Dit protocol beschrijft hoe de FLICK-test moet worden gebruikt voor het evalueren van geneesmiddelresponsen, inclusief gedetailleerde instructies voor het gebruik van deze test om de door geneesmiddelen geïnduceerde groeipercentages en sterftecijfers te berekenen en om het mechanisme van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Uitgebreide analyse van de geneesmiddelrespons met behulp van de FLICK-test
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om de werkzaamheid van geneesmiddelen te begrijpen, is het van cruciaal belang om de mate van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te karakteriseren. Pogingen om het niveau van door geneesmiddelen geïnduceerde celdood te kwantificeren, worden uitgedaagd door het bestaan van meer dan een dozijn moleculair verschillende vormen van gereguleerde dood, elk met zijn eigen activeringstiming en biochemische kenmerken. Bovendien worden voor sommige subtypes van necrotische dood de kenmerkende kenmerken slechts vluchtig waargenomen en gaan ze snel verloren als gevolg van celruptuur. Dus, zelfs bij het gebruik van een combinatie van doodsroute-specifieke assays, is het een uitdaging om de totale hoeveelheid celdood of de relatieve bijdragen van elk doodssubtype nauwkeurig te kwantificeren. Een ander probleem is dat veel doodsspecifieke tests negeren hoe medicijnen de celproliferatie beïnvloeden, waardoor het een uitdaging is om te interpreteren of een met medicijnen behandelde populatie zich uitbreidt of krimpt. De FLICK-test maakt het mogelijk om het totale niveau van celdood na stimulatie te kwantificeren op een manier die specifiek is voor de dood, maar ook grotendeels agnostisch is voor het (de) geactiveerde type(n) dood. Bovendien bewaart de FLICK-test informatie over de totale populatiegrootte en de celproliferatiesnelheid. In dit manuscript beschrijven we het basisgebruik van de FLICK-test, hoe problemen met deze test kunnen worden opgelost bij het gebruik van verschillende soorten biologisch materiaal, en hoe de FLICK-test kan worden gebruikt om de bijdragen van elk type celdood aan een waargenomen geneesmiddelrespons te kwantificeren.
Inleiding
Voor geneesmiddelen tegen kanker omvat de preklinische evaluatie van de gevoeligheid van geneesmiddelen over het algemeen het testen hoe geneesmiddelen de levensvatbaarheid van cellen in cultuur1 beïnvloeden. De levensvatbaarheid van cellen na blootstelling aan geneesmiddelen is het product van ten minste twee afzonderlijke effecten: door geneesmiddelen geïnduceerde remming van celproliferatie en activering van celdood2. Helaas, hoewel celdood een cruciaal kenmerk is dat nodig is voor duurzame medicijnresponsen, slagen standaardbenaderingen er niet in om de mate waarin een medicijn celdo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Optimalisatie van de permeabilisatietijd voor elke interessante cellijn
OPMERKING: De beschreven volumes en hoeveelheden zijn voor het optimaliseren van één cellijn. Deze waarden moeten worden opgeschaald op basis van het aantal cellijnen dat moet worden getest.
- Plaats het gewenste aantal cellen in elk putje van een plaat met 96 putjes, optische bodem en zwarte wand. Voeg 100 μL volledig medium toe en laat de cellen een nacht aan de plaat hechten.
OPMERKING: Het aantal geplateerde cellen moet worden geoptimaliseerd met inachtneming van de groeisnelheid van de cellen, optim....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van dit protocol hebben we de gevoeligheid van U2OS-cellen voor de HDAC-remmer Belinostat onderzocht. Deze experimenten werden uitgevoerd met behulp van 2 μM SYTOX Green om dode cellen te labelen (Figuur 1A). Kinetische metingen werden gedaan met behulp van een fluorescerende plaatlezer met een versterkingsinstelling van 130 (Figuur 1B). Cellen werden aan het einde van de test gedurende 2 uur gelyseerd in 1,5% Triton-.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De FLICK-test is een robuuste methode voor het genereren van een uitgebreide evaluatie van het effect van een medicijn op de groei en dood van een celpopulatie. Omdat deze methode cellen niet direct telt, zijn kritieke stappen in het protocol het waarborgen van de lineariteit van de test en volledige lysis tijdens de tritonpermeabilisatiestappen. De juiste permeabilisatietijd kan visueel worden geïdentificeerd, zoals aangegeven in dit protocol, of kwantitatief door de fluorescentie van d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken alle voormalige en huidige leden van het Lee Lab voor hun bijdragen aan het perspectief van ons lab op het evalueren van medicijnresponsen. Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health aan MJL (R21CA294000 en R35GM152194).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Belinostat | ApexBio | A4612 | |
| Camptothecin | ApexBio | A2877 | |
| Conical centrifuge tube, 15mL | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| DMEM | Corning | 10017CV | Voor het zaaien en mediceren van cellen |
| DMSO | Fisher Scientific | MT-25950CQC | Voor het zaaien en mediceren van cellen |
| Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | FB012932 | Voor het zaaien en mediceren van cellen (pin plate) |
| Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Greiner | 655090 | Voor het zaaien en mediceren van cellen |
| IncuCyte S3 | Essen Biosciences | Elke fase microscoop werkt | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | MATLAB versie R2023b, een licentie is vereist |
| Microplate fluorescentie lezer | Tecan | Spark | Voor het meten van dode cel fluorescentie |
| Palbociclib | ApexBio | A8316 | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Elke PBS werkt |
| Spark Multimode Microplate Reader | Tecan | https://www.tecan.com/spark-overview | SparkControl software versie 2.2 |
| Steriele reservoir, 25 mL | Fisher Scientific | 13-681-508 | Voor het zaaien en mediceren van cellen |
| Sytox Green nucleic acid kleurstof | Thermo Fisher Scientific | S7020 | DNA kleurstof voor het meten van dode cel fluorescentie |
| Triton-X 100 | Thermo Fisher Scientific | J66624-AP | Voor het permeabiliseren van cellen |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Een voorbeeld van een cellijn die in dit protocol wordt gebruikt |
| Z-VAD-FMK | ApexBio | A1902 |
Referenties
- Hafner, M., Niepel, M., Sorger, P. K. Alternative drug sensitivity metrics improve preclinical cancer pharmacogenomics. Nat Biotechnol. 35 (6), 500-502 (2017).
- Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
