video Coming Soon

Related Articles