Method Article

Optimalisatie van de afgifte van extracellulaire blaasjes met behulp van een 3D-gebioprinte steiger met kernomhulsel voor chronische wondbehandeling

DOI:

10.3791/67764

⸱

February 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een protocol voor het vervaardigen van 3D-biogeprinte steigers voor chronische wondgenezing. Extracellulaire blaasjes worden geïsoleerd uit mesenchymale stamcellen en in de kern (alginaat) geladen met het omhulsel gemaakt van carboxymethylcellulose en alginaatlyase. Dit ontwerp maakt gecontroleerde degradatie van steigers en efficiënte vrijlating van EV's mogelijk.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie schetst een gedetailleerd protocol voor de fabricage van 3D-gebioprinte steigers met kernschede die zijn ontworpen om chronische wondgenezing te verbeteren. Het protocol omvat het isoleren van extracellulaire blaasjes (EV's) uit mesenchymale stamcellen (MSC's), bekend om hun regeneratieve en immunomodulerende eigenschappen. Deze EV's worden vervolgens opgenomen in een unieke steigerstructuur. De steiger heeft een kern die bestaat uit alginaat geladen met EV's, omgeven door een omhulsel van carboxymethylcellulose en alginaatlyase. Dit innovatieve ontwerp zorgt voor een gecontroleerde degradatie van de steiger en bevordert tegelijkertijd een efficiënte en gecontroleerde afgifte van EV's op de plaats van de wond. Het protocol omvat belangrijke stappen, waaronder de voorbereiding en karakterisering van de EV's, de formulering van bio-inkten voor 3D-bioprinting en de optimalisatie van printparameters om de gewenste kern-mantelarchitectuur te bereiken. Door structurele integriteit en bioactiviteit te combineren, wil de steiger de beperkingen van conventionele wondverbanden aanpakken en een gerichte aanpak bieden om de weefselregeneratie te versnellen en ontstekingen bij chronische wonden te verminderen. Deze methode biedt een reproduceerbare en schaalbare strategie voor het ontwikkelen van geavanceerde biomaterialen met potentiële klinische toepassingen bij chronische wondbehandeling. Het protocol benadrukt ook kritische overwegingen voor het bereiken van consistente resultaten, waardoor het aanpassingsvermogen voor toekomstige therapeutische toepassingen wordt gegarandeerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische wonden, vaak gekoppeld aan overmatige ontstekingen, vereisen tijdige behandeling om ernstige complicaties zoals infecties en weefselnecrose, die tot amputaties kunnen leiden, te voorkomen. Ondanks de vooruitgang blijven de huidige behandelingen duur, ongemakkelijk, hebben ze bijwerkingen en hebben ze een beperkte werkzaamheid, wat de noodzaak van meer curatieve verbanden benadrukt 1,2,3. De ontwikkeling van een nieuwe generatie wondverbanden die speciaal zijn ontworpen voor chronische wonden is essentieel om deze uitdagingen aan te gaan. Bovendien vereist de complexe aard van wondgenezing verbandmaterialen met een scala aan eigenschappen, waaronder hydratatie, flexibiliteit, hechting, bioactiviteit en biologische afbreekbaarheid4. Deze studie heeft tot doel een bio-engineered wondverband te ontwikkelen dat extracellulaire blaasjes (EV's) integreert met een 3D-gebioprinte steiger in de kernhuls om een gecontroleerde therapeutische omgeving te bieden en chronische wondgenezing te versnellen.

EV's afgeleid van stamcellen helpen bij chronische wondgenezing door ontstekingsremmende reacties, celgroei, migratie en bloedvatvorming te bevorderen5. Bovendien kunnen EV's bioactieve moleculen leveren, waaronder geneesmiddelen met kleine moleculen, gen- en eiwitconstructies voor chronische wondbehandeling6. Bovendien verbetert hun vermogen om lading te beschermen tegen enzymatische afbraak de stabiliteit en biologische beschikbaarheid van therapeutische middelen, wat duidelijke voordelen biedt ten opzichte van conventionele groeifactoren en geneesmiddelen met kleine moleculen, die in vivo vaak snel worden afgebroken 7. Ondanks deze voordelen blijft de efficiënte en aanhoudende afgifte van EV's aan doelweefsels een grote uitdaging.

3D-bioprinting steigers kunnen dienen als een leveringsplatform voor EV's om hun therapeutische effecten te versterken8. Deze steigers bootsen natuurlijke cellulaire omgevingen na en zorgen voor de gecontroleerde afgifte van EV's 9,10. Ze beschermen EV's ook tegen degradatie en verbeteren de stabiliteit van hun microRNA's en eiwitten11. Han et al. toonden aan dat EV's effectief kunnen worden losgemaakt van 3D bioprinted GelMA-steigers. Deze afgifte leidde tot verbeterde celhechting en verbeterde genexpressie gerelateerd aan mechanotransductieroutes in mesenchymale stamcellen (hBFP-MSC's) van het menselijke buccale vetkussen die op de steigers waren gezaaid12. Born et al. bereikten door het optimaliseren van de concentratie van de crosslinker een gecontroleerde afgifte van de EV's. Deze aanpak heeft zijn werkzaamheid aangetoond bij het bevorderen van angiogenese en biedt een veelbelovende methode voor de gereguleerde toediening van EV's13.

Core-sheath 3D-bioprinting maakt het mogelijk om complexe, multi-materiaalstructuren te creëren door een kernmateriaal te printen dat is ingekapseld in een omhulsel. De kern kan cellen, groeifactoren of medicijnen bevatten, terwijl de schede mechanische ondersteuning en bescherming biedt of als barrière fungeert. Deze methode heeft toepassingen in weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde, zoals het ontwikkelen van vasculaire netwerken, het nabootsen van natuurlijke weefselstructuren en het creëren van medicijnafgiftesystemen. Het maakt nauwkeurige controle mogelijk over de verdeling en samenstelling van het materiaal, waardoor de functionaliteit en biologische relevantie van de constructies worden verbeterd. In vergelijking met alternatieve technieken biedt 3D-bioprinten met de kernmantel nauwkeurige controle over de materiaalverdeling en -samenstelling, waardoor de functionaliteit en biologische relevantie van de constructies worden verbeterd14,15.

Gemanipuleerde degradatie in wondverbanden biedt voordelen zoals minder ongemak tijdens veranderingen, een vochtige omgeving voor genezing en infectiebeheersing, tijdige therapeutische toediening en optimale weefselregeneratie 16,17,18. Hydrogels van alginaat (Alg) en carboxymethylcellulose (CMCh) zijn biocompatibel en effectief voor het afleveren van extracellulaire blaasjes (EV's) aan wonden, waardoor genezing wordt verbeterd door cellulaire communicatie en vermindering van ontstekingen18. In deze studie werden EV's geïntegreerd in een kern van Alg, terwijl een omhulsel van CMCh en AlgLyase (AlgLyase) werd gebruikt om snelle afbraak van het verband en de afgifte van EV's mogelijk te maken. Dit ontwerp van de kernmantel vergemakkelijkt de snelle afgifte van EV's als reactie op degradatie van de steiger, waardoor hun therapeutische werkzaamheid wordt verbeterd en de beperkingen van bestaande chronische wondbehandelingen worden aangepakt. Het primaire doel van deze studie is het ontwikkelen van een bio-engineered verband dat de wondgenezing verbetert door gecontroleerde afgifte van EV's te integreren met een responsief afbreekbare steiger, waardoor uiteindelijk de behandelingsresultaten voor chronische wonden worden verbeterd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het dieronderzoek werd uitgevoerd in volledige overeenstemming met de ethische normen die zijn opgesteld door het Nationaal Comité voor Bio-ethiek en het Dierethisch Comité van de Universiteit van Nizwa. Ethische goedkeuring voor deze studie werd verleend onder goedkeuring ID: VCGSR, AREC/01/2023. Alle dieren werden gehuisvest onder standaard laboratoriumomstandigheden, wat zorgde voor optimale milieucontroles, goede voeding en uitgebreide zorg om hun welzijn tijdens het onderzoek te waarborgen. Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, hielden zich strikt aan het institutionele beleid, de internationale normen voor dierenzorg en de ARRIVE-richtlijnen.

1. Celcultuur

  1. Haal een injectieflacon MSC's (passage #2) uit de opslag van vloeibare stikstof en behandel deze met aseptische technieken om besmetting te voorkomen. Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C en zorg ervoor dat ze worden verwijderd zodra er een klein ijsfragment overblijft.
  2. Bereid een compleet medium voor inclusief MSC SFM Basal Medium, aangevuld met 1% (v/v) MSC SFM XenoFree supplement, 1% (v/v) GlutaMAX en 0,01% (v/v) Gentamicine. Voeg 1 ml voorverwarmd (37 °C) volledig medium met een snelheid van 3 tot 5 druppels om de 5 s toe aan de injectieflacon en meng het vervolgens voorzichtig. Breng de volledige inhoud van de MSC-injectieflacon over in een conische buis van 15 ml met 4 ml voorverwarmd volledig medium, onder aseptische omstandigheden in een bioveiligheidskast van klasse II.
  3. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de centrifuge goed in balans is.
  4. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de cellen in 1 ml voorverwarmde volledige media. Breng de cellen vervolgens over in een T25-kolf met 4 ml volledig medium.
  5. Kantel de kolf voorzichtig om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn. Incubeer de kolf bij 37 °C met 5 % CO2.
  6. Vervang het medium elke 2 dagen en vervang het door vers, voorverwarmd, compleet medium. Gebruik voorzichtig pipetteren om celverstoring te voorkomen. Bij het bereiken van 70%-80% samenvloeiing, zuigt u het verbruikte medium op uit de T25-kolf.
  7. Was de cellen met 3 ml verse PBS om resten te verwijderen. Zorg ervoor dat de kolf tijdens het wassen volledig bedekt is.
  8. Voeg 1 ml 0,25% trypsineoplossing toe aan de T25-kolf, incubeer deze 3-7 minuten bij 37 °C en controleer de onthechting zorgvuldig onder de microscoop bij een vergroting van 4x.
  9. Tik indien nodig zachtjes op de kolf om volledige celloslating te garanderen. Voeg voorverwarmd volledig medium toe aan de kolf en pipetteer op en neer over het oppervlak om de cellen los te maken. Breng vervolgens de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml.
  10. Centrifugeer de buis op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Suspendeer de celpellet in een vers, compleet medium en tel de cellen met behulp van een Neubauer-hemocytometer. Breng de cellen over in een kolf T75. Zorg voor een zaaidichtheid van 5.000 cellen/cm2 voor een optimale groei.
  11. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2. Verzamel na 72 uur celincubatie de geconditioneerde media uit cellen voor isolatie van EV's. Gebruik direct na verzameling.

2. Isolatie van EV's

  1. Centrifugeer de 13 ml van de verzamelde geconditioneerde media op 800 x g gedurende 15 minuten om cellulair vuil te verwijderen. Filtreer het bovenstaande voorzichtig met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm om grote deeltjes te verwijderen.
  2. Voeg 5 ml neerslagbuffer toe aan de gefilterde geconditioneerde media en draai grondig om te mengen. Zorg ervoor dat de oplossing homogeen is.
  3. Incubeer het mengsel een nacht bij 4 °C om de EV's de kans te geven neer te slaan. Centrifugeer het mengsel 30 minuten bij 3.220 x g bij 20 °C. Controleer de balans van de buizen.
  4. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg zonder de pellet te verstoren. Centrifugeer de pellet nogmaals op 3.220 x g gedurende 5 s om resterende vloeistof te verwijderen.
  5. Piket de EV-pellet voorzichtig in 200 μL PBS om schade aan de EV's te voorkomen. Meet de eiwitconcentratie van EV's volgens de instructies van de fabrikant (BCA Protein Assay Kit).
  6. Voer Western blotting uit om EV-specifieke markers te detecteren (CD63, CD81 en CD9), om EV-fenotype18 te verifiëren. De analyse bevestigde de aanwezigheid van deze markers en valideerde de identiteit van de EV19.
  7. Om het risico op RNase-besmetting te minimaliseren, wordt aanbevolen om het direct te gebruiken zonder extra opslag. Als het nodig is, bewaar de EV's dan bij -80 °C voor verder gebruik. Verdeel de EV's in volumes van 40 μl om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.

3. EV's labelen met PKH-26

  1. Buffer voorbereiding
    1. Los 0,238 g HEPES op in ongeveer 90 ml steriel ultrazuiver water in een steriele container. Gebruik een vers bereide HEPES-oplossing. Voeg 0,85 g NaCl toe aan de HEPES-oplossing.
    2. Stel de pH in op 7,4 met behulp van 1 M NaOH of HCl, indien nodig, met behulp van een gekalibreerde pH-meter. Voeg gedeïoniseerd water toe om het totale volume op 100 ml te brengen. Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm om deze te steriliseren.
  2. Verdun 4 μL PKH-26 kleurstof in 1 ml voorbereide buffer. Meng grondig met een pipet om homogeniteit te garanderen.
  3. Resuspendeer gezuiverde EV's in 1 ml PBS in een concentratie van 700 μg/ml. Voeg 1 ml van de EVs-suspensie toe aan 1 ml van de bereide PKH-26-oplossing. Voeg voor de controlegroep met alleen kleurstoffen 1 ml volledig medium zonder EV's toe aan 1 ml PKH-26-oplossing. Alle volgende stappen worden ook uitgevoerd voor de controlegroep om rekening te houden met mogelijke niet-specifieke aggregatie of micelvorming.
  4. Meng de EV's grondig door de buis voorzichtig 10x-15x om te keren. Incubeer het mengsel gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur en zorg voor een gelijkmatige blootstelling van EV's aan de kleurstof.
  5. Bereid een 2 ml verse 1% BSA-oplossing met steriel ultrapuur water en voeg deze toe aan de 2 ml van het resulterende mengsel om de etiketteringsreactie te doven. Meng voorzichtig om aggregatie te voorkomen.
  6. Concentreer de PKH-26 gelabelde EV's volgens het bovengenoemde protocol (stappen 2.2-2.7). Resuspendeer de gelabelde EV's in 300 μl PBS. Pipetteer het monster van de PKH-26 gelabelde EV's in een filterbuis van 30 kDa.
  7. Centrifugeer het monster bij 3.220 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Tijdens deze stap gaan de vrije PKH-26-kleurstof en kleine moleculen door het membraan in het filtraat, terwijl de PKH-26-gelabelde EV's in het retentaat worden vastgehouden.
  8. Gooi na de eerste centrifugatie het filtraat weg en voeg 300 μL PBS toe aan het retentaat. Resuspendeer de EV's in de PBS voorzichtig door op en neer te pipetteren.
  9. Centrifugeer het monster opnieuw bij 3.220 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om de resterende vrije kleurstof of kleine moleculen weg te spoelen.
  10. Bevestig het ontbreken van PKH-26 in de filtraatoplossing met een fluorescerende microscoop. Als er kleurstof wordt gedetecteerd, herhaalt u de wasstappen.
  11. Verzamel de bovenste oplossing met een micropipet en verwijder het filter uit de opvangbuis. Keer het filter voorzichtig om (draai het ondersteboven).
  12. Centrifugeer het omgekeerde filter 5 minuten bij 800 x g bij 4 °C. Dit zal helpen om de achtergebleven PKH-26-EV's van het filtermembraan in de nieuwe opvangbuis te verzamelen. Gebruik direct de PKH-26-EV's voor de volgende stap.

4. 3D Bio-printen

  1. Bioinks voorbereiding
    1. Bereid een verse 4,5% (m/v) natriumoplossing van Algen met behulp van steriel ultrazuiver water. Roer een nacht bij 60 °C om de oplossing volledig op te lossen.
    2. Los CMCh op in steriel ultrazuiver water om een oplossing van 3,8% (m/v) te verkrijgen. Vers bereiden. Roer een nacht bij 60 °C om volledig op te lossen.
    3. Centrifugeer de voorbereide bio-inkten op 3.220 x g gedurende 10 minuten bij 25°C om eventuele luchtbellen te verwijderen die het printproces kunnen verstoren.
    4. Meng de bereide 3 ml Alg-oplossing met de geëtiketteerde EV's of de kleurstofcontrole met behulp van een spuitmixer om de concentratie van 0,01% (m/v) van EV's te bereiken. Zorg voor een gelijkmatige verdeling door voorzichtig te mengen.
    5. Gebruik een spuitmixer om 1 ml CMCh te combineren met een vers bereide AlgLyase-oplossing in steriel ultrazuiver water om een eindconcentratie van 0,5 mU/ml te bereiken.
  2. Zoals weergegeven in afbeelding 1A, laadt u tegelijkertijd de Alg/Exo-bioink in het kerndeel en de CMCh/AlgLyase-bioink in het omhulselgedeelte van de opstelling van de kern/omhulsspuit.
  3. Laat de bio-inkten 15 minuten rusten voordat u ze afdrukt.
  4. 3D-bio-printer opstelling
    1. Met behulp van de 3D-bioprinter-software maakt u de steigerstructuur door een cilindrische vorm met een diagonaal vulpatroon te selecteren. Stel hiervoor de diameter en hoogte van de cilinder in op respectievelijk 20 mm en 1,1 mm. Configureer de poriegrootte tot 1 mm.
    2. Stel de pompsnelheden van de kern en de mantelsproeier in op 1 mm/s met een dikte van 0,25 mm per laag en stel de bewegingssnelheid in op 6 mm/s. Print vier lagen met een dikte van 0,25 mm per laag bij kamertemperatuur.
  5. Begin met printen op polyesterfilm.
  6. Gebruik de luchtbevochtiger met calciumchloride in spuitbus (2,2%) om de steiger tijdens het extrusieproces te verknopen. Plaats het mondstuk van de luchtbevochtiger op ongeveer 20 cm afstand van de extrusiekop om een effectieve verknoping te garanderen zonder de steigerstructuur in gevaar te brengen. Dompel de steiger voor verdere verknoping gedurende 10 minuten onder in een calciumchlorideoplossing (2,2%).
  7. Spoel de steiger 3x af met steriel ultrazuiver water om overtollig calciumchloride en ongebonden bioink te verwijderen.
  8. Zorg ervoor dat de steiger wordt opgeslagen in een steriele omgeving bij 4 °C om de integriteit en functionaliteit van de steiger tot drie maanden te behouden.

5. Het volgen van de release van EV's

  1. Creatie van een cirkelvormig huidwondmodel
    1. Verdoof mannelijke Akita heterozygote diabetische muizen (8 weken) door toediening van een intraperitoneale injectie van ketamine (70 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). Bevestig de juiste verdoving door de afwezigheid van reflexreacties (bijv. teenknijpen) te beoordelen en controleer de ademhalingsfrequentie. Om uitdroging van het hoornvlies tijdens de anesthesie te voorkomen, brengt u steriele veterinaire oogheelkundige zalf aan op de ogen.
    2. Bereid het dorsale huidgebied voor door het eerst te scheren met een elektrische tondeuse. Vermijd huidirritatie of letsel. Steriliseer het geschoren gebied met een povidon-jodiumoplossing.
    3. Maak met behulp van een steriele grijper een cirkelvormige huidwond van 6 mm over de volledige dikte op het dorsale oppervlak van elke muis.
    4. Plaats de 3D-gebioprinte steiger met PKH-gelabelde EV's voorzichtig rechtstreeks op het wondbed. Zorg ervoor dat de steiger het wondoppervlak volledig bedekt met minimale luchtbellen door licht te drukken met een steriele tang. Zorg ervoor dat het dier na de ingreep nauwlettend in de gaten wordt gehouden en verzorgd blijft totdat het volledig bij bewustzijn is gekomen en sternale lighouding kan behouden.
  2. Fluorescerende beeldvorming
    1. Verdoof de muizen 2 uur, 4 uur, 8 uur, 24 uur na implantatie met isofluraan. Voor inductie van anesthesie plaatst u de muizen in de kamer van het in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) en stelt u ze bloot aan 2%-3% isofluraan in zuurstof. Breng oogzalf aan op de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen. Eenmaal verdoofd, brengt u de muizen over naar het IVIS-systeem en houdt u ze met 1%-2% isofluraan in zuurstof die via de neuskanalen wordt afgegeven. Controleer of de dieren volledig verdoofd en stabiel zijn voordat u verder gaat met beeldvorming.
    2. Gebruik het IVIS-systeem om de fluorescerende signalen op te vangen van de PKH-gelabelde EV's die uit de steiger komen. Selecteer in de beeldvormingswizard de optie Fluorescentiebeeldvorming en activeer de excitatie- en emissiefilters voor de PKH-kleurstof. Pas de camera-instellingen aan, waaronder het gezichtsveld en de hoogte van het onderwerp, om de signaaldetectie te optimaliseren. Zorg voor een consistente positionering op alle beeldvormingstijdstippen om nauwkeurige vergelijkingen mogelijk te maken. Begin met het verkrijgen van afbeeldingen en sla de resulterende gegevens op.
    3. Kwantificeer de fluorescerende signaalintensiteiten met behulp van de IVIS-software. Dit maakt het mogelijk om de release van EV's in de loop van de tijd te volgen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vivo vrijlating van EV's van zowel de Alg-EVs/CMCh als de Alg-EVs/CMCh-AlgLyase-steigers wordt weergegeven in Figuur 1B,C. Zoals verwacht vertoonde de Alg-EVs/CMCh-AlgLyase-steiger een sneller afgifteprofiel in vergelijking met Alg-EVs/CMCh, vooral op de tijdstippen van 2 uur en 4 uur. De afgifte van EV's uit hydrogels wordt bepaald door een combinatie van fysisch-chemische mechanismen, waaronder diffusie, zwelling, erosie en ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een cruciaal aspect van het protocol is het ontwerp van de kernmantel, dat essentieel is voor het bereiken van een efficiënte levering van EV's. Het ontwerp bevat Alg als kernmateriaal en een combinatie van CMCh met Alglyase als omhulsel. Deze opstelling maakt het mogelijk om EV's gecontroleerd en snel vrij te geven. Het kernmateriaal, Alg, kapselt de EV's in en zorgt voor hun bescherming en lokale levering. De mantel, bestaande uit CMCh en Alglyase, maakt de versnelde afbraak van de Alg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Speciale dank aan Said Al-Hashmi en Abdulrahman Almharbi van Happy Production voor hun uitstekende werk bij het filmen. We danken ook het ministerie van Hoger Onderwijs, Onderzoek en Innovatie en de Universiteit van Nizwa voor hun financiële steun en voor het verstrekken van de benodigde middelen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
23 G Purple precision conical NozzleCellinkKT0000002000Om precieze extrusie van bioinks te bieden met minimale verstopping
Alginate lyase (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase is een enzym dat alginaat afbreekt.
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOMerckUFC9030Wordt gebruikt om PKH-26 gelabelde-EVs te wassen
BCA assay KitThermo Scientific10678484Om de eiwit/EVs-concentratie te bepalen
Bioprinting SystemRegematV1Om een core-sheath scaffold te fabriceren
Bovine serum albumin (BSA)sigma-aldrich05470-5GOm de PKH 26 reactie te stoppen 
Calcium chlorideSigma AldrichC3306-100GOm bioinks in weefsel engineering te crosslinken en te stabiliseren
CentrifugeSigma2-16PGebruikt voor EVs isolatie
Centrifuge 5810 REppendorf22625101Gebruikt voor celcultuur
Class II Biological Safety CabinetTelstarBio II AdvanceCelcultuur
CryoCube F570 Series - ULT FreezerEppendorfF571240035Om EVs op te slaan
fluorescent microscopeOLYMPUS IX73P1F Gebruikt om de resterende PKH-26 in het filtraat te controleren
Gentamicin (50 mg/mL)Thermofisher15750Antibioticum voor celcultuur media
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquidThermofisherA12860Celcultuur media supplement
HClSigma Aldrich7647-01-0Buffer voorbereiding 
HEPESCarl RothArt. Nr. 6763.3Buffer voorbereiding 
High viscous carboxymethyl cellulose (CMCh)BDH27929 4TCMCh is een wateroplosbaar cellulosederivaat.
IncubatorNew Brunswick NB-170RCelcultuur
Invivo imagingPerkinElmerIVIS Lumina XRMS Series III Om EVs-afgifte, in vivo, te volgen
Magnet stirerSalvisLABMC35Voor Bioinks voorbereiding
miRCURY Exosome Kits for Exosome IsolationQiagen76743EVs isolatie
NaOhDaejung1310-73-2Buffer voorbereiding 
phosphate buffered saline(PBS)Thermo ScientificJ61196.APCelcultuur
PKH 26MCE154214-55-8Rode fluorescerende kleurstof voor het labelen van deEVs
Sodium alginate (Alg)Sigma AldrichA0682-100GNatuurlijk polysacharide afgeleid van bruin zeewier.
Sodium chloride (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1Buffer voorbereiding 
StemPro BM Mesenchymal Stem CellsThermofisherA1382901Mesenchymale stamcellen
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501Celcultuur media
Trypsin 0.25%Thermofisher25050014Cel dissociatie
Vortex-MixerDaihan ScientificVM-10Gebruikt om precipitatie buffer te mengen met de geconditioneerde media

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
  2. Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. Recent advances in functional wound dressings. Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).
  3. Shao, M., et al. Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: Recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 34 (5), 385-452 (2017).
  4. Rezvani Ghomi, E., Khalili, S., Nouri Khorasani, S., Esmaeely Neisiany, R., Ramakrishna, S. Wound dressings: Current advances and future directions. J Appl Poly Sci. 136 (27), 47738(2019).
  5. Ding, J. Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in skin wound healing: Roles, opportunities and challenges. Military Med Res. 10 (1), 36(2023).
  6. Sharma, D., Kumar, A., Mostafavi, E. Extracellular vesicle-based biovectors in chronic wound healing: Biogenesis and delivery approaches. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 822-840 (2023).
  7. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Adv Drug Delivery Rev. 106, 148-156 (2016).
  8. Han, P., Ivanovski, S. 3d bioprinted extracellular vesicles for tissue engineering-a perspective. Biofabrication. 15 (1), 013001(2022).
  9. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  10. Zheng, Y., Pan, C., Xu, P., Liu, K. Hydrogel-mediated extracellular vesicles for enhanced wound healing: The latest progress, and their prospects for 3d bioprinting. J Nanobiotechnol. 22 (1), 57(2024).
  11. Keener, A. B. How extracellular vesicles can enhance drug delivery. Nature. 582 (7812), S14-S14 (2020).
  12. Han, P., et al. 3d bioprinted small extracellular vesicles from periodontal cells enhance mesenchymal stromal cell function. Biomater Adv. 158, 213770(2024).
  13. Born, L. J., et al. Sustained released of bioactive mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles from 3d-printed gelatin methacrylate hydrogels. J Biomed Mater Res A. 110 (6), 1190-1198 (2022).
  14. Kjar, A., Mcfarland, B., Mecham, K., Harward, N., Huang, Y. Engineering of tissue constructs using coaxial bioprinting. Bioact Mater. 6 (2), 460-471 (2021).
  15. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3d bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  16. Deshayes, S., Kasko, A. M. Polymeric biomaterials with engineered degradation. J Poly Sci A Poly Chem. 51 (17), 3531-3566 (2013).
  17. Xu, Q., et al. Injectable hyperbranched poly (β-amino ester) hydrogels with on-demand degradation profiles to match wound healing processes. Chem Sci. 9 (8), 2179-2187 (2018).
  18. Vakilian, S., et al. Engineered local delivery of extracellular vesicles loaded with si-tnf-α, via a core-sheath 3d-bio-printed scaffold as an effective wound dressing. J Drug Delivery Sci Technol. 101, 106189(2024).
  19. Mirsanei, Z., et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and dexamethasone on macrophage polarization under inflammatory conditions. Inflammopharmacology. 32 (2), 1317-1332 (2024).
  20. Ma, Y., Brocchini, S., Williams, G. R. Extracellular vesicle-embedded materials. J Controlled Release. 361, 280-296 (2023).
  21. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell-extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  22. Lou, P., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: Current knowledge and future perspectives. Acta Biomater. 119, 42-56 (2021).
  23. Cai, Y., Chen, K., Liu, C., Qu, X. Harnessing strategies for enhancing diabetic wound healing from the perspective of spatial inflammation patterns. Bioactive Mater. 28, 243-254 (2023).
  24. Li, Z., et al. Multifunctional hydrogel-based engineered extracellular vesicles delivery for complicated wound healing. Theranostics. 14 (11), 4198(2024).
  25. Cabral, J., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Extracellular vesicles as modulators of wound healing. Adv Drug Delivery Rev. 129, 394-406 (2018).
  26. Moghadasi Boroujeni, S., Mashayekhan, S., Vakilian, S., Ardeshirylajimi, A., Soleimani, M. The synergistic effect of surface topography and sustained release of tgf-β1 on myogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 104 (7), 1610-1621 (2016).
  27. Jayaraman, P., et al. Controlled release of drugs in electrosprayed nanoparticles for bone tissue engineering. Adv Drug Delivery Rev. 94, 77-95 (2015).
  28. Huang, X., Brazel, C. S. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J Controlled Release. 73 (2-3), 121-136 (2001).
  29. Smith, A. M., Senior, J. J. Alginate hydrogels with tuneable properties. Adv Biochem Eng Biotechnol. 178, 37-61 (2021).
  30. Yan, X., Sha, X. Nanoparticle-mediated strategies for enhanced drug penetration and retention in the airway mucosa. Pharmaceutics. 15 (10), 2457(2023).
  31. Pant, B., Park, M., Park, S. -J. Drug delivery applications of core-sheath nanofibers prepared by coaxial electrospinning: A review. Pharmaceutics. 11 (7), 305(2019).
  32. Pinheiro, A., et al. Extracellular vesicles: Intelligent delivery strategies for therapeutic applications. J Controlled Release. 289, 56-69 (2018).
  33. Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T., Koizuni, A. A novel locus, mody4, distal to d7mit189 on chromosome 7 determines early-onset niddm in nonobese c57bl/6 (akita) mutant mice. Diabetes. 46 (5), 887-894 (1997).
  34. Fang, R. C., et al. Limitations of the db/db mouse in translational wound healing research: Is the noncnzo10 polygenic mouse model superior. Wound Repair Regen. 18 (6), 605-613 (2010).
  35. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  36. Sellers, R. S. Translating mouse models: Immune variation and efficacy testing. Toxicol Pathol. 45 (1), 134-145 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Vesicle Delivery3D Bioprinted ScaffoldChronic Wound ManagementMesenchymal Stem CellsCore Sheath ScaffoldExtracellular Vesicle IsolationBioink FormulationScaffold Cross LinkingWestern BlottingDiabetic Wound Healing

Related Articles