Method Article

High-throughput methode voor het observeren van motiliteitsfenotypes in Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het identificeren van genetische factoren die betrokken zijn bij verschillende soorten motiliteiten in Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Motiliteitsgedrag speelt vaak een belangrijke rol in het vermogen van een bacterie om de beschikbare hulpbronnen in zijn omgeving te exploiteren. Dit geldt met name voor de veelzijdige ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa, die verschillende soorten beweeglijkheden kan vertonen, waaronder zwermen en spiertrekkingen, wat belangrijke pathogene eigenschappen zijn die bijdragen aan oppervlaktekolonisatie, biofilmvorming en het ontwijken van de afweer van de gastheer. Dit manuscript presenteert een high-throughput motiliteitsprotocol om het motiliteitsgedrag van P. aeruginosa te bestuderen. Het protocol maakt het mogelijk om meerdere stammen van P. aeruginosa uit een genoombrede mutantenbibliotheek gelijktijdig te testen, bijvoorbeeld om de genetische factoren die betrokken zijn bij de beweeglijkheid ervan te identificeren en te analyseren. De aanpak biedt de mogelijkheid om de motiliteit op een alomvattende manier te bestuderen en inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de motiliteit van P. aeruginosa . Het hier beschreven protocol kan ook worden aangepast om plaats te bieden aan verschillende soorten motiliteitstesten en andere bacteriesoorten, en biedt zo een krachtig platform voor het bevorderen van het begrip van bacterieel gedrag in verschillende contexten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa is een opportunistische ziekteverwekker die verschillende omgevingen kan koloniseren vanwege zijn opmerkelijke metabolische veelzijdigheid 1,2. Deze veelzijdigheid is cruciaal voor de overgang van een planktonische groeiwijze naar biofilms, wat bijdraagt aan het vermogen om te gedijen in een breed scala van niches, variërend van water tot het menselijk lichaam 3,4,5. De overgang tussen deze groeiwijzen wordt geholpen door een uitgebreid vermogen om door deze omgevingen te bewegen met behulp van verschillende soorten beweeglijkheid, waaronder zwemmen, zwermen en spiertrekkingen 1,6. Elk type beweeglijkheid wordt gemedieerd door verschillende mechanismen en cellulaire structuren en stelt P. aeruginosa in staat om te reageren op omgevingssignalen 7,8. De beweeglijkheid van het zwemmen wordt aangedreven door een enkel polair flagellum en wordt gebruikt om door vloeibare media naar voedingsstoffen te bewegen, bijvoorbeeld9. Zwermmotiliteit is een gecoördineerde beweging die wordt vergemakkelijkt door de productie van flagellen en biosurfactanten en stelt kolonies in staat zich te verspreiden over halfvaste oppervlakken10,11. Ten slotte is de spiertrekkingen onafhankelijk van flagellen. In plaats daarvan wordt spiertrekkingen gemedieerd door type IV pili (T4P) en gebruikt om over oppervlakken te bewegen12,13. Spiertrekkingen dragen ook bij aan de vroege stappen van de biofilmvorming van P. aeruginosa door een eerste hechting aan het oppervlak te bieden. Na de eerste hechting kunnen bacteriën door spiertrekkingen over oppervlakken bewegen en microkolonies creëren, die zich vervolgens kunnen ontwikkelen tot volwassen biofilms 1,4,13.

Traditioneel worden bacteriële motiliteitstesten individueel, één stam per keer, uitgevoerd op een zachte agarplaat of met behulp van microscopiemethoden 6,14,15. Halfvaste media worden al vele jaren gebruikt bij de studie van de bacteriële motiliteit. Tegenwoordig worden deze technieken nog steeds gebruikt om motiliteitsfenotypes in bacteriën te identificeren. Traditioneel wordt bijvoorbeeld de zwermmotiliteit waargenomen door 2,5 μL van een P. aeruginosa-cultuur te inoculeren in het midden van een petrischaal die M9-media bevat met 0,5%-0,8% agarconcentratie16. Spiertrekkingen worden meestal gemeten door te kijken naar de verspreiding van de bacteriën op het grensvlak tussen agar (bij 1%) en de basis van een petrischaaltje nadat een steek P. aeruginosa via de kweekmedia heeft inoculeerd. Een grote halo van interstitiële kolonie-expansie wordt verkregen na 48 uur incubatie, terwijl niet-twitchende stammen niet een dergelijke zone van kolonie-expansie produceren 1,17,18.

Meer recentelijk hebben transposon-mutagenesebenaderingen nieuwe genen ontdekt die betrokken zijn bij de motiliteit of biofilmvorming in P. aeruginosa 19,20,21. Nieuwe genen die betrokken zijn bij de spiertrekkingen werden bijvoorbeeld gevonden met behulp van een transposon-mutantenbibliotheek met hoge dichtheid in P. aeruginosa19. Een ander nuttig hulpmiddel in functionele genomica is het gebruik van geordende mutantencollecties22,23. De Keio-collectie24, die deleties van één gen bevat voor alle niet-essentiële genen in Escherichia coli, is waarschijnlijk de bekendste verzameling mutanten en is gebruikt om genen te definiëren die verschillende fenotypes beïnvloeden, van de groei in verschillende media25 tot celmorfologie26 en meer. Dergelijke collecties zijn ook beschikbaar voor Salmonella enterica serovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29 en vele andere soorten. Deze collecties zijn ook zeer geschikt om de motiliteit op een genoombrede manier te bestuderen, wat leidt tot de ontwikkeling van een high-throughput-methode om de motiliteit van P. aeruginosa te bestuderen. Hier is de methode getest door de bijdrage van mutanten van P. aeruginosa aan zowel de spiertrekkingen als de zwermmotiliteit op platen met een hoge dichtheid te evalueren. Deze high-throughput-methode kan worden gebruikt voor verschillende motiliteitsfenotypes en is ook geschikt voor het bestuderen van de beweeglijkheid van andere bacteriën.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De algemene workflow van deze procedure wordt beschreven in Figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimentele workflow. (1) Bereid de benodigde hoeveelheid motiliteitsmedia voor op basis van het type motiliteit dat van belang is in de experimenten. (2) Bereid met behulp van een handmatig of geautomatiseerd replicatorsysteem de bronvoorraadplaten voor de P. aeruginosa transposon insertie mutantbibliotheek van de mutantcollectie voor met de juiste dichtheid, met de nadruk op precisie en uniforme inoculatie in alle putjes van de platen. (3) Breng monsters over van de bronplaten van de mutantencollectie naar de motiliteitsplaten. (4) Observeer en analyseer na de incubatie motiliteitsfenotypes en identificeer de genen die betrokken zijn bij de motiliteit van belang met behulp van afbeeldingen van hoge kwaliteit. (5) Voer traditionele motiliteitstesten uit om de treffers te valideren die zijn geïdentificeerd door middel van motiliteitsexperimenten met hoge doorvoer. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zwerm platen - M9 mediaTrilplaten - LB mediaBron platen - LB media
200 ml van een 5x M9 zoutoplossing10 g NaCl10 g NaCl
10 ml 20% glucose10 g Trypton10 g Trypton
25 ml casaminozuren5 g Gist Extract5 g Gist Extract
1 ml 1M MgSO410 g Agar15 g Agar
500 ml 1% agarVoeg dH2O toe aan 1LVoeg dH2O toe aan 1L
Voeg dH2O toe aan 1LGentamicine (eindconcentratie 15 μg/ml)

Tabel 1: Mediasamenstelling voor de verschillende platen die in de test worden gebruikt.

1. Bereiding van platen met kweekmedium

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor het bereiden van voorraadoplossingen en opslagomstandigheden. Platen moeten op een vlakke ondergrond worden gevuld. Bij het drogen moeten de platen plat op het oppervlak liggen (d.w.z. niet gestapeld). Dit zorgt ervoor dat het kweekmedium in de plaat gelijkmatig droogt. Alle uniwell-platen met een typische voetafdruk kunnen werken, maar platen met grotere interne afmetingen (zonder binnenwanden), zoals de Singer Instruments Plus-platen of VWR niet-behandelde weefselkweekplaten met één putje, vergemakkelijken het werken met een hogere dichtheid van kolonies per plaat.

  1. Bereid een geschikte hoeveelheid media voor de experimenten voor volgens het recept in tabel 1. Houd de media op ~45 °C- 50 °C om te voorkomen dat de agar stolt.
    1. Bereid voor bronplaten 59 LB (lysogeniebouillon) platen voor met 1,5% agar en 15 μg/ml gentamycine, die nodig is om de volledige PA14-bibliotheek te repliceren - 59 x 25 ml =~ 1500 ml. Bereid nog eens 15 platen LB 1,5% agar en 15 μg/ml gentamycine voor om de bibliotheek op te schalen in een formaat met een dichtheid van 384 - 15 x 25 ml = ~400 ml.
    2. Trillende platen: Als u in een formaat met een dichtheid van 96 werkt, bereid dan 59 spiertrekkingen voor (LB 1% agar). Bereid 15 spiertrekkingen voor als u in een formaat met een dichtheid van 384 werkt.
    3. Zwermplaten: Bereid 15 (384-dichtheidsformaat) of 59 (96-dichtheidsformaat) zwermplaten (M9-glucose 0.5% agar)
  2. Haal het deksel van een bord en giet 25 ml media per bord. Verdeel de media gelijkmatig over de plaat door elke hoek van de plaat voorzichtig één voor één op te tillen. Herhaal deze wiebelbeweging 2x-3x. Plaats het deksel terug op het bord.
  3. Laat de platen een nacht stollen en drogen bij kamertemperatuur (RT). Als de platen niet onmiddellijk worden gebruikt, doe ze dan in hermetische zakken en bewaar ze op een droge plaats. Ze zijn 3 weken houdbaar.

2. Voorbereiding van de bronplaten van de P. aeruginosa transposon mutantenbibliotheek

OPMERKING: Bronplaten verwijzen naar LBA-gentamycineplaten die een kopie van de PA14-bibliotheek bevatten die later worden gebruikt om de motiliteitsplaten te inoculeren. De P. aeruginosa transposon mutant library (PA14 library) is een set van 59 bevroren platen met 96 putjes29. Stappen om bronplaten voor elk formaat voor te bereiden worden hieronder beschreven. Dit protocol is aanpasbaar voor laboratoria die geen toegang hebben tot de Rotor+ replicator. Onderzoekers kunnen met succes dezelfde experimentele procedures uitvoeren met behulp van handmatige replicators, zoals de veerbelaste 96-pins replicators die hier worden gebruikt voor de replicatie van de bevroren platen van de PA14-bibliotheek tijdens dag 1 (zie de materiaaltabel) of andere 96-pins replicators. Handmatige replicators moeten worden gesteriliseerd en tussen elk gebruik worden afgekoeld.

  1. Dag 1: Replicatie van de PA14-bibliotheek van de 59 bevroren platen met 96 putjes op bronplaten
    1. Steriliseer een veerbelaste 96-pins replicator door deze 8 minuten op een kookplaat op maximale temperatuur te plaatsen. Laat de replicator na sterilisatie voldoende afkoelen (~10 min) om te voorkomen dat bacteriën worden gedood.
    2. Pak één bronplaat. Gebruik de steriele 96-pins replicator om de replicatorpennen voorzichtig in een plaat met 96 putjes te dompelen en breng de cellen vervolgens rechtstreeks over op het oppervlak van de bronplaat. Herhaal dit totdat alle 59 bevroren platen met 96 putjes van de PA14-bibliotheek zijn gerepliceerd op bronplaten.
    3. Incubeer de bronplaten met een dichtheid van 96 gedurende 16-18 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Als de methode wordt gebruikt met een formaat met een dichtheid van 96, kunnen deze bronplaten worden gebruikt om de motiliteitsplaten te inoculeren.
  2. Dag 2: Opschaling van 96-dichtheidsformaat naar 384-dichtheidsformaat
    OPMERKING: Dag 2 kan worden overgeslagen als u met een dichtheid van 96 werkt.
    1. Laat de platen na de incubatie (plat op een oppervlak, niet gestapeld) bij kamertemperatuur (~1 uur) afkoelen. Als er condens op de deksels zit, verwijder dan de condensatie met een delicate veeg om te voorkomen dat waterdruppels op de platen vallen, wat kruisbesmetting tussen kolonies kan veroorzaken.
    2. Configureer de replicator met de volgende parameters om een nauwkeurige kolonieoverdracht te garanderen. Zet de replicator AAN . Selecteer in de sectie Selecteer een bedieningsmodus de optie Opgeslagen programma's selecteren en uitvoeren.
    3. Selecteer in de sectie Bronplaten selecteren de optie PlusPlate 96 Agar. Selecteer in de sectie Selecteer doelplaten de optie PlusPlate 384 Agar. Selecteer in de sectie Pads selecteren de optie Short Pin 96.
    4. Selecteer in de sectie Programma-opties repliceren de optie Algemeen en klik op Recyclen > Geen.
    5. Selecteer in het gedeelte Bron de optie Verschuiving en klik op Willekeurige > Standaardstraal. Selecteer in de sectie Doel de optie Vastzetten en stel de druk in op 20%. Laat alle andere instellingen als standaard staan.
    6. Plaats de Short Pin RePads 96 in het daarvoor bestemde vak.
    7. Plaats de bron- en doelplaten op het daarvoor bestemde platform van de replicator. Plaats de bronplaten met een dichtheid van 96 (platen 1, 2, 3 en 4) en de nieuwe lege bronplaat (LBA-platen) op het platform. Met behulp van de geselecteerde parameters zal de microbiële array-pinning-robot kolonies overbrengen van de platen met 96 dichtheid naar de nieuwe plaat met 384 dichtheid. Druk op Uitvoeren.
    8. Verander alle platen op het platform (de volgende vier bronplaten met een dichtheid van 96 en een nieuwe lege bronplaat) en herhaal dit totdat alle platen zijn opgeschaald. Gebruik voor de laatste set platen plaat 57, 58, 59 en 1. Elke plaat met een dichtheid van 384 zal bestaan uit afwisselende kolonies van vier platen met een dichtheid van 96 (zie figuur 2). Incubeer de LBA-platen met een dichtheid van 384 bij 37 °C gedurende 16-18 uur.
      OPMERKING: Deze bronplaten met een dichtheid van 384 kunnen vervolgens worden gebruikt om de motiliteitsplaat te inoculeren om het protocol uit te voeren met een dichtheid van 384. In elke stap na de incubatie kunnen de platen maximaal 3 weken bij 4 °C worden bewaard.

figure-protocol-2
Figuur 2: Opschaling van platen met een dichtheid van 96 naar platen met een dichtheid van 384. Kolonies van vier bronplaten met een dichtheid van 96 worden overgebracht en samengevoegd tot een enkele plaat met een dichtheid van 384. Elk kwadrant van de plaat met een dichtheid van 384 komt overeen met een van de oorspronkelijke platen met 96 putjes (rood, blauw, geel en groen), waardoor de positie van elke mutant behouden blijft. Gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Experiment met motiliteit met hoge doorvoer

OPMERKING: Het protocol is hier uitgevoerd in een 384-dichtheidsformaat, maar hetzelfde protocol kan worden aangepast aan een 96-dichtheidsformaat door de parameters op de replicator te wijzigen om van bronplaten naar motiliteitsplaten over te brengen met behulp van de 96-selectie in plaats van 384.

  1. Laat de platen na de incubatie (plat op een oppervlak, niet gestapeld) bij kamertemperatuur (~1 uur) afkoelen. Als er condensatie op de deksels optreedt, verwijder deze dan met een delicate veeg om te voorkomen dat waterdruppels op de platen vallen, wat kruisbesmetting tussen kolonies kan veroorzaken.
  2. Pak het juiste aantal platen (59 voor een formaat met een dichtheid van 96 of 15 voor een formaat met een dichtheid van 384) voor de gewenste test: M9-glucose 0.5% agarplaten om te zwermen, LB en 1% agarplaten om te trillen.
  3. Configureer de replicator met de volgende parameters om een nauwkeurige kolonieoverdracht te garanderen.
    1. Zet de replicator AAN . Selecteer in de sectie Selecteer een bedieningsmodus de optie Opgeslagen programma's selecteren en uitvoeren. Selecteer in de sectie Selecteer bronplaten PlusPlate 384 Agar.
    2. Selecteer in de sectie Selecteer doelplaten de optie PlusPlate 384 Agar. Selecteer in de sectie Pads selecteren de optie Short Pin 384. Selecteer in de sectie Programma-opties repliceren de optie Algemeen > Recyclen > Geen.
    3. Selecteer in Singer-programma's de optie Veel repliceren.
    4. Selecteer in de sectie Bron de optie Verschuiving > Willekeurige > Standaardradius. Selecteer in de sectie Doel de optie Vastzetten en stel de druk in op 2%. Laat alle andere instellingen als standaard staan.
  4. Plaats de Short Pin RePads 384 in het daarvoor bestemde vak.
  5. Plaats de bron- en doelplaten op het daarvoor bestemde platform van de replicator. Plaats de bronplaten met een dichtheid van 384 en de lege motiliteitsplaten op het platform. Druk op Uitvoeren Met behulp van de geselecteerde parameters zal de microbiële array-pinning-robot kolonies overbrengen van de bronplaten met een dichtheid van 384 naar de motiliteitsplaten. Elke plaat met een dichtheid van 384 zal bestaan uit een kopie van een bronplaat met een dichtheid van 384.
  6. Zorg ervoor dat de overdracht gelijkmatig is en dat alle kolonies op de juiste manier op het agaroppervlak van de motiliteitsplaten zijn vastgemaakt. Doe de geënte motiliteitsplaten in plastic zakken. Plaats de zakken met de platen voorzichtig in een broedmachine die gedurende 18 uur op 37 °C is ingesteld.
    OPMERKING: De platen worden in zakken geplaatst om de luchtvochtigheid op peil te houden en ongelijkmatige droging te voorkomen. Plaats de platen in de broedmachine met de deksels naar boven.
  7. Controleer na incubatie de motiliteitsplaten op gelijkmatige koloniegroei en afwezigheid van besmetting.
  8. Dag 3: Beeldvorming motiliteitsplaten
    OPMERKING: De Singer Instruments PhenoBooth wordt gebruikt om beelden met een hoge resolutie van de motiliteitsplaten vast te leggen. Het maakt gebruik van een camera van wetenschappelijke kwaliteit en produceert beelden van 23 megapixels. Het bevat vijf verlichtingskanalen om beelden met hoge resolutie van kolonies vast te leggen uit petrischalen en rechthoekige platen. Andere hoogwaardige imagers werken ook.
    1. Na de incubatietijd zijn de motiliteitsplaten klaar voor het beeldvormingsproces. Zet de Phenobooth AAN en klik op het pictogram dat overeenkomt met de Phenobooth-software.
    2. Er wordt een pagina Project selecteren geopend. klik op Nieuw project > Colony Counting. Kies het gewenste bestandspad om de afbeeldingen op te slaan in het veld Locatie. Kies in het veld Resolutie de optie 5626 x 4220. Klik op OK, het apparaat is nu klaar om foto's te maken.
    3. Plaats de plaat in de lezer met de middelste kant naar boven nadat u het deksel hebt verwijderd. Zorg ervoor dat de plaat goed is geplaatst voordat u de lezer sluit om te voorkomen dat de plaat vastloopt.
    4. Stel de parameter in op wit licht op het tabblad Verlichting. Klik op Voorbeeld. Pas de belichtingsinstellingen aan op het tabblad PhenoBooth-instellingen om de optimale parameters te verkrijgen voor het observeren van motiliteitsfenotypes.
    5. Klik op Verkrijgen; De vastgelegde afbeeldingen verschijnen aan de linkerkant van het scherm. Als u klaar bent, sluit u de software (alle vastgelegde afbeeldingen worden opgeslagen in het eerder gekozen bestand op het tabblad Locatie).
      OPMERKING: Phenobooth slaat afbeeldingen op in JPEG-indeling, maar voor de downstream-analysestappen kunnen afbeeldingen in TIFF-, JPEG- of PNG-indeling zijn.

4. Analyse van motiliteitsfenotypes

OPMERKING: Beeldanalyse wordt uitgevoerd zoals in detail beschreven door French et al.30,31. Een script om gegevensanalyse uit te voeren is beschikbaar vanaf31 (ImageJ Macro).

  1. Kort gezegd worden afbeeldingen verwerkt in ImageJ32, die een waarde genereert voor elk volk op de motiliteitsplaat. Converteer eerst afbeeldingen naar een 8-bits formaat en segmenteer de kolonies en de bijbehorende beweeglijkheidsgebieden vanaf de achtergrond met behulp van de drempelopdracht. Teken een Region of Interest (ROI) rond elke kolonie en meet het beweeglijkheidsgebied. Dit genereert een tabel met een geïntegreerde dichtheidswaarde voor elke put, geordend in rijen. Deze tabel kan worden opgeslagen als een CSV-bestand voor verdere analyse.
    1. Voer de macro uit in ImageJ en open de map met de afbeeldingen.
    2. Pas desgevraagd de rotatie van de plaat aan door de hoek van de plaat te wijzigen met behulp van de optie Voorbeeld, zodat de plaat recht is. Als u tevreden bent, klikt u op de knop OK .
    3. Verplaats vervolgens de rechthoek rond de kolonies en gebruik deze om het deel van de plaat met de kolonies bij te snijden. Als u klaar bent, klikt u op de knop OK .
    4. De volgende prompt definieert het raster dat wordt gebruikt om de ROI rond elke kolonie te tekenen en het beweeglijkheidsgebied te meten. Selecteer de juiste koloniedichtheid. Pas de verschillende parameters indien nodig aan, zodat elke cirkel rond een kolonie ligt. Als je klaar bent, activeer je de Oké? en klik op de knop OK . Hiermee wordt het beweeglijkheidsgebied voor elke kolonie gemeten en wordt een CSV-bestand opgeslagen in de map met de gegevens.
  2. Combineer dit CSV-bestand met de plaatlegenda, ook geordend in rijen, om elk motiliteitsgebied met de bijbehorende mutant te identificeren. Lagere geïntegreerde dichtheidswaarden komen overeen met de mutanten die niet-beweeglijk waren of een verminderde beweeglijkheid vertoonden.

5. Traditionele motiliteitstesten voor de validatie van treffers

OPMERKING: Na het observeren van mutanten met beïnvloede motiliteit in het high-throughput motiliteitsprotocol, is het belangrijk om de verkregen treffers afzonderlijk te valideren. Het protocol voor individuele motiliteit verschilt van het protocol dat wordt gebruikt voor testen met hoge doorvoer, maar de gebruikte media zijn hetzelfde.

  1. Zwermmotiliteitstest
    OPMERKING: De zwermmotiliteit wordt uitgevoerd zoals in detail beschreven door Ha et al.16.
    1. Autoclaveer in het kort een agar-oplossing met M9 (0,5% agar), glucose, casaminozuren en MgSO4. Giet de afgekoelde, gemengde agar in petriplaten (25 ml per plaat).
    2. Inoculeer met 2,5 μL nachtelijke bacteriecultuur. Incubeer gedurende 18 uur bij 37 °C met de deksels naar boven gericht om de motiliteitsfenotypes te observeren.
  2. Spiertrekkingen motiliteitstest
    OPMERKING: De spiertrekkingen worden uitgevoerd zoals in detail beschreven door Haley et al.33,34.
    1. In het kort, autoclaaf een LB 1% agar (zie tabel 1). Giet de afgekoelde, gemengde LB 1% agar in petriplaten (25 ml per plaat).
    2. Steek bacteriën op de bodem van de spiertrekkingen (1% agar). Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 °C en vervolgens nog eens 48 uur bij RT. Verwijder de agar van het bord en visualiseer de spiertrekkingen door de petrischaal te kleuren met 1% kristalviolet.
    3. Fotografeer de petrischaaltjes met behulp van de PhenoBooth met dezelfde parameters als beschreven in stap 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten dit protocol om het effect van geninactivatie op de beweeglijkheid van P. aeruginosa bij hoge doorvoer te karakteriseren. Hier hebben we het gebruik ervan beschreven om zwermende en twitching motiliteit te bestuderen in een genoombrede deletiecollectie van P. aeruginosa stam PA14 (PA14 bibliotheek). Het protocol biedt een grote veelzijdigheid en gebruiksgemak, waardoor wijzigingen in verschillende stappen van het protocol mogelijk zijn, zoals het...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven high-throughput motiliteitsprotocol stelt ons in staat om het motiliteitsfenotype van veel kolonies met precisie en reproduceerbaarheid te verwerken en te analyseren. Vergeleken met traditionele handmatige methoden verhoogt deze semi-geautomatiseerde aanpak de schaalbaarheid en doorvoer van motiliteitstesten om de genoombrede beoordeling van de bacteriële motiliteit mogelijk te maken. Het protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met de PA14-bibliotheek, maar deze test...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen onthullingen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Surette-lab van de McMaster University voor het verstrekken van een kopie van de PA14-bibliotheek. Wij danken Dr. Fabrice Jean-Pierre voor zijn nuttige commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Natural Science and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06044) en een startsubsidie voor nieuwe onderzoekers van het Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613). J.-P.C. heeft een Chercheur boursier junior 2 fellowship van het Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 well-plates  Corning  3701 
Agar Fisher Scientific  BP1423-2 Finale concentratie van 0,5% voor swarming motiliteit of 1% voor twitching motiliteit respectievelijk. 
Casamino Acids  Fisher Scientific  223050 Bereid een 20% voorraad in water. Filter steriliseert met een 0,22 μm filter en bewaar bij 4 °C. Finale concentratie 0,5% in M9 minimum medium. 
Kristalviolet Bio Basic  CB0331Bereid een 1% oplossing in water. 
D-Glucose  Bio Basic  GB0219 Bereid een 20% voorraad (1,1 M) in water en steriliseer door autoclaving. Finale concentratie 0,2% in M9 minimum medium. 
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
Gentamycin sulfaat  Bio Basic  GB0217 Bereid een 30 mg/ml voorraad in water. Filter steriliseert met een 0,22 μm filter en bewaar bij 4 °C – finale concentratie in platen 15 µg/mL..  
Inoculatieslinger en naald Fisher Scientific 22363597
M9 Minimal Salts, 5X Fisher Scientific 248510Bereid een 1M voorraad in water en steriliseer door autoclaaf. Finale concentratie 1 mM in M9 minimum medium.  
Magnesium Sulfate (MgSO4)  Fisher Scientific M63-500 Bereid een 1 M MgSO4 voorraad in water. Filter steriliseert met een 0,22 μm filter en bewaar bij kamertemperatuur. Finale concentratie 
PA14 Transposon Insertie Mutanten Bibliotheek  Liberati et al., 2006 (Zie referentie 29)59 96-well platen voor de volledige collectie. Elke put bevat een enkele mutant in LB met 25% glycerol. 
Petrischaal 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ Los 11,3 g van het poeder in 200 mL gezuiverd water. Autoclaveer bij 121 °C gedurende 15 min. 
Kunststof spuit 10 mL Fisher Scientific 14955459
Rotor+   Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-hda/ 
Short pin RePads 384 dichtheden Singer Instruments  REP-004 
Short pin RePads 96 dichtheden  Singer Instruments  REP-002 
Natriumchloride (NaCl)  Fisher Scientific BP358-212 
Veerlading 96-pin replicatorEnzyScreen  CR1000 
Chirurgische kling roestvrij No. 25 Fisher Scientific 08-918-5F
Tryptone Oxoid  LP0042B 
Uniwell platenSinger Instruments  PlusPlates: PLU-003  Platen afmeting: 54 × 34 × 38 cm - zonder binnenwanden, die grotere interne afmetingen bieden. 
Uniwell platenVWRSingle well weefselkweek platen: 75780-348Zelfde afmetingen als de PlusPlates.
Gist Extract Fisher Scientific 248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas AeruginosaBacterial MotilitySwarming MotilityTwitching MotilityHigh Throughput ProtocolMotility AssayGenome Wide MutantBiofilm FormationColony Pinning RobotImageJ Analysis

Related Articles