Het artikel beschrijft een protocol voor het reconstitueren van gepasteuriseerde donormelkmicrobiota met behulp van de eigen melkmicrobiota van de moeder in praktische, real-world omgevingen. Het vertoont effectieve bacteriegroei en microbioommodulatie, wat de haalbare toepassing van deze procedure ondersteunt binnen de routinematige zorg van een kraamkliniek en de bijbehorende moedermelkbank.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geïndividualiseerde reconstitutie van de microbiota van moedermelk: een haalbare aanpak in de praktijk
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Moedermelk (MOM) is de meest complete voedingsbron voor pasgeborenen. In gevallen waarin moeders niet in staat zijn om voldoende melk te produceren of geen borstvoeding kunnen geven, is het voorkeursalternatief gepasteuriseerde donormelk (PDM), die routinematig wordt verstrekt door moedermelkbanken. PDM biedt een superieur scala aan voedings- en immunologische elementen in vergelijking met elke in de handel verkrijgbare formule. Om de bioveiligheid te garanderen, ondergaat PDM echter pasteurisatie, een proces dat de commensale microbiota inactiveert en bepaalde bioactieve stoffen vermindert. Deze studie presenteert een protocol dat is ontworpen om de microbiota van PDM te herstellen met behulp van MOM als microbiële bron, waarbij de aanpak wordt aangepast aan een klinische setting in de echte wereld.
Het protocol werd geïmplementeerd in een klinische proef die werd uitgevoerd in een kraamkliniek en de bijbehorende moedermelkbank, met als doel gepersonaliseerde donormelk te verstrekken aan te vroeg geboren baby's van wie de moeder niet voldoende melk kan produceren. De methodologie omvat het inoculeren van PDM met 10% van de MOM, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 4 uur. Microbiologische analyse toonde succesvolle bacteriegroei aan in de geënte melk (IM) na incubatie, waarbij het microbiotaprofiel van de gereconstitueerde melk (RM) sterk leek op dat van MOM, wat wijst op effectief herstel van de microbiota. Deze resultaten suggereren dat het reconstitutieprotocol haalbaar is voor implementatie in de neonatale zorg, met het potentieel om de nutritionele en immunologische kwaliteit van PDM te verbeteren, waardoor de gezondheid en ontwikkeling van pasgeborenen die geen borstvoeding krijgen, wordt ondersteund.
Inleiding
Moedermelk wordt algemeen erkend als de beste voedingsbron voor pasgeborenen en biedt niet alleen essentiële macro- en micronutriënten, maar ook een complexe reeks elementen, waaronder verschillende metabolieten en componenten van het immuunsysteem, zoals antilichamen, cytokines en cellen1. Bovendien komen de gunstige eigenschappen in moedermelk ook voort uit een gemeenschap van commensale micro-organismen. Al deze elementen van moedermelk spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van de pasgeborene1. De gemeenschap van micro-organismen, bekend als de microbiota, wordt beïnvloed door een combinatie van factoren zoals voeding, levensstijl van de moeder, type bevalling en zwangerschapsduur, waardoor elke melk een microbiota heeft met specifieke kenmerken2. De mechanismen waarmee de microbiota van de moedermelk de neonatale ontwikkeling ten goede komt, variëren van het beschermen van het enterische oppervlak door kolonisatie door commensale bacteriën tot het bevorderen van de rijping van het immuunsysteem door de productie van metabolieten die interageren met immuuncellen in de darm3. Om deze reden maakt het geïndividualiseerde profiel van micro-organismen in elke moedermelk het een vorm van gepersonaliseerde geneeskunde voor pasgeborenen4.
De aanwezigheid van een gezonde microbiota kan de pasgeborene helpen beschermen tegen kolonisatie door potentieel pathogene micro-organismen door de ecologische niche te bezetten en voeding te ondersteunen, vooral voor premature baby's, die kwetsbaarder zijn voor deze externe effecten omdat ze zich in een ziekenhuisomgeving bevinden en een onvolgroeid immuunsysteem hebben. Bovendien hebben moeders die te vroeg bevallen vaak moeite om voldoende melk te produceren voor hun pasgeborenen. De melkproductie is doorgaans lager naarmate de zwangerschapsduur jonger isdan 5 jaar. In deze gevallen is de beste optie voor het voeden van de pasgeborene gepasteuriseerde donormelk die wordt geleverd door Human Milk Banks (HMB)6.
Brazilië heeft het grootste en meest uitgebreide netwerk van HMB's ter wereld7. Dit netwerk verzamelt, bereidt en distribueert meer dan 160.000 L gepasteuriseerde donormelk (PDM) door het hele land zonder kosten voor ouders, via het nationale verenigde gezondheidssysteem (Sistema Único de Saúde), beheerd door het ministerie van Volksgezondheid7. Pasteurisatie is essentieel om de bioveiligheid van de gedoneerde melk voor pasgeborenen te waarborgen. Dit proces wordt meestal uitgevoerd met behulp van de Holder-methode, waarbij een container met rauwe donormoedermelk gedurende 30minuten 6,8 in een waterbad van 62,5 °C wordt ondergedompeld. De resulterende PDM wordt vervolgens gekoeld opgeslagen totdat deze klaar is voor consumptie. Pasteurisatie vermindert echter de levensvatbaarheid van de commensale microbiota van de melk en vermindert de biologische beschikbaarheid van verschillende bioactieve componenten. Dit komt omdat het pasteurisatieproces is gestandaardiseerd om de overdracht van pathogene micro-organismen op de pasgeborene te voorkomen. In deze context beschreven Cacho en collega's in 2017 de mogelijkheid om de commensale microbiota van de eigen melk van een moeder te reconstrueren door deze in verschillende verhoudingen te inoculeren in PDM9. Hun bevindingen toonden aan dat het gebruik van een concentratie van 10% van de eigen moedermelk (MOM) de optimale concentratie is voor het behoud van de oorspronkelijke samenstelling van het MOM-microbioomprofiel. Deze aanpak vermindert het risico op overgroei van specifieke bacteriën, die, hoewel typisch commensale, schadelijk kunnen worden als ze onevenredig aanwezig zijn in de gereconstitueerde melk. In het bijzonder merkte de studie op dat een verdunning van 1:10 (10% MOM + 90% PDM), geïncubeerd gedurende 4 uur, resulteerde in een goed uitgebalanceerde bacteriële belasting - ongeveer 60% van die gevonden in onverdunde MOM - wat wijst op een veiligere en effectievere aanpak. Daarentegen leidden hogere verdunningen, zoals 3:10, tot overmatige bacteriegroei, wat de kritieke behoefte aan gecontroleerde concentraties en omstandigheden benadrukt om de veiligheid te garanderen.
In dit artikel laten we zien dat deze procedure voor het reconstrueren van de moedermelkmicrobiota in PDM kan worden bereikt in praktijksituaties binnen de routinematige zorg van een kraamkliniek en de bijbehorende moedermelkbank.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol werd uitgevoerd als onderdeel van de procedures van een klinische studie uitgevoerd door onze onderzoeksgroep (Brazilian Registry of Clinical Trials, ReBEC RBR-729kr8x), en kreeg de goedkeuring van de ethische commissie (proces CAAE nº 41063520.4.0 000.0121) en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers voorafgaand aan randomisatie en monsterverzameling.
De procedure voor het reconstrueren van de melkmicrobiota wordt in drie stappen uitgevoerd:
1. Rauwe melk van de moeder verkrijgen
LET OP: De procedure voor het verkrijgen van melk is elders te vinden10,11.
- Verkrijg vóór de procedure geïnformeerde toestemming van de moeder volgens de ethische commissie en zorg ervoor dat u alles uitlegt wat er met de moeder zal worden gedaan, waarbij u eventuele twijfels, zorgen, angsten en zorgen over de procedure wegneemt om de moeder ontspannen te houden.
- Laat de moeder melk afkolven met behulp van een elektrische borstkolf in een gesteriliseerde container onder toezicht van de verpleegkundige die verantwoordelijk is voor de afdeling, volgens de vastgestelde lokale hygiënenormen van elke kraamafdeling.
- Label na het verzamelen de container met de melk met de gegevens, datum en tijd van ophalen van de moeder. Bewaar de eigen moedermelk (MOM) maximaal 12 uur op een temperatuur van -4 °C of lager.
2. Ontdooien van gepasteuriseerde donormelk (PDM)
OPMERKING: De HMB's hebben hun eigen voorraad PDM, ingevroren bij een temperatuur onder -4 °C voor een periode van maximaal 6 maanden, en de procedure is goed beschreven in de literatuur elders 12,13,14.
- Ontdooi rauwe melk of PDM bewaard in gesteriliseerde glazen containers met plastic deksel in een waterbad bij 40 °C, wat zorgt voor temperatuurbehoud en een kortere verwerkingstijd.
NOTITIE: Ontdooi PDM niet bij kamertemperatuur of bij koeltemperatuur (in de koelkast), aangezien de ontdooitijden in deze gevallen worden verlengd, wat de blootstelling en groei van microben bevordert. - Haal de flessen moedermelk uit het waterbad voordat de melk in de fles een temperatuur van meer dan 5 °C bereikt.
3. Inenting van PDM met MOM voor reconstitutie van het microbioom
OPMERKING: De standaard volumetrische verhouding voor het proces van inoculatie van PDM met MOM is 90%: 10% (v/v). De stappen van de procedure zijn als volgt:
- Instrueer de technicus om een laboratoriumjas, masker, pet en handschoenen te dragen.
- Reinig het werkoppervlak met een oppervlaktereinigingsoplossing volgens het lokale institutionele protocol.
- Rangschik de te gebruiken materialen en bereid de apparatuur voor. Verwarm de broedmachine (waterbad) met water voor op 37 °C.
- Plan de uiteindelijke hoeveelheid geëoculeerde melk die moet worden gebruikt en kies een container van de juiste grootte. Plaats de container met verse rauwe MOM en de PDM in vloeibare vorm op het werkblad.
- Verzamel een aliquot van maximaal 1 ml van de MOM met behulp van steriele apparatuur voor daaropvolgende 16S-sequencing en bacterietelling. Bewaar het aliquot in een DNase/RNase-vrije cryobuis bij -80 °C.
- Breng het resterende volume, dat overeenkomt met 10% van het uiteindelijke gewenste volume melk, met behulp van een steriel volumetrisch instrument (bv. spuit, pipet) over in een voedselveilige container om te worden ondergedompeld in een waterbad bij 37 °C.
- Verzamel een aliquot van 1 ml van de PDM met behulp van steriele apparatuur voor daaropvolgende 16S-sequencing en bacterietelling. Bewaar het aliquot in een DNase/RNase-vrije cryobuis bij -80 °C.
- Breng een hoeveelheid PDM over die overeenkomt met 90% van het uiteindelijke gewenste volume melk met behulp van een steriel volumetrisch instrument (bijv. spuit, pipet) naar de container met de MOM uit de vorige stap, die nu de geïnoculeerde moedermelk (IM) vormt.
- Sluit de container af met een deksel dat voorkomt dat externe vloeistof de binnenkant van de fles vervuilt en dompel deze gedurende 4 uur onder in het waterbad bij 37 °C zodat de in de melk geëoculeerde micro-organismen zich kunnen vermenigvuldigen.
- Verwijder na 4 uur de container met de gefermenteerde IM uit het waterbad, nu gereconstitueerde melk (RM) genoemd.
- Reserveer een hoeveelheid van maximaal 1 ml met behulp van steriele apparatuur voor daaropvolgende 16S-sequencing en bacterietelling. Bewaar de aliquot in een DNase/RNase-vrije cryobuis bij -80 °C.
- Breng het resterende volume over naar een ontsmette container voor het voeden van pasgeborenen.
4. Validatie van de methode door bacteriekweek op platen
OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd om besmetting te voorkomen en de nauwkeurigheid van de verdunningen te garanderen. Bacteriegroei kan worden geschat met behulp van methoden die elders worden beschreven 9,15.
- Bereid seriële verdunningen van elk melkmonster (PDM, MOM, IM, RM) in steriele zoutoplossing in concentraties van 10-1, 10-2, 10-3 en 10-4 . Meng elke verdunning grondig om een uniforme bacterieverdeling te garanderen.
- Pipetteer en verdeel 100 μL van elk verdund monster in drievoud op Man-Rogosa-Sharpe (MRS) en Mannitol Salt Agar (MSA) platen, met behulp van een steriele Drigalski-lus of glasspreider. Zorg ervoor dat het volume gelijkmatig over de agarplaat wordt verdeeld.
- Incubeer MRS-agarplaten in een anaërobe pot die een zuurstofarme omgeving bevat voor de groei van melkzuurbacteriën.
- Incubeer Mannitol Salt Agar (MSA) platen aëroob om de groei van Staphylococcus-soorten te ondersteunen.
- Incubeer de platen bij 37 ± 2 °C gedurende 48-72 uur.
- Selecteer de verdunning met een telbaar aantal bacteriekolonies (25-250 kolonies) op elk type agar
- Tel de zichtbare kolonies op elk van de drie duploplaten voor de geselecteerde verdunning.
- Bereken het gemiddelde aantal kolonies op basis van drievoudige platen voor de geselecteerde verdunning in zowel MRS- als MSA-media.
- Bepaal het aantal kolonievormende eenheden (CFU) per ml voor elk monster met behulp van de volgende formule en converteer naar een logaritmische schaal met grondtal 10 (log10) om de interpretatie te vergemakkelijken. Ga verder met statistische analyse van de resultaten.
Aantal CFU/ml = Aantal kolonies × totale verdunningsfactor/volume verguld in ml
5. Analyse van het melkmicrobioom
OPMERKING: De analyse van het melkmicrobioom kan worden uitgevoerd volgens de methoden en pijplijn die elders zijn beschreven16. Een screenshot van het R-script dat in deze analyse is gebruikt, wordt weergegeven in aanvullende figuur S1.
- Centrifugeer 500 μL van het monster gedurende 15 s bij 180 × g tot sedimentcellen en deeltjes.
- Verzamel 350 μL van het bovenstaande en gebruik het voor DNA-extractie.
- Kwantificeer het geëxtraheerde DNA met behulp van een spectrofotometer.
- Amplificeer de V3- en V4-regio's van het 16S-ribosomale RNA met behulp van 20 ng DNA en primers 357F/805R (zie materiaaltabel)17.
- Gebruik magnetische kralen om de resulterende amplicons te zuiveren en kwantificeer amplicons met barcode met behulp van een DNA-fluorimeter.
- Rangschik de amplicons in de gepaarde 250 bp-modus.
- Verwerk de resulterende sequenties door kwaliteitstrimmen en adapterverwijderinguit te voeren 18. Gebruik de paired-end-modus (PE) met Phred33-score en stel een minimale leeslengte van 200 bp in om leessnelheden van hoge kwaliteit te garanderen.
- Importeer sequentiegegevens met gepaarde uiteinden in QIIME 219 met behulp van een manifest-bestandsindeling en de opdracht: qiime tools importeren.
- Verwerk de geïmporteerde sequenties met DADA2 voor het verwijderen van ruis, dereplicatie en het verwijderen van chimaera's met behulp van de opdracht: qiime dada2 denoise-paired. Deze stap genereert representatieve sequenties van hoge kwaliteit en een functietabel.
- Filter functies en sequenties om alleen die functies met voldoende vertegenwoordiging te behouden met behulp van de opdrachten: qiime feature-table filter-features en qiime feature-table filter-seqs.
- Bereid een referentiedatabase voor door regio's te extraheren die zijn versterkt door de primers (V3-V4) met behulp van: qiime feature-classifier extract-reads.
- Gebruik het VSEARCH-algoritme voor taxonomische classificatie met de Silva-referentiedatabase op een identiteitsdrempel van 97% door de opdracht uit te voeren:
qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch - Integreer taxonomische toewijzingen met de functietabel met behulp van BIOM-tools: biom add-metadata.
- Voer statistische analyses uit zoals elders beschreven20,21.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Analyse van bacteriegroei door middel van plaatkweek
De microbiologische tests die zijn uitgevoerd om de methode voor het inoculeren van PDM met de MOM te valideren, zoals voorgesteld door Cacho et al.9, toonden aan dat er, op basis van het aantal CFU/ml, geen significante verschillen waren tussen de geïnoculeerde melkmonsters voor en na de incubatie van 4 uur. Op deze twee tijdstippen werden echter verschillen in het aantal kolonies waargenome...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een protocol dat moet worden toegepast in kraamklinieken die verbonden zijn aan een moedermelkbank, met als doel PDM te voorzien van de reconstitutie van de melkmicrobiota van een specifieke moeder die om verschillende redenen niet voldoende melk aan haar pasgeborene kan geven. Het protocol is eenvoudig en in wezen gebaseerd op twee stappen. De eerste omvat de toepassing van procedures die routinematig worden uitgevoerd in moedermelkbanken voor de juiste verzameling e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de Programa de Pesquisas para o SUS, PPSUS/2020, Ministério da Saúde do Brasil; Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina, Subsidienummer: 2021TR000506; Programa de Pesquisa Universal, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério de Ciência e Tecnologia do Brasil, Subsidienummer: 420996/2023-0; Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022 - 2024, Subsidienummer: 120815/2023-0. We bedanken ook de vrijwilligers voor het verstrekken van monsters.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Electrische moedermelkpomp | Horigen | XN-2219M2 | Zachte pomp dual plus |
| Pyrex mediaflessen | Corning | CLS1395100 | Glazen containers met plastic deksels |
| 1000 µL pipette Labmate pro | Corning HTL SA | 5666 | Variabel volume pipettor |
| Cryogene flacon | Corning | CLS431417 | DNase/RNase-vrije 2 mL flacons |
| 15 mL centrifugeerbuisjes | Corning | CLS431470 | DNase/RNase-vrije 15 mL buisjes |
| Waterbad | EcoSonics | Q3.0/40A | |
| Man–Rogosa–Sharpe (MRS) | Difco | 288210 | Melkzuurbacteriën groeimedia |
| Mannitol zout agar (MSA) | Himedia | MH118 | Staphylococcus groeimedia |
| Anaërobe pot | Permution | Creëer een lage zuurstof omgeving voor melkzuurbacteriën groei | |
| Extracta Kit – DNA e RNA | Loccus | MPTA-PV16-B Y | DNA extractie kit |
| Nanodrop | Promega | E6150 | Quantus DNA |
| GoTaqG2 | Promega | M7841 | PCR amplicatieksysteem |
| Quantus Fluorometer | Promega | E5150 | DNA / RNA kwantificerkit |
| MiSeq Systeem | Illumina Inc. | M-GL-00006 v4.0 | Sequencing apparatuur |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycli) | Illumina Inc. | MS-102-2002 | Sequencing kits en reagentia |
| Software naam | |||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic | Leestrimtool voor Illumina NGS gegevens | |
| QIIME 2 | https://docs.qiime2.org/2024.10/ | Microbioom analysepakket | |
| Primer naam | Primersequentie | ||
| 16S_357F | TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG | ||
| 16S_805R | GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC |
Referenties
- Szyller, H., et al. Bioactive components of human milk and their impact on child's health and development, Literature Review. Nutrients. 16 (10), 1487(2024).
- Fernández, L., Rodríguez, J. M. Human milk microbiota: Origin and potential uses. Nestle Nutr Inst Workshop Ser. 94, 75-85 (2020).
- Fernández, L., Ruiz, L., Jara, J., Orgaz, B., Rodríguez, J. M. Strategies for the preservation, restoration and modulation of the human milk microbiota. Implications for human milk banks and neonatal intensive care units. Front Microbiol. 9, 2676(2018).
- Meier, P. P. More evidence: Mothers' own milk is personalized medicine for very low birthweight infants. Cell Rep Med. 3 (8), 100710(2022).
- Fewtrell, M. S., et al. Predictors of expressed breast milk volume in mothers expressing milk for their preterm infant. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 101 (6), F502-F506 (2016).
- Abrams, S. A., et al. Donor human milk for the high-risk infant: Preparation, safety, and usage options in the United States. Pediatrics. 139 (1), e20163440(2017).
- Brasil é referência em doação de leite materno. , Serviços e Informações do Brasil. At https://www.gov.br/pt-br/noticias/saude-e-vigilancia-sanitaria/2020/02/brasil-e-referencia-em-doacao-de-leite-materno (2024).
- Landers, S., Updegrove, K. Bacteriological screening of donor human milk before and after holder pasteurization. Breastfeed Med. 5 (3), 117-121 (2010).
- Cacho, N. T., et al. Personalization of the microbiota of donor human milk with mother's own milk. Front Microbiol. 8, 1470(2017).
- Pumping breast milk. , Centers for Disease Control and Prevention - CDC. https://www.cdc.gov/nutrition/infantandtoddlernutrition/breastfeeding/pumping-breast-milk.html (2023).
- Expressing and storing breast milk. , NHS UK. https://www.nhs.uk/conditions/baby/breastfeeding-and-bottle-feeding/breastfeeding/expressing-breast-milk/ (2020).
- Arslanoglu, S., et al. Recommendations for the establishment and operation of a donor human milk bank. Nutr Rev. 81 (Supplement_1), 1-28 (2023).
- Moro, G. E., et al. Processing of donor human milk: Update and recommendations from the European Milk Bank Association (EMBA). Front Pediatr. 7, 49(2019).
- Landers, S., Hartmann, B. T. Donor human milk banking and the emergence of milk sharing. Pediatr Clin North Am. 60 (1), 247-260 (2013).
- Stachelska, M. A. Identification of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus strains present in artisanal raw cow milk cheese using real-time PCR and classic plate count methods. Pol J Microbiol. 66 (4), 491-499 (2017).
- Ruiz, L., et al. Comparison of two approaches for the metataxonomic analysis of the human milk microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 11, 622550(2021).
- Lopez Leyva, L., Brereton, N. J. B., Koski, K. G. Emerging frontiers in human milk microbiome research and suggested primers for 16S rRNA gene analysis. Comp Struct Biotechnol J. 19, 121-133 (2021).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible iInteractive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), e61217(2013).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2024).
- Torrez Lamberti, M. F., et al. Metabolomic profile of personalized donor human milk. Molecules. 25 (24), 5783(2020).
- Mallardi, D., et al. Inoculation of mother's own milk could personalize pasteurized donor human milk used for feeding preterm infants. J Transl Med. 19 (1), 420(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
