Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Samenvatting

Zebravissen zijn een prominent modelorganisme geworden voor translationeel onderzoek bij de mens, toxiciteitstesten van kleine moleculen en milieuverontreinigende stoffen, ontdekking van therapeutische geneesmiddelen en andere biomedische onderzoekstoepassingen. Het gepresenteerde protocol is bedoeld om een duidelijke leidraad te bieden voor het screenen van geneesmiddelen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium (leeftijd 3-7 dagen na de bevruchting, dpf). Er zijn verschillende methodologieën gepubliceerd die toxiciteitstesten in zebravislarven beschrijven, hoewel er geen gestandaardiseerd protocol is voor onder andere de blootstellingsduur, de snelheid van mediaveranderingen en de morfologie. We hebben experimenteel de ideale leeftijd van de larven bepaald voor het uitvoeren van de experimenten, de plaatgroottes die het beste werken voor die leeftijden, de snelheid van mediaveranderingen die betrouwbare resultaten opleveren en tegelijkertijd de verspilling van de teststof beperken, en een morfologisch scoresysteem dat gemakkelijk kwantificeerbaar is op een statistische manier. Het manuscript beschrijft in detail een protocol voor toxiciteitstesten bij zebravislarven in de leeftijd van 3 tot 7 dpf, met als doel de leemte in het testen op geneesmiddeltoxiciteit aan te pakken en de eerste stap te zetten naar een gestandaardiseerde methode die vergelijkbaar is met de Fish Embryo Acute Toxicity test.

Inleiding

Zebravissen (Danio rerio) zijn onlangs naar voren gekomen als een krachtig modelorganisme voor gewervelde dieren en worden steeds populairder voor studies om biomedisch onderzoek vooruit te helpen¹. Ongeveer 70% van de menselijke eiwitcoderende genen hebben ten minste één zebravisortholoog, waarbij ~82% van de menselijke ziekteverwekkende genen ten minste één ortholoog gen heeft in zebravissen². De genetische behoud, in combinatie met vergelijkbare basisorgaanpatronen en morfologie, maken zebravissen tot een interessant model voor onderzoek naar ziekten bij de mens, waardoor vergelijkingen tussen soorten op moleculair niveau ^1,2,3 mogelijk zijn, wat cruciaal is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Zebravissen ontwikkelen zich snel, waarbij de staartknop 10 uur na de bevruchting (hpf) wordt gevormd en de eerste somieten verschijnen bij 16 hpf. De embryo's komen ~2-3 dagen na de bevruchting (dpf) uit het chorion. Tegen 4 dpf is hun spijsverteringskanaal volledig ontwikkeld en tegen 5 dpf is hun zwemblaas opgeblazen, waardoor ze vrij kunnen rondzwemmen en op voedsel kunnen jagen. Ondanks het vermogen om zich te voeden met 5 dpf, kunnen larven die niet worden gevoed alleen overleven op van dooier afgeleide voedingsstoffen tot ten minste 7 dpf, waardoor de noodzaak van externe voeding wordt omzeild die besmetting kan veroorzaken en de screening van geneesmiddelen, toxicologie en gedragstesten kan verstoren⁴. Tegen 7 dpf ontwikkelen larven ook een compleet lichaamsplan met verschillende rudimentaire orgaansystemen, waaronder het hart en het vaatstelsel, spieren en botten ^5,6. Zebravisembryo's worden ook ex vivo bevrucht, ontwikkelen zich uitwendig en zijn optisch transparant in de vroege levensfasen, waardoor ze zeer toegankelijk zijn voor genbewerking en screening van kleine moleculen³. Bovendien zorgen hun kleine formaat en hoge vruchtbaarheidspercentage voor de opname van meer replicaten, wat de statistische power verhoogt, evenals voor het gebruik van platen met meerdere putjes, wat bespaart op medicijnvolumes en de doorvoer verhoogt.

Screening van nieuwe kleine moleculen in een diermodel is belangrijk om het vermogen van de geneesmiddelen om zowel gunstige als nadelige effecten te produceren te bepalen, waardoor wordt vastgesteld welke verbindingen levensvatbaar zijn voor verder testen en andere die mogelijk moeten worden aangepast om hun activiteit te veranderen. Als onderdeel van het screeningproces van geneesmiddelen moet de letale concentratie 50 (LC₅₀) van de doelstof(fen) worden geïdentificeerd. Dit zorgt voor een werkconcentratie die bij 50% van de proefdieren de dood veroorzaakt als onderdeel van de voorlopige toxiciteitstest.

Er bestaat een gestandaardiseerd protocol voor toxiciteitstesten in zebravisembryo's tot 96 uur na de bevruchting (hpf), namelijk de Fish Embryo Acute Toxicity (FET)-test (TG236)⁷. In de FET-test worden pas bevruchte eieren gedurende maximaal 96 uur blootgesteld aan vijf concentraties van een chemische stof en geobserveerd op tekenen van dodelijkheid, namelijk (i) eistolling, (ii) gebrek aan somietvorming, (iii) gebrek aan loslating van de staartknop van de dooierzak en (iv) gebrek aan hartslag. De test maakt het mogelijk om de acute toxiciteit en de LC₅₀ te bepalen. Verder geeft het ook advies over de afmetingen van de testkamer voor onder meer screening (platen met 24 putjes), de verdeling van de eieren in de testkamer en de huisvestingsomstandigheden, om geldige en reproduceerbare resultaten te garanderen⁷.

Hoewel de FET-test geschikt is voor toxiciteitstesten in het embryonale stadium, gaat deze niet verder dan 4 dpf. Voor fenotypes die zich rond dit tijdstip beginnen te ontwikkelen (bijv. mineralisatie van het notochord⁶), moet de screening van geneesmiddelen verder gaan dan 4 dpf om de morfologische beoordeling van dergelijk weefsel mogelijk te maken. Bovendien raden we aan om de blootstelling aan het geneesmiddel ten minste een dag voor de ontwikkeling van het fenotype van interesse te beginnen. Voor zover wij weten, bestaat er geen gestandaardiseerd protocol vergelijkbaar met de FET voor het screenen van geneesmiddelen bij zebravislarven in een vroeg stadium, met name bij zebravissen van 3 tot 7 dpf. Hoewel er verschillende studies zijn gepubliceerd die het testen van geneesmiddelen beschrijven bij zebravislarven van meer dan 4 dpf, is er een gebrek aan consistentie in de gebruikte methodologie, inclusief de grootte van de testkamers, het aantal biologische en technische replicaten, de snelheid van mediaveranderingen, de blootstellingsduur en de morfologische defecten die zijn beoordeeld 8,9,10,11,12,13 . Om deze reden hebben we een gevalideerd protocol ontwikkeld voor gestandaardiseerde toxiciteitstesten, gevolgd door visuele observatie van morfologische veranderingen in zebravislarven bij 3-7 dpf. Het voorgestelde protocol kan vervolgens worden gebruikt voor andere downstream fenotyperingstesten, zoals gedragsanalyse, genexpressieprofilering en histomorfometrie.

Protocol

Zebravissen werden behandeld volgens de EU-richtlijn 2010/63/EU. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Faculty Research Ethics Committee (FREC) en de Joint FREC Animal Research Sectoral Subcommittee (JFARSS) van de Universiteit van Malta. Een stroomschema van het voorgestelde protocol is te vinden in figuur 1.

1. Eierproductie, verzameling en onderhoud

1. Zet de vissen de dag ervoor in kweekbakken, ten minste een uur na de laatste voeding, met scheidingswanden die de mannetjes en vrouwtjes van elkaar scheiden. Gebruik voor betere resultaten bij de eierproductie een hogere verhouding tussen vrouwtjes en mannetjes. Zet de vissen in een ruimte met een licht-donkercyclus van 14 uur: 10 uur en een omgevingstemperatuur van 27-28 °C.
   OPMERKING: Een kweekbak van 1 liter kan drie volwassen vissen bevatten, terwijl een kweekbak van 1,7 liter vijf volwassen vissen kan bevatten.
2. Vervang de volgende ochtend, na het begin van het licht, het water in de kweekbakken en verwijder de verdelers. Als de kweekbak niet gemakkelijk hellend is, plaats deze dan in een schuine positie om ervoor te zorgen dat er ondiep water beschikbaar is om de paring te bevorderen. In geval van trage eierproductie en paringsactiviteit, ververs dan elke 45 minuten het water in de kweekbakken. Laat de vissen maximaal 3 uur paren of indien nodig.
3. Zodra het paren is voltooid, knijpt u voorzichtig in alle vrouwtjes die geen eieren hebben geproduceerd om langdurige eierbinding te voorkomen. Plaats de vissen terug in hun respectievelijke bakken.
4. Verzamel eventuele eieren in de kweekbakken met behulp van een zeef, spoel af met embryowater (E3) en plaats ze in een petrischaal met E3. Om E3 te bereiden, mengt u 16,67 ml 60x E3 (300 mM NaCl; 10 mM KCl; 20 mM CaCl_{2,2H 2}O; 20 mM MgSO 4,7H₂O) met 1 ml 0,01% methyleenblauw en 982 ml gedeïoniseerd water. Verwijder onbevruchte eieren of puin. Zorg ervoor dat de petrischaaltjes niet overvol zijn, met 50 eieren per petrischaaltje van 100 mm x 15 mm en 120 eieren per petrischaaltje van 150 mm x 15 mm.
5. Bewaar de eieren in een broedmachine die is ingesteld op 28,5 °C en uitgerust is met een dag/nachtcyclus van 14 uur:10 uur. Ververs bij 1 dpf de E3 en verwijder niet-levensvatbare eieren om schimmelgroei te beperken.

2. Voorbereiding van de testplaat

1. Breng bij 3 dpf een gezond ogend, uitgekomen embryo over naar elk putje in een plaat met 96 putjes met behulp van een micropipet van 1.000 μl die is ingesteld op een volume van 100 μl.
   OPMERKING: Niet-uitgekomen embryo's mogen niet worden gebruikt, omdat dit kan leiden tot een variabele opname van de verbinding. Het gebruik van embryo's die er gezond uitzien, beperkt ook vooringenomenheid tijdens het testen. De grootte van de pipetpunt maakt het mogelijk om het zebravisembryo gemakkelijk te verzamelen zonder fysieke schade aan te richten. Bovendien zorgt een micropipet voor een betere controle van het volume dat in de put wordt gedoseerd, in tegenstelling tot een transferpipet.
2. Bereid op een plaat met 12 putjes de gewenste concentratie(s) voor elke teststof in afzonderlijke putjes (hier Bosutinib in een concentratiebereik van 100 μM tot 6,25 μM). Voeg in elk putje met behulp van micropipetten de benodigde hoeveelheid teststof toe en vul aan tot 2,4 ml met E3.
   OPMERKING: Er moet een literatuuronderzoek worden uitgevoerd om de geschikte concentraties te bepalen die voor de relevante teststoffen moeten worden gebruikt. Als er geen informatie beschikbaar is, kunnen verschillende concentraties worden getest totdat een geschikt concentratiebereik is bepaald. Er moeten minimaal vijf concentraties worden gebruikt, waarbij de hoogste concentratie 100% mortaliteit veroorzaakt en de laagste concentratie geen waarneembaar effect veroorzaakt⁷.
3. Bereid een voertuigbesturing voor, afhankelijk van het oplosmiddel dat wordt gebruikt om de standaard teststof op te lossen.
   OPMERKING: Veel teststoffen zijn niet oplosbaar in water en om deze reden moeten ze worden opgelost in specifieke oplosmiddelen ("vehicula") zoals ethanol of dimethylsulfoxide (DMSO) om een waterige oplossing te genereren. DMSO mag bij voorkeur een concentratie van 1% niet overschrijden wanneer deze wordt gebruikt als voertuigbesturing, wat de concentratie is die veilig is bevonden in zebravis¹⁴.
4. Verwijder alle E3-oplossing die aanwezig is in de plaat met 96 putjes met behulp van een micropipet van 200 μl en vervang deze door 100 μl van het overeenkomstige medium dat wordt getest. Zorg ervoor dat u in totaal 24 larven per concentratie test. Gebruik een enkelvoudige of 8-kanaals micropipet van 200 μl om de teststoffen over te brengen naar de overeenkomstige testplaatputjes. Inclusief bedieningselementen (bijv. E3, chemisch voertuig, positieve bedieningselementen, enz.).
   OPMERKING: De plaatopstelling is geschikt voor maximaal vier verschillende testchemicaliën of vier verschillende concentraties van dezelfde chemische stof. Een voorbeeld van de testplaten die zijn opgesteld voor het onderzoek van vijf concentraties van dezelfde chemische stof (bijv. Bosutinib), vergezeld van controles, wordt weergegeven in figuur 1.
5. Voer 24 uur na blootstelling morfologische scores uit (zoals beschreven in sectie 3) en een halfmediumwissel, waarbij 50 μL medium wordt verwijderd en vervangen door vers bereid medium. Verwijder en registreer eventuele dode larven in het proces. Bewaar de larven in een broedmachine die is ingesteld op 28,5 °C en uitgerust is met een dag/nachtcyclus van 14 uur:10 uur. Herhaal het proces tot 7 dpf.

3. Morfologische beoordeling

1. Observeer met een stereolichtmicroscoop de afzonderlijke testlarven met een geschikte vergroting.
   OPMERKING: Voorbeelden van morfologische defecten die kunnen worden beoordeeld, worden gegeven in Tabel 1.
2. Laat de morfologie beoordelen door twee onafhankelijke scorers, waarbij een derde wordt geraadpleegd in geval van onenigheid tussen de twee scorers.
3. Scoor de morfologie met behulp van een binaire methode (d.w.z. aanwezig/afwezig), waarbij 'afwezig' de normale morfologie aangeeft (gescoord als '0') en 'aanwezig' de aanwezigheid van morfologische afwijking aangeeft (gescoord als '1'). Figuur 2 toont voorbeelden van zebravissen met 5 dpf na 2 dagen blootstelling aan het geneesmiddel, waaronder een niet-aangetaste zebravis (Figuur 2A), een zebravis met mild pericardiaal oedeem (Figuur 2B), ernstig pericardiaal oedeem met dooierbloeding en dooierextensie (Figuur 2C), vertraagde ontwikkeling met verminderde pigmentatie, zwemblaas en totale lengte (Figuur 2D), gezwollen dooier en een geknikte staartvin (Figuur 2E), afwezige staartvin (Figuur 2F), gebogen notochord (Figuur 2G), afkapping (Figuur 2H) en dood met necrose (Figuur 2I). Scoor alle afwijkende fenotypes als '1' en de onaangetaste zebravissen als '0'.

4. Bepaling van LC₅₀

1. Zet na morfologische beoordeling het cumulatieve sterftepercentage uit op 7 dpf ten opzichte van de concentratie. Een voorbeeld wordt getoond in figuur 3. Gebruik de concentratiecurve om de concentratie te schatten die 50% sterfte veroorzaakt.
2. Zodra de LC_{50-concentratie} is geschat, herhaalt u het hierboven beschreven experiment door 24 replicaatlarven in een plaat met 96 putjes bloot te stellen aan deze enkele geschatte LC_{50-concentratie} .

5. Technische replica's

1. Herhaal de hele procedure met de geselecteerde vijf concentraties van dezelfde chemische stof nog minstens twee keer en twee keer om er zeker van te zijn dat de resultaten reproduceerbaar zijn.

Resultaten

De afwijkingen kunnen afzonderlijk of cumulatief worden bekeken over de experimentele tijdlijn tot 7 dpf. De maximale morfologiescore per afwijking kan worden gebruikt om morfologische afwijkingen te berekenen als percentage van het aantal gebruikte larven. Als bijvoorbeeld op dag 7 de pericardiale oedeemmorfologiescores 19 en 20 zijn voor respectievelijk scorers 1 en 2, op een mogelijke score van 24, wat betekent dat 19 of 20 larven van de 24 pericardiaal oedeem vertonen, kan de percentagescore worden berekend als:

Aanvullende tabel S1 toont de morfologische scoreresultaten (van beide scorers) op 4 dpf na toxiciteitstesten voor de verbinding Bosutinib, een tyrosinekinaseremmer die geïndiceerd is voor de behandeling van chronische myeloïde leukemie¹⁵. Dezelfde morfologiescore wordt herhaald voor blootgestelde vissen van 5 dpf tot 7 dpf. De verbinding werd getest met een concentratiebereik van 100 μM tot 6,25 μM. Drie technische replicaten werden op verschillende tijdstippen uitgevoerd en het gemiddelde cumulatieve sterftecijfer van 7 dpf werd gebruikt om LC₅₀ te bepalen, de concentratie waarbij 50% van de larven overleeft. De LC₅₀ kan op elk belichtingstijdstip worden bepaald. We raden echter aan om dit op 7 dpf te berekenen.

De cumulatieve gemiddelde mortaliteit van 7 dpf werd gebruikt om een LC_50-curve te genereren, die te zien is in figuur 3. Voor Bosutinib werd de LC_{50-concentratie} geschat op 37,95 μM.

OPMERKING: Deze geschatte LC_{50-concentratie} is strikt van toepassing op dit modelsysteem en kan vervolgens worden gebruikt voor verdere downstream fenotyperingstests.

Figuur 1: Schema van de voorgestelde screening van geneesmiddelen in larven bij 3-7 dpf. De testplaten met 96 putjes zijn opgesteld voor het onderzoek van vijf concentraties variërend van 100 μM tot 6,25 μM voor de verbinding Bosutinib. Afkorting: dpf = dagen na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve morfologische defecten waargenomen bij zebravislarven bij 5 dpf blootgesteld aan verschillende chemische concentraties (2 dagen na blootstelling). (A) Controle (onaangetaste) zebravis, (B) Zebravislarve met licht pericardiaal oedeem, (C) Zebravis met ernstig pericardiaal oedeem en dooierbloeding, (D) Zebravis met ontwikkelingsachterstand, verminderde pigmentatie, kleine zwemblaas, (E) Zebravis met gezwollen dooier en een geknikte staartvin, (F) Zebravis zonder staartvin, (G) Zebravis met gebogen notochord, (H) Zebravis met afgeknotte staart, en (I) Dode zebravis met necrose. Gebreken worden aangegeven met rode pijlpunten. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: LC_50-curve die de concentratie ten opzichte van % sterfte weergeeft. De vijf geteste concentraties waren 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM en 6,25 μM, waarbij het sterftepercentage respectievelijk 100%, 100%, 29,2%, 12,5% en 12,5% was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Morfologische defecten	Beschrijving
Pericardiaal oedeem	Vochtophoping rond het hart met een uitgerekt hart en slecht functionerende bloedcirculatie
Hartslag (per minuut)	Verminderd aantal slagen per minuut
Dooier	Aan- of afwezigheid van dooeroedeem of bloeding die gelijktijdig met hartafwijkingen kan optreden
Dooier extensie	Dooier die gezwollen, dun of afwezig is
Gebogen notochord	Aanwezigheid van een geknikt of golvend notochord en/of gebogen staart
Zwemblaas	Aanwezigheid, afwezigheid of gedeeltelijke ontwikkeling van de zwemblaas
Pigmentatie	Minder of geen melanocyten in vergelijking met de onbehandelde vissen van dezelfde leeftijd
Necrose	Aanwezigheid (mild of ernstig) of afwezigheid van necrose in enig deel van het lichaam
Vertraagde ontwikkeling	Vertraagde ontwikkeling of vastgelopen in vergelijking met wildtype controles van dezelfde leeftijd.
Reactie op aanraking	Vertraagde of geen reactie na een schrik (bijv. met behulp van een pipetpunt)
Truncatie	Afwezigheid van het achterste lichaam van de zebravis (d.w.z. vorming van de staart)
Vinnen	Aan- of afwezigheid van de staartvin die gepaard kan gaan met dunne dooierextensie
Verminderde lichaamsas	Vissen die er normaal uitzien, maar gemeten korter zijn in lengte

Tabel 1: Een lijst van visuele morfologische defecten die kunnen worden waargenomen na onderzoek naar blootstelling aan geneesmiddelen.

Aanvullende tabel S1: Representatieve morfologische resultaten voor Bosutinib bij 4 dpf (1 dag na blootstelling). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Zebravissen zijn een belangrijk model geworden voor het screenen van medicijnen. Bij het bepalen van een methodologie voor het uitvoeren van toxiciteitstests, vonden we verschillende contrasterende methoden uit verschillende laboratoria 8,9,10,11,12,13. De beschreven methoden maken gebruik van larven van verschillende leeftijden, variabele experimentele tijdlijnen, verschillende snelheden van mediumveranderingen en verschillende morfologische scoresystemen. Met vallen en opstaan hebben we de beschreven methodologie vastgesteld, die betrouwbare en reproduceerbare resultaten heeft opgeleverd.

Een plaatformaat kiezen
In eerste instantie werden experimenten uitgevoerd in een plaat met 24 putjes om ervoor te zorgen dat de larven voldoende ruimte hadden om te bewegen en te groeien. De platen waren gerangschikt met 10 larven per putje, twee putjes per concentratie en 1 ml medicijnoplossing per putje. Deze opstelling leverde geen reproduceerbare resultaten op, wat leidde tot de conclusie dat de larven niet dezelfde hoeveelheden geneesmiddel uit de put absorbeerden. Vervolgens werden proeven uitgevoerd met een plaat met 96 putjes en 48 putjes met één larve per putje, waaruit bleek dat larven in platen met 96 putjes geen groeiproblemen vertoonden. Daarom werden de experimenten voortgezet in een plaat met 96 putjes, waarbij minder ruimte en medicijnvolumes werden gebruikt.

Dagelijkse mediumverandering
Omdat zebravissen het medicijn uit het medium absorberen, hebben we vastgesteld dat een zekere mate van mediumverandering nodig is om een consistente concentratie van het medicijn in het medium te behouden. Bovendien verwijdert een mediumverandering potentieel afvalmateriaal dat zich in de put heeft opgehoopt, wat een toxische omgeving kan opleveren en tot vertekende resultaten kan leiden. Er werd een proef uitgevoerd met Bosutinib, waarbij drie platen werden opgesteld voor hetzelfde medicijn, één zonder een dagelijkse mediumverandering, één met een dagelijkse halve mediumverandering en één met een volledige dagelijkse mediumverandering. Terwijl de plaat zonder mediumverandering verhoogde sterftecijfers vertoonde, resulteerden de platen met halve en volledige mediumveranderingen in hetzelfde resultaat met 7 dpf. Zo werd gekozen voor een dagelijkse halve mediumverandering. Deze keuze zorgt voor minder verbruik van het dure en beperkte testmateriaal, wat nodig zou kunnen zijn voor verdere downstream-experimenten.

Duur van de belichting
De leeftijd van de gebruikte testlarven en de duur van de blootstelling aan geneesmiddelen die in dit protocol zijn geselecteerd, werd bepaald door ons fenotype dat interesseert voor botmineralisatie. Aangezien de botvorming begint bij ~4 dpf, hebben we ervoor gekozen om te beginnen met zebravissen bij 3 dpf om te bepalen of teststoffen het begin van de botontwikkeling beïnvloeden. Vervolgens hebben we de studies naar de blootstelling aan geneesmiddelen beëindigd op 7 dpf, omdat een hoge mortaliteit werd waargenomen vanaf 8 dpf gezien het gebrek aan voeding dat de resultaten zou kunnen vertekenen. Desalniettemin kunnen tijdschema's worden aangepast, afhankelijk van de aard van het onderzoek en het fenotype van interesse.

Beperkingen
Deze methodologie heeft enkele beperkingen. Het overbrengen van 3 dpf zebravissen naar testplaten met meerdere putjes is tijdrovend. Het verwijderen van het medium uit de putten zonder de larven op te pakken is even arbeidsintensief. Het medium moet langzaam uit elk putje worden verwijderd met behulp van een eenkanaalspipet, zodat de larven tijdens het proces niet worden beschadigd. Bovendien is het testmiddel weliswaar met een dagelijkse halve mediumwissel aan het einde van de test en zorgt het voor de verwijdering van afvalmateriaal uit de put, maar dit garandeert niet dat gedurende de 5 dagen van blootstelling een stabiele geneesmiddelconcentratie in de put kan worden gehandhaafd. Hoewel high-performance vloeistofchromatografie-analyse meer inzicht zou kunnen geven in de werkelijke hoeveelheid geneesmiddel die door elke larve wordt geabsorbeerd, zou de test niet langer kwalificeren als een high-throughput screeningmethode.

Concluderend is deze methodologie bedoeld om de kloof in toxiciteitstesten met zebravissen boven 4 dpf aan te pakken, en stappen te zetten in de richting van een gestandaardiseerd protocol dat van toepassing is op wildtype, mutante en transgene zebravislijnen, en dat vergelijkbaar is met de FET in het embryonale stadium. Dit opent mogelijkheden voor andere downstream fenotyperingstesten die in eerdere stadia misschien niet mogelijk zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tube	Starlab	E1415-1510
10 µL micropipette (P10)	Gilson	F144802
10/20 µL pipette tips	Starlab	S1110-3810
1000 µL micropipette (P1000)	Gilson	F123602
1000 µL pipette tips	Starlab	S1111-6001
12-well plate	Starlab	CC7672-7512	Steriele, individueel verpakt, niet-behandeld, met deksel
20 µL micropipette (P20)	Gilson	F123600
200 µL micropipette (P200)	Gilson	F123601
200 µL multi-channel pipette	Gilson	F81024
200 µL pipette tips	Starlab	S1113-1006
96-well plate	Starlab	CC7672-7596	Steriele, individueel verpakt, met platte bodem, niet-behandeld, met deksel
Foktanks met binnenkant rooster schuine bodem, tankverdelers en deksels	Tecniplast	ZB17BTISLOP, ZB17BTE,  ZB17BTL, ZB17BTD	Schuine binnentank
Gaasfilter	/	/
Nitrilhandschoenen	Mercator	/	/
Petrischaal	Starlab	CC7672-3394/CC7672-3359	100 x 20 mm of 60 x 15 mm
Leica M205 FCA Fluorescerende stereomicroscoop	Leica	10450826
Peltier-gekoelde incubator inclusief 2 planken met lichtmodule koud wit	Memmert	IPP110ecoplus, T8	Uitgerust met dag/nachtcyclus
Dimethyl Sulfoxide	Biochem Chemopharma	504341000	Om een 1% oplossing in E3 te bereiden
Calciumchloride dihydraat	Biochem Chemopharma	303080500	Om E3 te bereiden
Magnesiumsulfaat heptahydraat	Biochem Chemopharma	313060500	Om E3 te bereiden
Kaliumchloride	Biochem Chemopharma	316030500	Om E3 te bereiden
SCREEN-WELL Wnt Pathway bibliotheek (Bosutinib)	Enzo	BML-2838-0500
Natriumchloride	Fisher Scientific	S/3161/53	Om E3 te bereiden