Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een gemodificeerde QuEChERS-HPLC-methode voor de detectie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen in zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan fijnstof

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

13 juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We ontwikkelden een aangepaste QuEChERS-HPLC-methode om de interne niveaus van 16 PAK's in zebravisembryo's te beoordelen.

Samenvatting

Blootstelling van de moeder aan fijnstof (PM2,5), met een aerodynamische diameter van 2,5 μm of minder, is in verband gebracht met spontane abortus en verschillende aangeboren ziekten bij mensen. De onderliggende mechanismen blijven echter onduidelijk. Zebravisembryo's worden veel gebruikt om de ontwikkelingstoxiciteit van PM2.5 te bestuderen, maar het meten van de interne niveaus van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), de primaire toxische bestanddelen van PM2.5, vormt een uitdaging. In deze studie hebben we een snelle, gemakkelijke, goedkope, effectieve, robuuste en veilige high-performance vloeistofchromatografie (QuEChERS-HPLC)-methode ontwikkeld om de interne niveaus te beoordelen van de 16 PAK's die zijn opgenomen in de lijst van prioritaire verontreinigende stoffen van het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA). Zebravisembryo's werden behandeld met extraheerbaar organisch materiaal (EOM) van PM2.5 gedurende 2-72 uur na de bevruchting (hpf). De QuEChERS-methode werd gebruikt voor de voorbereiding van monsters en HPLC-FLD/DAD (HPLC met fluorescentiedetector en diode-arraydetector) werd gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyses van PAK's. We hebben met succes zes PAK's (fenantreen, antraceen, fluoreen, acenafteen, fluoranteen en pyreen) gedetecteerd in zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan PM2.5. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de mechanismen van PM2.5-geïnduceerde ontwikkelingstoxiciteit.

Inleiding

Fijnstof (PM2,5), met een aerodynamische diameter van 2,5 μm of minder. is een belangrijke milieurisicofactor. Door zijn kleine formaat kan PM2.5 het circulatiesysteem binnendringen en de maternale foetale barrière doordringen. Epidemiologische studies hebben blootstelling van de moeder aan PM2.5 in verband gebracht met spontane abortus en verschillende aangeboren ziekten 1,2,3,4. De onderliggende mechanismen van de embryonale toxiciteit van PM2.5 zijn echter niet goed begrepen. PAK's, het primaire toxische bestanddeel van PM2.5, zijn zeer giftig voor mensen vanwege hun mutagene en carcinogene eigenschappen 5,6. Van de honderden PAK's zijn er 16 door het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) aangewezen als verontreinigende stoffen met hoge prioriteit.

Zebravis, Danio rerio, is een krachtig modelorganisme voor gewervelde dieren vanwege zijn genetische gelijkenis met mensen, snelle ontwikkeling, hoge voortplantingssnelheid en onderhoudsgemak. De transparantie van zebravisembryo's maakt directe observatie van het hele lichaam onder een microscoop mogelijk, waardoor gedetailleerde studies mogelijk zijn. Opgeloste PAK's kunnen zebravisembryo's binnendringen door diffusie7. Veel studies hebben zebravisembryo's gebruikt om de toxische effecten en mechanismen van extraheerbare organische stof (EOM) uit PM2.5 8,9,10,11 te onderzoeken. De meeste van deze studies hebben echter alleen de 16 prioritaire PAK's in EOM gekarakteriseerd, zonder de interne niveaus van PAK's in zebravisembryo's te detecteren12. Deze uitdaging kan te wijten zijn aan de kleine omvang van zebravisembryo's en de complexiteit van de embryonale matrix.

De snelle, gemakkelijke, goedkope, effectieve, robuuste en veilige (QuEChERS)-methode is een innovatieve monstervoorbereidingstechniek die wordt gebruikt voor de analyse van residuen van bestrijdingsmiddelen, diergeneesmiddelen en andere verontreinigingen in voedsel- en milieumonsters13,14. In combinatie met high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) is deze methode gebruikt om pesticiden in zebravissente detecteren 15. PAK's, die twee of meer benzeenringen bevatten, hebben sterke fluorescentie-eigenschappen, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor detectie met behulp van fluorescentiedetectoren. In deze studie hebben we een aangepaste QuEChERS-HPLC-methode ontwikkeld om de niveaus van 16 PAK's te beoordelen in zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan EOM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monster behandeling

  1. PM2.5 collectie
    1. Verzamel PM2.5 op kwartsmembraanfilters van 47 mm.
      OPMERKING: PM2.5 werd verzameld in het stedelijke Suzhou, China.
  2. EOM-extractie
    1. Snijd het filter in stukken en plaats het in een conische glazen kolf met 150 ml acetonitril.
    2. Ultrasoonapparaat van de kolf bij 35 °C gedurende 1 uur en breng het extract over in vier buisjes van 50 ml.
    3. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 7.000 × g , breng het bovenstaande vervolgens over naar een roterende verdamper en concentreer het op ongeveer 5 ml.
    4. Damp droog onder stikstofstroom in een waterbad van 35 °C en los het residu op in dimethylsulfoxide (DMSO).
  3. Zebravis embryo behandeling
    1. Houd zebravissen in een recirculerend watersysteem op een lichtcyclus van 14 uur en 10 uur donker bij 28 °C16.
    2. Verzamel bevruchte eieren (200 embryo's per groep) en breng ze over naar glazen petrischaaltjes (natronkalkglas, 80 x 15 mm) met 30 ml water uit het recirculerende watersysteem.
    3. Voeg 30 μL EOM (10 mg/ml) toe aan een glazen petrischaaltje met 200 embryo's 2 uur na de bevruchting (hpf). Onbehandelde groepen dienen als lege controles.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie EOM is 10 mg/L, gebaseerd op de snelheid van cardiale misvormingen (aanvullende figuur S1).
    4. Zet de gerechten in een broedmachine van 28 °C.

2. QuEChERS monster voorbereiding

  1. Haal de schaaltjes met embryo's bij 72 hpf uit de couveuse. Was de embryo's 3x met zuiver water.
  2. Breng de embryo's over in buisjes van 1,5 ml (volgens verschillende groepen) en verwijder overtollig water.
  3. Plaats de buizen gedurende 30 minuten in een vriezer van -80 °C om de embyros17 te lyofiliseren en te vriesdrogen. Maal de embryo's vervolgens met een glazen staaf.
  4. Voeg 25 μl 16 PAK-gemengde standaardoplossing (2,0 μg/ml) toe aan de DMSO-controlegroep om het herstel van de pieken te testen.
  5. Voeg 1 ml n-hexaan en vortex toe gedurende 30 s, en ultrasoonapparaat vervolgens bij 35 °C gedurende 30 min.
  6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7.000 × g en breng het bovenstaande over in een nieuwe buis.
  7. Herhaal stap 2.5 en 2.6.
  8. Verdamp de verzamelde supernatanten tot droogte onder stikstofstroom in een waterbad van 35 °C.
  9. Voeg 1 ml acetonitril toe en vortex gedurende 30 s.
  10. Voeg 10 mg primair secundair amine (PSA), 45 mg magnesiumsulfaat en 15 mg C18-pakking toe en draai vervolgens gedurende 30 s.
  11. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7.000 × g en breng het bovenstaande over in een nieuwe buis.
  12. Herhaal stap 2.9 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7.000 × g . Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje.
  13. Verdamp het bovenstaande tot 0,5 ml onder stikstof.
  14. Filtreer door een microporeus membraan van 0,22 μm.

3. Bepaling van PAK's met behulp van HPLC

  1. Bereid een reeks werkoplossingen (variërend van 1 tot 500 ng/ml) voor de 16 PAK-norm gemengd met acetonitril en injecteer deze in een vloeistofchromatograaf met acetonitril/water als mobiele fase.
    1. Injecteer 20 μL en gebruik de volgende elutieprocedure: 0-18,5 min, 40% acetonitril op 100% acetonitril; 18,5-28 min, 100% acetonitril; 28-29,5 min, 100% tot 40% acetonitril; Stoptijd: 32 min; kolomtemperatuur: 25 °C; debiet: 1,8 ml/min. Teken een standaardcurve met massaconcentraties van de standaard werkoplossingen op de x-as en de overeenkomstige piekgebieden op de y-as, met een bereik van 5 ng/ml tot 500 ng/ml.
      OPMERKING: Excitatie-/emissiegolflengten van PAK's zijn te vinden in aanvullende tabel S1.
  2. Injecteer het gezuiverde monster (vanaf stap 2.14.) in de vloeistofchromatograaf met een fluorescentiedetector (FLD) en diode array-detector (DAD).
  3. Identificeer de aanwezigheid van PAK's door retentietijden te vergelijken en meet de bijbehorende piekgebieden.
    OPMERKING: De massaconcentraties van de PAK's zijn bepaald aan de hand van de eerder gegenereerde standaardcurve uit stap 3.1.1.
  4. Bereken de inwendige concentraties van de 16 PAK's op basis van de gemeten massaconcentraties van de monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De volledige procedure voor EOM-blootstelling, monstervoorbereiding en PAK-detectie wordt geïllustreerd in figuur 1. Voor HPLC-FLU/DAD werd een signaal-ruisverhouding van 3:1, met een detectiebereik van 0,3 tot 5,0 ng/ml, acceptabel geacht. De detectielimieten van de methode varieerden van 3,0 × 10-4 tot 5,0 × 10-3 ng/organisme. Alle kalibratiecurven vertoonden een hoge lineariteit (r2 > 0,999). Precisiewaarden bepaald met be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zebravisembryo's zijn een krachtig model van gewervelde dieren voor studies naar ontwikkelingstoxiciteit, maar hun kleine formaat bemoeilijkt de detectie van semi-vluchtige organische stoffen (SVOC's) zoals PAK's. Tijdens de voorbereiding van het monster is het voorkomen van besmetting van zebravisembryo's cruciaal. Een goede reiniging van monsters is een belangrijke stap om te voorkomen dat verbindingen van het belichtingsmedium naar het monsterextract worden overgedragen. Onvolledig wa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummer: 81972999) en het Suzhou Science and Technology Development Plan (Basic Research on Medical Applications, SKY2023036 and SKY2023115).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16 PAHs mixed standard solutions o2si Smart Solutions (South Carolina, USA)110124-0616 PAHs mixed standard solutions  omvat naftaleen (Nap), acenaftyleen (Acy), ace-nafteen (Ace), fluoreen (Flo), fenantreen (Phe), antraceen (Ant),fluorantheen (Flu), pyroleen (Pyr), benzo [a] antraceen (BaA), chryseen(Chr), benzo [b] fluorantheer (BbF), benzo [k] fluorantheer (BkF),benzo [a] pyroleen (BaP), indeno [1,2,3-cd] pyroleen (IcdP), dibenz [a,h]antraceen (DahA), benzo [g,h,i] peryleen (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, USA)FLD(G1321A);DAD SL (G1315C)
AcetonitrileScharlab (Barcelona,Spanje)AC03661000oplosmiddel
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(Shanghai, CHINA)SBEQ-CA0801C18-vulling is een omgekeerde fase-vulling met een goede balans tussen hydrofiel en hydrofoob, die polaire en niet-polaire organische verbindingen goed kan adsorberen en scheiden.
Diatomaceous earthAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)12214013Voor scheiding, zuivering en verwijdering van organische onzuiverheden‌
Dispersive SPE 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056Steekproefzuivering
FilterANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(Shanghai, CHINA)SCAA-104Organische fase naaldfilter (nylon), 0.22µm
HexaanScharlab (Barcelona,Spanje)HE02481000oplosmiddel
MilliporeMerck (New Jersey, USA)Ultrapuur water bereiden
Organomation - N-EVAP Nitrogen EvaporatorsOrganomation (Massachusetts,USA)Oplosmiddelen verdampen
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, USA)centrifugeren
 Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York,USA)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918Deze kolom wordt vaak gebruikt in HPLC-systemen om nauwkeurige en betrouwbare analyse van PAK's te bereiken.

Referenties

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

PAH-detectiemonstervoorbereidingfluorescentiedetectordiode-array-detectorextraheerbare organische stofontwikkelingstoxiciteit
Een gemodificeerde QuEChERS-HPLC-methode voor de detectie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen in zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan fijnstof
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.