Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Uitgebreide analyse van de geneesmiddelrespons met behulp van de FLICK-test

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67768

⸱

6 juni 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe de FLICK-test moet worden gebruikt voor het evalueren van geneesmiddelresponsen, inclusief gedetailleerde instructies voor het gebruik van deze test om de door geneesmiddelen geïnduceerde groeipercentages en sterftecijfers te berekenen en om het mechanisme van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te evalueren.

Samenvatting

Om de werkzaamheid van geneesmiddelen te begrijpen, is het van cruciaal belang om de mate van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te karakteriseren. Pogingen om het niveau van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te kwantificeren, worden uitgedaagd door het bestaan van meer dan een dozijn moleculair verschillende vormen van gereguleerde dood, elk met zijn eigen activeringstiming en biochemische kenmerken. Bovendien worden voor sommige subtypes van necrotische dood de kenmerkende kenmerken slechts vluchtig waargenomen en gaan ze snel verloren als gevolg van celruptuur. Dus, zelfs bij het gebruik van een combinatie van doodsroute-specifieke assays, is het een uitdaging om de totale hoeveelheid celdood of de relatieve bijdragen van elk doodssubtype nauwkeurig te kwantificeren. Een ander probleem is dat veel doodsspecifieke tests negeren hoe medicijnen de celproliferatie beïnvloeden, waardoor het een uitdaging is om te interpreteren of een met medicijnen behandelde populatie zich uitbreidt of krimpt. De FLICK-test maakt het mogelijk om het totale niveau van celdood na stimulatie te kwantificeren op een manier die specifiek is voor de dood, maar ook grotendeels agnostisch is voor het (de) geactiveerde type(n) dood. Bovendien bewaart de FLICK-test informatie over de totale populatiegrootte en de celproliferatiesnelheid. In dit manuscript beschrijven we het basisgebruik van de FLICK-test, hoe problemen met deze test kunnen worden opgelost bij het gebruik van verschillende soorten biologisch materiaal, en hoe de FLICK-test kan worden gebruikt om de bijdragen van elk type celdood aan een waargenomen geneesmiddelrespons te kwantificeren.

Inleiding

Voor geneesmiddelen tegen kanker omvat de preklinische evaluatie van de gevoeligheid van geneesmiddelen over het algemeen het testen hoe geneesmiddelen de levensvatbaarheid van cellen in cultuur1 beïnvloeden. De levensvatbaarheid van cellen na blootstelling aan geneesmiddelen is het product van ten minste twee afzonderlijke effecten: door geneesmiddelen geïnduceerde remming van celproliferatie en activering van celdood2. Helaas, hoewel celdood een cruciaal kenmerk is dat nodig is voor duurzame medicijnresponsen, slagen standaardbenaderingen er niet in om de mate waarin een medicijn celdood activeertte verduidelijken 3.

Veel voorkomende tests voor geneesmiddelrespons zijn tests die cellen rechtstreeks tellen (bijv. Coulter Counter, sommige toepassingen van flowcytometrie of microscopie), het vermogen van cellen om te prolifereren kwantificeren (bijv. kolonievormingstest) of een metabole activiteit kwantificeren (bijv. CellTiter-Glo, tetrazolium gebaseerde MTT- of MTS-assays). Een gemeenschappelijk kenmerk van deze tests is dat de gegenereerde gegevens evenredig zijn met het aantal levende cellen. Omdat geneesmiddelen aanzienlijk verschillen in de manier waarop ze groeiremming en celdood coördineren, geeft het aantal levende cellen na blootstelling aan geneesmiddelen een onbetrouwbaar inzicht in het niveau van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood3. Bovendien, omdat kankercellen zich over het algemeen snel vermenigvuldigen in celcultuur, kan het aantal levende cellen drastisch worden verminderd ten opzichte van de onbehandelde populatie zonder celdood te veroorzaken4. Een centrale tekortkoming is dus dat de mate van celdood niet kan worden gekwantificeerd zonder zowel het aantal levende als dode cellen te meten.

Het kwantificeren van het aantal dode cellen na blootstelling aan geneesmiddelen is om verschillende redenen een uitdaging om nauwkeurig te doen: 2. Ten eerste bestaan er meer dan een dozijn gereguleerde celdoodroutes 5,6,7,8. Hoewel er over het algemeen biochemische markers bestaan voor het identificeren van elk type gereguleerde celdood, variëren deze markers in hun specificiteit en kan geen enkele test worden gebruikt om alle subtypes van de dood tegelijkertijd te kwantificeren. Ten tweede kan de timing van activering voor elke vorm van celdood behoorlijk dramatisch variëren, afhankelijk van de context, dus een volledig beeld kan niet ontstaan tenzij de dood in de loop van de tijd wordt gekwantificeerd 9,10. Veel biochemische tests voor het kwantificeren van celdood produceren een eindpuntmeting, dus het genereren van kinetische gegevens kan een uitdaging zijn en beperkt door de kosten. Een derde complicatie is dat de dode cel zelf een voorbijgaande tussentoestand is tussen de levende celtoestand en gedissocieerde celresten. De stabiliteit van dode cellen varieert afhankelijk van het subtype dood, waarbij sommige typen, zoals apoptose, relatief stabiele lijken creëren, terwijl andere soorten dood snelle lysis veroorzaken. Methoden voor het kwantificeren van de dood die het verzamelen en tellen van dode cellen vereisen, zullen dus ook een vertekend begrip van celdood opleveren. Ten slotte is een vierde beperking dat biochemische tests die de mate van celdood kwantificeren, doorgaans geen inzicht geven in hoe een medicijn de proliferatie verandert. De totale bevolkingsomvang - en, belangrijker nog, of de bevolking toeneemt of krimpt - kan dus niet worden geïnterpreteerd.

Sommige op microscopie gebaseerde assays, zoals STACK en SPARKL, zijn effectief in het meten van levende en dode cellen in de loop van de tijd, en deze assays kunnen uitgebreide inzichten opleveren over door geneesmiddelen geïnduceerde celdood10,11. Deze tests vereisen echter gespecialiseerde instrumenten, zoals de Incucyte-microscoop, waardoor beperkingen ontstaan in doorvoer en toegang tot deze benaderingen. Bovendien vereisen op microscopie gebaseerde technieken dat dode cellen gedurende de hele duur van het experiment in het brandvlak van de microscoop blijven, waardoor het vermogen om dode cellen te kwantificeren in het gedrang komt wanneer ze de hechting van de plaat verliezen of na verloop van tijd als dode cellen vervallen. Evenzo worden op microscopie gebaseerde assays geconfronteerd met uitdagingen wanneer ze worden toegepast in de context van suspensieculturen, aangezien cellen in en uit een bepaald brandvlak drijven.

Om de hierboven genoemde problemen aan te pakken, hebben we een test gegenereerd met de naam FLICK (Fluorescence-based and Lysis-dependent Inference of Cell Death Kinetics)12,13. Het doel van de FLICK-test is om het niveau van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te bepalen, ongeacht hoe de cellen afsterven. De FLICK-methode maakt gebruik van celonbedoelde kleurstoffen, waarvan de fluorescentie afhankelijk is van DNA-binding. Een belangrijk kenmerk van FLICK is het gebruik van deze fluoroforen om de accumulatie van dode cellen in de loop van de tijd te labelen op grond van hun toegankelijke DNA, gevolgd door een lysis op basis van mechanische reinigingsmiddelen om alle levende cellen aan het einde van de test te permeeren. Deze gegevens, gecombineerd met wiskundige modellering, maken het mogelijk om zowel levende als dode celpopulaties te kwantificeren met een continue temporele resolutie en zonder dat het verzamelen of hanteren van dode cellen nodig is. Bovendien maakt het gebruik van een plaatlezer om de fluorescentie van dode cellen te evalueren het mogelijk dode cellen te evalueren zonder dat dode cellen intact hoeven te blijven, waardoor de vooringenomenheid tegen necrotische vormen van dood die leiden tot celruptuur wordt verlicht. Ten slotte vereist de FLICK-test minimale plaatbehandeling en kan deze snel kinetische metingen genereren, waardoor een high-throughput screening van geneesmiddelen mogelijk is. In dit protocol richten we ons op het gebruik van de FLICK-test, inclusief hoe FLICK kan worden gebruikt om de door geneesmiddelen geïnduceerde groeisnelheid, het sterftecijfer en/of de mechanismen van celdood af te leiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Optimalisatie van de permeabilisatietijd voor elke interessante cellijn

OPMERKING: De beschreven volumes en hoeveelheden zijn voor het optimaliseren van één cellijn. Deze waarden moeten worden opgeschaald op basis van het aantal cellijnen dat moet worden getest.

  1. Plaats het gewenste aantal cellen in elk putje van een plaat met 96 putjes, optische bodem en zwarte wand. Voeg 100 μL volledig medium toe en laat de cellen een nacht aan de plaat hechten.
    OPMERKING: Het aantal geplateerde cellen moet worden geoptimaliseerd met inachtneming van de groeisnelheid van de cellen, optimale dichtheden en de lengte van de test. Typische startcelaantallen voor aanhangende kankercellijnen, gemeten over 72 uur, zijn 1500 - 5000 cellen per putje. U2OS-cellen kunnen bijvoorbeeld worden geplateerd met 2000 cellen per putje in DMEM met 10% FBS, 2 mM glutamine en 1% Pen-Strep en 's nachts worden gekweekt onder standaardomstandigheden (5% CO2, 37 °C, met vochtigheid).
  2. Bereid in een conische centrifugebuis van 15 ml 1,5 ml van een 1,5% oplossing van Triton-X in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vortex de 1,5% Triton-X oplossing gedurende 5 s op maximale snelheid. Plaats in een waterbad van 37 °C gedurende minimaal 30 minuten.
  3. Inspecteer de oplossing visueel om er zeker van te zijn dat Triton-X volledig is opgelost door middel van vortex gedurende enkele seconden. Zorg ervoor dat de oplossing homogeen is.
  4. Voeg 10 μL van de 1,5% Triton-X-oplossing toe aan elk putje van de geplateerde cellen. Niet mengen.
    OPMERKING: In dit stadium is het niet wenselijk om te mengen door herhaaldelijk te pipetteren vanwege de vorming van luchtbellen.
  5. Breng de cellen terug naar de 5% CO2, 37 °C met een vochtigheidscelkweekincubator gedurende ten minste 1 uur.
    OPMERKING: Na toepassing van de Triton-X-oplossing zijn de meeste cellijnen in 2-3 uur volledig gelyseerd. Wachten tot 24 uur heeft een minimale invloed op het fluorescentiesignaal bij gebruik van kleurstoffen zoals SYTOX Green. Het verhogen van het percentage Triton-X kan de incubatietijd van moeilijk te lyseren cellijnen verkorten.
  6. Observeer celmorfologieën op een lichtmicroscoop met behulp van een 10x objectief. Inspecteer cellen eenmaal per uur totdat cellichamen niet meer zichtbaar zijn. Noteer de tijd die nodig is voor celpermeabilisatie.
    OPMERKING: Als er een fluorescerende microscoop beschikbaar is, kan lysis worden gevisualiseerd met behulp van een celondoorlatende DNA-kleurstof, zoals SYTOX Green. De kleurstof kan in een 10x eindconcentratie worden toegevoegd aan de Triton-X-oplossing en permeabilisatie kan worden bevestigd door fluorescentiemicroscopie.

2. Selectie en kalibratie van DNA-kleuring

OPMERKING: Een vereiste voor de FLICK-test is het gebruik van een door cellen veroorzaakte fluorofoor die een signaal uitzendt op een DNA-bindende afhankelijke manier, geen invloed heeft op de levensvatbaarheid van de cel en een signaal produceert dat lineair schaalt met het celaantal. Dit protocol maakt gebruik van SYTOX Green. Andere kleurstoffen met vergelijkbare eigenschappen kunnen ook geschikt zijn voor de FLICK-test, maar deze moeten elk worden geëvalueerd en gekalibreerd. Zie Tabel 1 voor voorbeelden.

  1. Bepaal voor de geselecteerde DNA-kleurstof het te testen concentratiebereik op basis van de aanbeveling van de fabrikant.
  2. Voor elke te testen concentratie platen 40.000 cellen in 180 μL celkweekmedium in drievoud langs de meest linkse kolom van een 96-wells, optische bodem, zwartwandige plaat. Voeg 90 μL medium toe aan de overige putjes.
    OPMERKING: Dit wordt gebruikt om een lineaire celtitratie over de rijen van de plaat te genereren. De uiteindelijke concentratie van de eerste putten zal 20.000 cellen/put zijn. Optische bodemplaten zijn niet vereist voor plaatlezers die fluorescentie vanaf de bovenkant van de put lezen. Het celkweekmedium moet hetzelfde medium zijn dat wordt gebruikt voor het kweken van de geteste cellen. Als bijvoorbeeld U2OS-cellen worden gebruikt, moeten 40.000 cellen opnieuw worden gesuspendeerd in 180 μL DMEM.
  3. Maak met behulp van een meerkanaalspipet een seriële verdunning van 1:2 door 90 μl over te brengen van de meest linkse kolom naar de aangrenzende kolom rechts. Pipet 15x om te mengen.
  4. Herhaal stap 2.3, ga van de tweede kolom naar de derde kolom, dan van de derde kolom naar de vierde kolom, enzovoort. Bewerk de titratie in de voorlaatste kolom van de plaat. Laat de laatste kolom zonder cellen staan, zodat het achtergrondsignaal van celkweekmedia kan worden verkregen.
  5. Verwijder voor de voorlaatste kolom 90 μL, zodat alle putjes 90 μL medium hebben met een gevarieerd aantal cellen. Laat de cellen 6 uur hechten in een celkweekbroedmachine van 37 °C.
  6. Bereid een 10x oplossing van DNA-kleurstof voor elke concentratie van de te testen kleurstof, waarbij de DNA-kleurstof wordt verdund tot volledige groeimedia die worden gebruikt voor het kweken van de cellen van belang. Bereid 1,5 ml van een 1,5% Triton-X-oplossing in PBS, zoals beschreven in stap 1.
  7. Voeg aan elk putje van de plaat met 96 putjes 10 μL van de 10x DNA-kleurstof toe. Voeg 10 μL 1,5% Triton-X-oplossing toe aan elk putje om de cellen te permeeren. Incubeer cellen in deze oplossing voor de optimale tijd, die in stap 1 is bepaald.
    OPMERKING: Na de toevoeging van Triton-X is de uiteindelijke concentratie van DNA-kleurstof iets minder dan 1x, maar dit is onbelangrijk. Na incubatie moet de hele plaat worden gelyseerd. De handmatige celtitratie zal worden gebruikt om de optimale DNA-kleurstofconcentratie en de optimale instellingen voor het verkrijgen van fluorescentie te identificeren.
  8. Meet de fluorescentie-intensiteit over de hele celtitratieplaat. Kwantificeer fluorescentie over een reeks acquisitie-instellingen zoals beschreven door de fabrikant van de DNA-kleurstof. Afhankelijk van de gebruikte plaatlezer kunt u de excitatie- en emissiegolflengten en/of de digitale versterking wijzigen.
  9. Verwijder het achtergrondsignaal van elke meting door het gemiddelde signaal van de kolom zonder cellen af te trekken. Deze waarden zijn te vinden in de meest rechtse kolom van putjes op de seriële verdunningsplaat.
  10. Bepaal de lineariteit van elke concentratie DNA-kleurstof voor elke acquisitie-instelling. Lineariteit kan worden bepaald door het celnummer in een grafiek te zetten tegen het fluorescentiesignaal en lineaire regressie uit te voeren. De bepalingscoëfficiënt (r2) geeft de mate aan waarin het fluorescentiesignaal lineair gerelateerd is aan het aantal cellen.
  11. Kies de acquisitie-instellingen en de DNA-kleurstofconcentratie met de beste combinatie van lineariteit en dynamisch bereik.
    OPMERKING: Beschouw het volledige bereik van celnummers van 0 tot 20.000 cellen. Zorg ervoor dat de versterking en de DNA-kleurstofconcentratie lineair zijn bij lage celaantallen, tussen 0 en 1000 cellen. Verschillende instrumentinstellingen of DNA-kleurstofconcentraties kunnen een sterke correlatie over het hele bereik opleveren. Het is echter essentieel dat de gevoeligheid bij lage tonen robuust is, zodat kleine veranderingen in dode cellen nauwkeurig kunnen worden gemeten.

3. Celplating, toepassing van het geneesmiddel in de put en fluorescentiemeting van dode cellen in de loop van de tijd in met geneesmiddelen behandelde platen

OPMERKING: Verdunningsplaten voor geneesmiddelen kunnen flexibel worden ontworpen op basis van experimentele behoeften. Over het algemeen bevatten verdunningsplaten voor geneesmiddelen een log- of semi-log-verdunningsreeks van een of meer geneesmiddelen.

  1. Overweeg de optimale lay-out van de beplating voor het experiment. Vermijd metingen van de buitenste putten van een plaat met 96 putjes om het geluid dat gepaard gaat met groeivariatie te verminderen, aangezien de buitenste putjes verschillende temperaturen, oxygenatie en verdamping ervaren in vergelijking met de binnenste putjes van de plaat.
    OPMERKING: Door controles in het hele landschap van de plaat op te nemen, wordt de robuustheid van de groeigegevens vergroot. Overweeg om controleputjes in het midden en de randen van de plaat op te nemen.
  2. Bepaal het aantal platen dat nodig is voor het experiment. Voeg een extra plaat toe die aan het begin van de test moet worden gelyseerd om het gemiddelde celaantal per putje op het moment van drogeren vast te stellen (d.w.z. de T0-controleplaat).
  3. Bereid een celsuspensie voor in volledige groeimedia.
    1. Bepaal op basis van het aantal platen dat nodig is voor het experiment (berekend in stap 3.2) het volume van de benodigde celsuspensie. Bij het zaaien van platen van 90 μL per putje is ongeveer 10 ml per plaat nodig. Vermenigvuldig het aantal benodigde platen met 10 ml.
      OPMERKING: Het is wenselijk om dit volume te verhogen om rekening te houden met het dode volume van het reservoir en het volumeverlies tijdens het pipetteren. Het berekende volume kan bijvoorbeeld worden vermenigvuldigd met 1,2.
    2. Tel cellen en bereid een celverdunning voor op basis van het gewenste aantal cellen per putje. Als u bijvoorbeeld 2000 cellen wilt zaaien in 90 μL media per putje van een plaat met 96 putjes, berekent u voor in totaal 3 platen het totale aantal cellen dat nodig is voor het experiment als volgt:
      figure-protocol-1
      Evenzo, als de getelde celsuspensie 400.000 cellen/ml is, zou het volume van de celsuspensie dat nodig is voor het experiment zijn:
      figure-protocol-2
    3. Corrigeer het volume van de celkweekmedia die voor het plateren worden gebruikt door het volume van de getelde celsuspensie af te trekken die moet worden opgeteld.
      36 ml media - 2 ml celsuspensie = 34 ml gecorrigeerd mediavolume
  4. Meng de getelde celsuspensie met het juiste mediavolume met behulp van een serologische pipet. Breng deze celsuspensie over naar een reagensreservoir met V-bodem.
  5. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 90 μl van de celsuspensie toe aan elk putje van de platen met 96 putjes. Meng de celsuspensie in het reagensreservoir regelmatig door herhaaldelijk te pipetteren met een serologische pipet om ervoor te zorgen dat de gewenste celconcentratie per volume behouden blijft.
  6. Laat de cellen een nacht hechten in een celkweekbroedmachine van 37 °C (meestal 12-24 uur).
  7. Bereid een 1,5% Triton-X-oplossing in PBS, zoals beschreven in stap 1. Het volume van deze oplossing moet voldoende zijn om alle platen te lyseren. Ongeveer 1,5 ml 1,5% Triton-X in PBS is voldoende om één plaat met 96 putjes te lyseren.
    OPMERKING: De 1,5% Triton-X-oplossing in PBS is meer dan een week stabiel en kan voor het gemak van tevoren worden gemaakt.
  8. Bepaal de hoeveelheid celkweekmedia die nodig is voor het maken van een verdunningsplaat voor geneesmiddelen. Bereid medicijnverdunningsplaten voor in doorzichtige platen met U- of V-bodem en 96 putjes.
    1. Om ervoor te zorgen dat het volume van het verdunde geneesmiddel voldoende is voor het experiment, verhoogt u het minimaal vereiste volume om rekening te houden met volumeverlies tijdens het pipetteren. Als er bijvoorbeeld geneesmiddelen in 10 μl moeten worden toegevoegd aan elk putje van een plaat met 96 putjes en het experiment omvat drie platen, is 30 μl verdund geneesmiddel per putje vereist. Bereid 40-50 μL gedrogeerde media per putje voor om volumeverlies op te vangen. Voeg 1,5 ml toe aan het mediavolume dat nodig is om rekening te houden met de media die nodig zijn voor de T0-bedieningsplaat.
  9. Bereid een 10x concentratie van de geselecteerde DNA-kleurstof voor in volledige groeimedia. Deze concentratie is gebaseerd op de concentratie die in stap 2.11 is geselecteerd. Het totale volume van deze oplossing wordt berekend in stap 3.8.
  10. Gebruik de DNA-kleurstof + groeimedium uit stap 3.9 om een 10x concentratie van elk te testen medicijn voor te bereiden. Maak alleen de hoogste dosis van elk geneesmiddel in de verdunningsplaat van het geneesmiddel en verdun de geneesmiddelen serieel met een meerkanaals pipet, waarbij u 15x tussen elk putje mengt.
    OPMERKING: Bij het maken van de hoogste dosis voor een bepaald geneesmiddel in de verdunningsplaat van het geneesmiddel, moet het volume van het geneesmiddel worden verantwoord om er zeker van te zijn dat de concentratie nauwkeurig is.
  11. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 10 μL geneesmiddel + DNA-kleurstofoplossing uit stap 3.10 toe aan de platen met cellen.
    OPMERKING: Voor verdunningsplaten voor geneesmiddelen waarin een seriële verdunning is gemaakt, als geneesmiddelen aan de cellen worden toegevoegd, beginnend met de laagste concentratie van het geneesmiddel en werkend tot de hoogste concentratie, hoeven de uiteinden van de meerkanaalspipet niet te worden vervangen. De tips op de meerkanaalspipet moeten echter worden vervangen tussen elke plaat en wanneer de tips zijn gebruikt in een putje dat een ander geneesmiddel of een hogere concentratie van het geneesmiddel bevat.
  12. Lees de fluorescentie af voor alle plaatjes waarin medicijnen zijn toegevoegd. Deze fluorescentiewaarde is de T0-waarde (d.w.z. dode cellen op tijd = 0 uur).
  13. Plaats de platen terug in de couveuse na het uitvoeren van de T0-fluorescentiemeting.
  14. Voeg 10 μl van de 10x DNA-kleurstofoplossing die is gemaakt in stap 3.9 en 10 μl van de 1,5% Triton-X-oplossing in stap 3.7 toe aan de T0-controleplaat. Plaats deze plaat terug in de broedmachine gedurende de tijd die in stap 1.8 is geselecteerd.
  15. Lees het T0-regelplaatje af zodra de cellen volledig zijn gelyseerd, zoals beschreven in stap 1.6.

4. Meet de fluorescentie van dode cellen in de loop van de tijd voor met medicijnen behandelde platen

NOTITIE: Minimaliseer de tijd dat de platen uit de couveuse zijn. Langdurige temperatuurveranderingen kunnen de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden en blootstelling aan licht kan DNA-fluoroforen, zoals SYTOX Green, in gevaar brengen.

  1. Verkrijg elke 3-4 uur na het drogeren fluorescentiemetingen voor alle met medicijnen behandelde platen. Platen hoeven niet 's nachts te worden gelezen, tenzij een zeer nauwkeurige doodskinetiek vereist is.
    OPMERKING: Tijdstippen hoeven niet met vaste/standaardtussenpozen te worden genomen. Over het algemeen kunnen tijdstippen uitsluitend tijdens normale werkuren worden genomen zonder fouten te veroorzaken in de stroomafwaartse analyse van de doodskinetiek. De kinetiek kan worden afgeleid zolang sommige metingen worden gedaan in de periode vóór het begin van de dood, tijdens de stijgende fase van de dood en tijdens de verzadigings-/plateaufase.
  2. Verkrijg op het gewenste eindtijdstip een fluorescentiemeting. Voeg onmiddellijk daarna 10 μl van de 1,5% Triton-X-oplossing toe die in stap 3.7 is bereid om de cellen te lyseren.
  3. Plaats de platen terug in de broedmachine en laat de cellen permeabiliseren gedurende de tijd die in stap 1 is bepaald.
  4. Verkrijg fluorescentiemetingen na permeabilisatie. Deze fluorescentiewaarde is evenredig met het totale aantal cellen (d.w.z. levende + dode cellen) voor elk putje.

5. Bereken de kinetiek van de dodelijke breuk

OPMERKING: Berekeningen die in dit protocol worden beschreven, kunnen in elk formaat of elke software worden geanalyseerd. Het gebruik van een programmeeromgeving zoals MATLAB, R of Python zorgt echter voor snellere en flexibelere analyses.

  1. Bereken de gemiddelde fluorescentiewaarden van de T0-regelplaat met behulp van het 50% bijgesneden gemiddelde. Deze waarde is evenredig met het totale aantal cellen voorafgaand aan het drogeren.
  2. Bereken met behulp van curve-fitting en een exponentiële groeifunctie de kinetiek van de bevolkingsgroei voor alle putten in het experiment. De initiële populatiegrootte voor elke put is de gemiddelde T0-fluorescentiewaarde berekend in stap 5.1. De uiteindelijke populatiegrootte voor elke put is de post-permeabilisatiewaarde berekend in stap 4.4. De duur van de test is van 0 uur tot het testeindpunt dat in stap 4.4 is geselecteerd.
  3. Bereken met behulp van de groeiparameters die in stap 5.2 zijn bepaald het totale aantal cellen op elk gemeten tijdstip in de test voor elk putje. Bepaal het aantal levende cellen op elk gemeten tijdstip door de meting van dode cellen af te trekken van het totale aantal cellen dat in stap 5.2 is berekend.
    OPMERKING: Vanwege kleine hoeveelheden ruis in de test kan het aantal levende cellen af en toe een klein negatief getal zijn. Dit kan handmatig op 0 worden gezet, omdat er geen negatief aantal levende cellen kan zijn en hoogstwaarschijnlijk aangeeft dat alle cellen in die put dood waren.
  4. Bereken de letale fractie (LF) voor elk tijdstip door het fluorescentiesignaal van dode cellen te delen door het totale celsignaal voor elk tijdstip.
  5. Pas een Lag Exponential Death (LED)-vergelijking aan op de verloopgegevens van de lethalle breuktijd10. Om willekeurige kinetische parameters te vermijden voor doses van een geneesmiddel die geen significante letaliteit veroorzaken, past u een lineair model aan met een helling gelijk aan 0. Bepaal significante niveaus van dodelijkheid op basis van de ruis in de test of de LF die wordt waargenomen voor onrobuuste omstandigheden.
  6. Noteer de aanvangstijd van de dood (DO) uit de LED-vergelijking. De LED-vergelijking heeft vier parameters: de initiële LF (LFi), de LF op plateau (LFp), het initiële sterftecijfer (DR) en de DO. Leid deze parameters af uit de gegevens met behulp van een niet-lineaire regressie (d.w.z. curve-aanpassing).
  7. Bereken de fractionele levensvatbaarheid (FV) op het testeindpunt voor elk geneesmiddel bij elke dosis. Trek de LF-waarde van het eindpunt af van 1 of deel het aantal levende cellen door het totale aantal cellen.
    OPMERKING: FV kan op elk tijdstip worden berekend, niet alleen op het eindpunt van de analyse. Deze gegevens worden gebruikt om de dosisfarmacologie te evalueren (bijv. geneesmiddel IC50 of EC50).

6. Bereken de GR-waarde

  1. Bepaal het gemiddelde aantal levende cellen voor elk putje aan het begin van de test. Bereken deze waarde met behulp van de post-permeabilisatie T0-waarde berekend in stap 3.15 en aftrek van de T0-waarde voor elke put, die is verzameld in stap 3.12. In de onderstaande GR-vergelijking (stap 6.3) wordt deze waarde aangeduid als x0.
    OPMERKING: Af en toe kan de hoogste dosis van een medicijn de fluorescentiewaarde van de DNA-kleurstof verstoren. Het kan wenselijk zijn om het gemiddelde aantal levende cellen op tijdstip 0 te berekenen met behulp van de controleputjes.
  2. Bepaal voor de controleputjes (xctrl) het gemiddelde aantal levende cellen voor elk putje op het analyse-eindpunt. Bepaal het gemiddelde aantal levende cellen op het testeindpunt voor elke met geneesmiddelen behandelde aandoening (x(c)).
    OPMERKING: Afhankelijk van de variatie in celgroei over de plaat, kunnen verschillende xctrl-waarden worden gebruikt voor normalisatie van elk putje. Als de xctrl-waarden bijvoorbeeld systematisch over de plaat variëren, kan het wenselijk zijn om de dichtstbijzijnde xctrl-waarde te gebruiken in plaats van de gemiddelde xctrl-waarde van de plaat.
  3. Bereken voor elke met een geneesmiddel behandelde put de genormaliseerde groeisnelheidsinhibitiewaarde (GR) met behulp van de volgende vergelijking4:
    figure-protocol-3
    Voer curve-aanpassing uit met behulp van een logistische regressie met 4 parameters. GR staat op een schaal van -1 tot 1.

7. Bereken door geneesmiddelen geïnduceerde groei- en sterftecijfers met behulp van de GRADE-methode

OPMERKING: GR vertegenwoordigt de netto bevolkingsgroeisnelheid, niet de werkelijke celproliferatiesnelheid. De door drugs geïnduceerde bevolkingsgroei en sterftecijfers kunnen worden berekend met behulp van een combinatie van de GR en de letale fractie (LF).

  1. Bepaal de verdubbelingstijd (τ) van de cellijn tijdens het experiment met behulp van het gemiddelde aantal levende cellen van de T0-controlewaarde (x0), het gemiddelde aantal levende cellen van de controleconditie op het testeindpunt (xctrl) en de lengte van de test in uren (t) om de volgende vergelijking op te lossen:
    figure-protocol-4
    OPMERKING: Nauwkeurige berekening van de celverdubbelingstijd (τ) vereist dat cellen gedurende de hele test continu verdubbelen. Voor cellen die contactremming ervaren, moeten cellen worden gezaaid met startdichtheden die niet samenvloeien tijdens de gewenste testtijd. U2OS heeft bijvoorbeeld een gemiddelde verdubbelingstijd van 24 uur. Het zaaien van 2000 cellen per putje in een 72-uurs test is optimaal voor het interpreteren van hun groeisnelheid.
  2. Bepaal de relatie tussen groei-/sterftecijfers en populatiegrootte. Gebruik hiervoor een geboorte/sterftemodel en een geïnitialiseerde simulatie met alle plausibele paarsgewijze combinaties van groei- en sterftecijfers. Deze simulatie vereist het gemiddelde aantal levende cellen van de T0-controleplaat (x0), de lengte van de test (t) en een door de gebruiker gedefinieerd bereik van plausibele proliferatiepercentages (p) en sterftecijfers (d).
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
    1. Om plausibele waarden voor groeisnelheden te bepalen, begint u met de onbehandelde groeisnelheid in celpopulatieverdubbelingen per uur (1/T) als de hoogste groeisnelheid en 0 als de laagste groeisnelheid. Verdeel dit bereik in 500 segmenten met gelijke afstand. Een soortgelijke operatie kan worden toegepast op het sterftecijfer, waarbij een bereik van 0 tot 1 wordt getest.
      OPMERKING: Alle paarsgewijze combinaties van 500 snelheden kunnen worden uitgevoerd met elke programmeeromgeving, maar kunnen te rekenintensief zijn als u software gebruikt. Door dit terug te brengen tot alle paarsgewijze combinaties van 50 groei- en sterftecijfers kan dit probleem worden verlicht, met een vermindering van de precisie van de gevolgtrekking. Bij dit protocol is een spreadsheet template voorzien.
  3. Bepaal de GR- en LF-waarden (hierboven beschreven) voor elk gesimuleerd proliferatie- (p) en sterftecijferpaar (d).
    OPMERKING: Stappen 7.2-7.3 genereren een tabel die elk theoretisch paar proliferatie- en sterftecijfers bevat, met de berekende GR- en LF-waarden voor dat theoretische paar. Dit zal fungeren als een opzoektabel om een experimenteel waargenomen paar GR- en LF-waarden te associëren met een paar door geneesmiddelen geïnduceerde proliferatie- en sterftecijfers. Het testen van meer dan 500 discrete waarden voor proliferatie en sterftecijfers zal resulteren in een numeriek nauwkeurigere waarde, maar dit niveau van precisie zal waarschijnlijk de precisie van de test te boven gaan.
  4. Bereken de paarsgewijze afstand tussen elk experimenteel berekend GR/LF-paar en elk theoretisch GR/LF-paar in de opzoektabel. Leid af dat het theoretische paar met de minimale afstand tot het experimenteel waargenomen paar GR/LF-waarden de werkelijke door drugs geïnduceerde proliferatie- en sterftecijfers zijn.

8. Bepaling van doodsroutes met behulp van routeselectieve chemische remmers

OPMERKING: Chemische remmers alleen zijn onvoldoende om het mechanisme van overlijden voor een bepaald medicijn definitief te bepalen. Chemische remmers van doodsroutes moeten worden gebruikt om te bepalen welke biochemische of fenotypische reacties moeten worden onderzocht in latere experimenten, die waarschijnlijk morfologische beoordeling, routespecifieke biochemische markers en evaluatie van genetische afhankelijkheden zullen omvatten.

  1. Optimaliseer de dosis van elke celdoodremmer in de cellijn van interesse door een dosisbereik van remmerconcentraties te testen in de context van een canonieke activator van de betreffende doodsroute(s) (Tabel 2). Idealiter zou de geselecteerde dosis remmer op zichzelf de levensvatbaarheid van de cellen niet moeten beïnvloeden (controleer de GR-metriek).
    OPMERKING: Niet alle cellijnen kunnen alle doodspaden activeren. Biochemische of fenotypische validatie kan nodig zijn bij het testen van activators/remmers van verschillende doodsroutes.
  2. Overweeg de optimale lay-out van de beplating voor een remmerscherm. Om batcheffecten te minimaliseren, moet u elk geneesmiddel op dezelfde plaat houden als de remmer(s) die worden geëvalueerd, met replicaten op afzonderlijke platen.
  3. Zaai het gewenste aantal cellen in elk putje van een plaat met 96 putjes met optische bodem en zwarte wand, vergelijkbaar met stap 3.3. Verlaag het platingvolume tot 80 μl om rekening te houden met de volumes van de remmer en het geneesmiddel.
  4. Bereid 10x overleg van de te testen remmers voor in volledige media en voeg 10 μL toe aan elk putje. Behandel cellen gedurende 2-4 uur met remmers van de doodsroute. Voeg daarna de interessante medicijnen toe en verkrijg fluorescentiemeting, zoals in stap 3-5.
  5. Evalueer de verandering in de aanvangstijd van de dood (DO) en/of de maximale letale fractie om de effectiviteit van de remmer(s) te beoordelen. De DO is een afgeleide parameter uit het Lag Exponential Death (LED)-model. Zie stappen 5.6 - 5.7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol hebben we de gevoeligheid van U2OS-cellen voor de HDAC-remmer Belinostat onderzocht. Deze experimenten werden uitgevoerd met behulp van 2 μM SYTOX Green om dode cellen te labelen (Figuur 1A). Kinetische metingen werden gedaan met behulp van een fluorescerende plaatlezer met een versterkingsinstelling van 130 (Figuur 1B). Cellen werden aan het einde van de test gedurende 2 uur gelyseerd in 1,5% Triton-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De FLICK-test is een robuuste methode voor het genereren van een uitgebreide evaluatie van het effect van een medicijn op de groei en dood van een celpopulatie. Omdat deze methode cellen niet direct telt, zijn kritieke stappen in het protocol het waarborgen van de lineariteit van de test en volledige lysis tijdens de tritonpermeabilisatiestappen. De juiste permeabilisatietijd kan visueel worden geïdentificeerd, zoals aangegeven in dit protocol, of kwantitatief door de fluorescentie van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken alle voormalige en huidige leden van het Lee Lab voor hun bijdragen aan het perspectief van ons lab op het evalueren van medicijnresponsen. Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health aan MJL (R21CA294000 en R35GM152194).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BelinostatApexBioA4612
CamptothecinApexBioA2877
Conical centrifuge tube, 15mLFisher Scientific12-565-269
DMEMCorning10017CVVoor het zaaien en mediceren van cellen
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCVoor het zaaien en mediceren van cellen
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom MicroplateFisher ScientificFB012932Voor het zaaien en mediceren van cellen (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom MicroplateGreiner655090Voor het zaaien en mediceren van cellen
IncuCyte S3Essen BiosciencesElke fase microscoop werkt
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlMATLAB versie R2023b, een licentie is vereist
Microplate fluorescentie lezerTecanSparkVoor het meten van dode cel fluorescentie
PalbociclibApexBioA8316
PBSCorning21-040-CMElke PBS werkt
Spark Multimode Microplate ReaderTecanhttps://www.tecan.com/spark-overviewSparkControl software versie 2.2
Steriele reservoir, 25 mLFisher Scientific13-681-508Voor het zaaien en mediceren van cellen
Sytox Green nucleic acid kleurstofThermo Fisher ScientificS7020DNA kleurstof voor het meten van dode cel fluorescentie
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APVoor het permeabiliseren van cellen
U2OSATCCHTB-96Een voorbeeld van een cellijn die in dit protocol wordt gebruikt
Z-VAD-FMKApexBioA1902
```

Referenties

  1. Hafner, M., Niepel, M., Sorger, P. K. Alternative drug sensitivity metrics improve preclinical cancer pharmacogenomics. Nat Biotechnol. 35 (6), 500-502 (2017).
  2. Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
  3. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An Integrated Analysis of Population Growth and Cell Death Reveals Drug-Specific and Cancer Subtype-Specific Response Profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  4. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 1-11 (2016).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  7. Holze, C., et al. Oxeiptosis, a ROS-induced caspase-independent apoptosis-like cell-death pathway. Nat Immunol. 19 (2), 130-140 (2018).
  8. Maltese, W. A., Overmeyer, J. H. Methuosis Nonapoptotic Cell Death Associated with Vacuolization of Macropinosome and Endosome Compartments. Am J Pathol. 184 (6), 1630-1642 (2014).
  9. Inde, Z., Forcina, G. C., Denton, K., Dixon, S. J. Kinetic Heterogeneity of Cancer Cell Fractional Killing. Cell Rep. 32 (1), 107845(2020).
  10. Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. Systematic Quantification of Population Cell Death Kinetics in Mammalian Cells. Cell Syst. 4 (6), 1-18 (2017).
  11. Gelles, J. D., et al. Single-Cell and Population-Level Analyses Using Real-Time Kinetic Labeling Couples Proliferation and Cell Death Mechanisms. Dev Cell. 51 (2), 277-291.e4 (2019).
  12. Richards, R., et al. Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics. Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).
  13. Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics. STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).
  14. Honeywell, M. E., et al. Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action. Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).
  15. Jannoo, R., Xia, Z., Row, P. E., Kanamarlapudi, V. Targeting of the Interleukin-13 Receptor (IL-13R)α2 Expressing Prostate Cancer by a Novel Hybrid Lytic Peptide. Biomolecules. 13 (2), 356(2023).
  16. Gelles, J. D., Chipuk, J. E. Why not add some SPARKL to your life (and death)! Mol Cell Oncol. 7 (1), 1685841(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Analyse van geneesmiddelresponskwantificering van celdoodremming van de groeisnelheidletale fractiefluorescentieplaatlezerseri le verdunningcelproliferatiedetectie van apoptosedosis respons
Uitgebreide analyse van de geneesmiddelrespons met behulp van de FLICK-test
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.