Methodenartikel

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

DOI:

10.3791/67780

⸱

27 december 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technische hindernissen in een cultuur van epitheelcellen zijn onder meer dedifferentiatie en functieverlies. Biomimetische driedimensionale (3D) celkweekmethoden kunnen de efficiëntie van de celcultuur verbeteren. Deze studie introduceert een geavanceerd tweelaags kweeksysteem dat bedoeld is om epitheelcellen te cultiveren als weefselachtige lagen met de kweek van fibroblasten in een 3D-omgeving. Polyvinylalcohol (PVA) en poly(ε-caprolacton) (PCL) nanovezelmembranen (NM's) werden vervaardigd via elektrospinning en gebruikt als een fysiologisch relevante extracellulaire matrix voor respectievelijk de kweek van epitheelcellen en fibroblasten. In de bovenste insert-putten werden longepitheelcellen gekweekt op de PVA NM en in de onderste kamers werden fibroblasten gekweekt op de PCL NM. Deze configuratie elimineert direct cel-celcontact en vergemakkelijkt het onderzoek van paracriene signalering gemedieerd door oplosbare factoren. Confocale microscopie werd gebruikt om de distributie, het groeipatroon en de expressie van intracellulaire eiwitten, waaronder zona occludens in epitheelcellen, te analyseren. Z-stapeltechnieken maakten gedetailleerde 3D-reconstructies mogelijk, die nauwkeurige inzichten verschaften in de integriteit van tight junctions en ruimtelijke organisatie binnen de epitheellaag. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) beoordeelde de morfologische kenmerken van celtypen op de nanovezelmembranen. SEM-beeldvorming onthulde ingewikkelde celoppervlaktestructuren en interacties met de nanovezels, en bood een uitgebreid perspectief op cellulaire architectuur en celinteractie met nanovezelstructuur. De Cell Counting Kit-8 (CCK-8) -test is een eenvoudige methode voor het meten van de groeisnelheid van epitheelcellen en fibroblasten in de loop van de tijd. Het zorgt voor het proliferatieve gedrag en de potentiële synergetische effecten van het cocultiveren van deze cellen. Deze bevindingen benadrukken de effectiviteit van een eenvoudig co-cultuursysteem voor gelijktijdige kweek van fibroblasten en epitheelcellen, wat cruciaal is in verschillende fysiologische en farmacologische contexten, waaronder regeneratie van epitheelweefsel, tumormicro-omgeving met endotheel-, immuun- en andere stromacellen, toxiciteitstest en geneesmiddelactiviteitstest.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de loop van de decennia is de klassieke tweedimensionale (2D) monolaagcultuur essentieel geweest voor het begrijpen van infecties, farmacologie en toxicologie 1,2. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de complexiteit, dynamische interacties tussen multi-composities en driedimensionale (3D) architectuur van de weefselmicro-omgeving. De 2D-celcultuur heeft dus beperkingen bij het nabootsen van weefselachtige structuren 3,4. Er is bijvoorbeeld een gebrek aan cel-tot-cel en cel-naar-extracellulaire matrix (ECM) signalering, wat essentieel is bij celdifferentiatie, proliferatie en cellulaire functies in de vivo micro-omgeving. Om deze redenen zijn de systemen van 3D-celculturen ontwikkeld5. De cellen in 3D-cultuur groeien en interageren in drie dimensies met de omringende extracellulaire matrix. Bovendien is een 3D-cocultuurbenadering, bestaande uit meer dan één celtype, ontwikkeld om de kloof te overbruggen tussen simplistische single-cell type in vitro modellen en de dynamische cellulaire interacties die plaatsvinden in vivo6. 3D-cocultuursystemen zijn populair geworden in de studie van cel-celcommunicatie en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties 7,8,9,10. De huidige 3D-cocultuursystemen hebben verschillende vormen en kunnen worden onderverdeeld in directe en indirecte cocultuur 8,9. Bij directe cocultuur kunnen verschillende celfuncties in gekweekte cellen voornamelijk worden beïnvloed door direct contact in plaats van paracriene effecten. Ter vergelijking: indirecte cocultuur heeft een groter voordeel bij het onderzoeken van paracriene interactie door barrières of lagen te gebruiken om verschillende celtypen te scheiden.

Verschillende materialen en methoden worden gebruikt om biomimetische steigers te fabriceren die de ECM nabootsen met behulp van biocompatibele en biologisch afbreekbare stoffen10. De nanovezelachtige steigerstructuur bootst de configuratie van natuurlijke ECM in biologische weefsels na en biedt een 3D-architectuur voor celcultuur11,12. Elektrogesponnen nanovezelmembranen (NM's) zijn gebruikt in directe en indirecte cocultuur van verschillende soorten cellen 13,14,15.

Epitheelcellen vormen een fysieke barrière van de belangrijkste organen, terwijl fibroblasten overheersende stromacellen zijn die ECM-remodellering bemiddelen en het naburige epitheel reguleren 6,16,17. Epitheelcellen en fibroblasten interageren respectievelijk met laminine in het basaalmembraan en fibronectine in de interstitiële matrix via integrinereceptoren op het celoppervlak18. Wanneer epitheelcellen worden gekweekt op de poly(vinylalcohol) (PVA) NM's met diameters van 150 - 250 nm en microporiën, vormen ze meerlagige lagen in plaats van celaggregaten en sferoïden, en hun groeipatronen zijn vergelijkbaar met die van de cellen in epitheelweefsel19. Ter vergelijking: de poly(caprolacton) (PCL) NM's met een diameter van 400-1.500 nm en microporiën van 10-50 μm bieden een vergelijkbare ruimtelijke dimensionaliteit als de interstitiële matrix voor de groei van gekweekte fibroblasten13,14. Vanwege hun biocompatibiliteit zijn PVA- en PCL-membranen veelgebruikte polymeren in weefselmanipulatie20,21.

Deze studie introduceert een geavanceerd tweelaags kweeksysteem met behulp van poreuze elektrogesponnen NM's om epitheelcellen te kweken als weefselachtige lagen en fibroblasten binnen een 3D-structuur. Het protocol kan worden onderverdeeld in vijf belangrijke fasen: fabricage van nanovezels, post-crosslink en kwaliteitsbeoordeling van vezels, voorbereiding van membraan-bevestigde kweekput, celzaaien en 3D-cocultuur, en testen van 3D-gekweekte cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricage van waterstabiele PVA-nanovezels

  1. Weeg 0,02 g poly(acrylzuur) (PAA) en 1 g PVA af en voeg ze vervolgens toe aan een schone glazen fles met een magnetische staaf. Voeg 7,8 ml gedestilleerd water toe aan de fles, plaats de fles op een roerder en stel de temperatuur in op 84 °C, de snelheid op 500 tpm en de tijd op 12 uur.
  2. Laat de fles afkoelen tot kamertemperatuur voordat u 0,2 ml glutaaraldehyde (GA) toevoegt. Plaats de fles op de plaatroerder en stel de snelheid in op 500 tpm, de tijd op 30 minuten en de temperatuur op kamertemperatuur.
  3. Gebruik een spuit van 5 ml voor elektrospinnen, scheid de zuigers van de vaten en verwijder klein plastic vuil in de vaten en de punt van de plunjers.
  4. Gebruik naalden om de vloeistofstroom te blokkeren en giet vervolgens PVA-oplossing in elk vat (volume: 2.5-3 ml elk). Zet de zuigers in elkaar en verwijder vervolgens de naalden.
    OPMERKING: Er kan een luchtbel in de oplossing zitten, dus wacht tot de luchtbel verdwijnt. Dit duurt 10-30 minuten.
  5. Zet een nieuwe metalen naald van 27 G in elkaar en plaats deze vervolgens in de elektrospinmachine.
  6. Wikkel de collector goed in met folie.
  7. Laat het injectorpaneel terugkeren naar de oorspronkelijke positie. Gebruik de volgende instellingen voor de machine: (elke pomp) injectievolume: 2 ml, injectiesnelheid: 6 μL/min, rolsnelheid: 100 tpm, afstand tip tot collector: 14 cm. Controleer de vloeistofstroom voor elke pomp.
  8. Laat de machine draaien met een elektrisch potentiaal van ongeveer 12 kV.
  9. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in het begin 40 - 50% is en aan het einde van het proces 25 - 30%. Gebruik een luchtbevochtiger wanneer de luchtvochtigheid afneemt en plaats de dag voor het elektrospinnen gerechten met gedestilleerd water in de machine om de luchtvochtigheid te verhogen.
    OPMERKING: Dit is een kritische factor in de succesvolle fabricage van PVA-nanovezels.
  10. Controleer de stroom regelmatig. Als de naald verstopt is, stop dan tijdelijk de machine. Gebruik een laboratoriumdoekje om de druppel te verwijderen en wacht tot de nieuwe druppel verschijnt. Als dit niet het geval is, vervang dan de naald en laat de machine verder draaien.
  11. Het proces van de fabricage van PVA-nanovezels duurt ~6 uur. Nadat het elektrospinnenproces is voltooid, maakt u de folie met de vezelmat los van de collector en bewaart u de nanovezelmat in droogmiddel onder vacuüm.

2. Behandeling van een PVA-nanovezelmembraan met zoutzuur (HCl) damp en beoordeling van de vezelkwaliteit

OPMERKING: De waterstabiliteit van PVA NM's blijft goed behouden na de post-crosslinking-reactie door HCl-damp. Dit proces is geoptimaliseerd voor de juiste dikte, poriegrootte en ruwheid van de NM's. PVA is een zeer hydrofiel polymeer en elektrogesponnen PVA-nanovezels zijn onstabiel in contact met water en vochtige omstandigheden. PVA NM's moeten worden behandeld met HCl-damp net na de fabricage van het PVA-polymeer.

  1. Snijd een nanovezelmat in stukken van de gewenste grootte voor het trans-well-inzetstuk.
  2. Bereid een klein schaaltje voor met 1,5 ml puur HCl. Plaats het HCl-bevattende schaaltje en de stukjes nanovezel in een vacuümkamer en sluit het deksel.
    OPMERKING: HCl-damp wordt gebruikt als postcrosslink-middel om de nanovezel waterstabiel te maken.
  3. Open de klep die is aangesloten op de vacuümpomp, wacht 10 s totdat de HCl-rook opstijgt en sluit vervolgens de klep. Behandel de membranen gedurende 2 minuten met HCl-rook.
  4. Voeg na behandeling met HCl-damp enkele druppels gedestilleerd water (DW) toe aan de membranen, leg ze op een glasplaatje en verwijder het membraan van de folie. Na 20 minuten aan de lucht te hebben gedroogd, blijven de membranen op natuurlijke wijze aan de glijbaan plakken.
  5. Smeer de membranen op carbontape in met een dun laagje goud met behulp van een autosputter coater. Verkrijg afbeeldingen van een scanning-elektronenmicroscoop (SEM).
  6. Na het verknopen van PVA NM's met HCl, wast u ze 3x met 1x PBS en controleert u de pH nadat u ze in kweekmedia hebt gedrenkt om de afwezigheid van resterend HCl te bevestigen.

3. Fabricage van PCL-nanovezels en kwaliteitsbeoordeling van nanovezels

  1. Weeg 1,5 g PCL af en voeg dit toe aan een schone glazen fles. Voeg 8,5 ml chloroform toe aan de fles, plaats de fles op een roerder en los PCL in chloroform op gedurende 12 uur bij kamertemperatuur.
  2. Herhaal stap 1.3 tot 1.9, behalve stap 1.7 en 1.8, stel de injectiesnelheid in op 8 μL/min en de spanning op 17.5 kV.
    OPMERKING: PCL-fabricage duurt ~3,5 uur om te voltooien.
  3. Snijd een klein stukje van het membraan af en bedek de stukken gedurende 5 minuten met een auto-sputterproces. Verkrijg SEM-afbeeldingen.

4. Assemblage van twee lagen membranen in een trans-well

OPMERKING: In dit protocol gebruiken we een plaat met 24 putjes en de bijbehorende insteekput. De PVA NM is bevestigd aan de inzetput, terwijl de PCL NM is bevestigd aan de onderste put.

  1. Snijd een nanovezelmat in ronde stukken, met een diameter van 10 mm en 13 mm voor respectievelijk PVA en PCL NM's.
  2. Gebruik polydimethylsiloxaan (PDMS) Sylgard 184 als kleefmiddel om de membranen aan het inzetstuk en de kamer goed te bevestigen. Meng voor gebruik Sylgard 184 Base (deel A) en Curing Agent (deel B) in een plastic beker in een massaverhouding van 10:1. Gebruik een schoon glasplaatje om de PDMS-oplossing krachtig te mengen gedurende 2-3 minuten totdat het hele mengsel gevuld is met bubbels. Laat de bel zich vormen en 10 minuten verdwijnen voordat je hem gebruikt; Laat ondertussen de glijbaan opwarmen tot 100 °C.
  3. Spreid het PDMS uit op een glasplaatje en dompel de onderkant van het inzetstuk iets goed in het PDMS. Houd het inzetstuk goed ondersteboven op de glijverwarmer zodat het PDMS kan uitharden (~10-15 min). Controleer zorgvuldig met een tip van 200 μL of het PDMS niet plakkerig is.
  4. Behandel de PVA NM-stukken zoals beschreven in stap 2.2 tot 2.4.
  5. Druk het inzetstuk voorzichtig goed op het PVA NM-stuk, zodat de onderkant van het inzetstuk naar de nanovezelzijde van het membraanstuk wijst. Voeg een druppel gedestilleerd water toe aan het midden van de put en gebruik een tang om de folie te verwijderen. Plaats het inzetstuk goed in een nieuwe plaat met 24 putjes en laat het membraan drogen.
  6. Wanneer u het PCL NM-stuk goed op de bodem bevestigt, zorg er dan voor dat u de 200 μL-tip in het PDMS-mengsel doopt en deze precies op de vier hoeken en in het midden stippelt.
  7. Plaats de plaat op de glijverwarmer en laat het PDMS 5-7 minuten uitharden om de kwaliteit van de montage te garanderen.
  8. Plaats het PCL NM-stuk in de PDMS-bevattende put, met de nanovezelzijde van het membraan bevestigd aan het PDMS. Gebruik een kleine, schone borstel om de foliezijde van het membraanstuk lichtjes aan te drukken voor volledige bevestiging. Voeg 0,2 ml 70% ethanol toe aan het putje om de folie gemakkelijk te verwijderen.
  9. Steriliseer het inzetstuk en de bodemput 's nachts in de trans-well-opstelling onder UV-licht.
    OPMERKING: De gemengde PDMS kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor verder gebruik. LET OP: De PCL nanovezelige membraanbevestigde plaat kan droog worden bewaard, maar moet voor gebruik nat zijn met 70% ethanol.
  10. Was de volgende dag het inzetstuk en de bodem goed door gedurende 3 x 10 minuten respectievelijk 200 μL en 500 μL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen. Het inzetstuk en de bodemkuip zijn klaar voor gebruik.

5. Celzaaien en samenstellen van twee lagen voor het cocultuurmodel

OPMERKING: MLE-12-cellen werden gekweekt in 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine-antibioticum. NIH3T3-cellen werden gekweekt in 1x DMEM hoge glucose met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine antibioticum.

  1. Bewaar de cellen in een kweekschaaltje van 150 mm. Als ze 70-80% confluent zijn, was de cellen dan met 10 ml 1x PBS en trypsiniseer ze met 2 ml voorverwarmde 0,05% trypsine/EDTA-oplossing gedurende 3 minuten bij 37 °C.
  2. Tik zachtjes op de schaal om de cellen van de bodem los te maken en voeg vervolgens 8 ml volledige kweekmedia toe aan elk type cel om het trypsine-enzym te neutraliseren. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 50 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g en gooi het bovenstaande weg. Kleur de cellen met Cell-Tracker om de verdeling van de gezaaide cellen op NM te observeren (zie rubriek 6 voor meer details).
  3. Resuspendeer de celpellet in 5 ml volledige DMEM/F12-media. Bepaal het celaantal en pas aan op 6 × 106 MLE-12 cellen/ml en 8 × 105 NIH3T3 cellen/ml.
    OPMERKING: Volledige DMEM/F12-media worden gebruikt voor cocultuur met MLE-12- en NIH3T3-cellen.
  4. Vul het bodemputje met 500 μL complete DMEM/F12 media (het putje zonder PCL). Breng het PVA-nanovezelmembraan bevestigde inzetstuk over naar de transwell en voeg 50 μL MLE-12-celsuspensie toe. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
  5. Vul tegelijkertijd de PCL nanovezelige membraan bevestigde bodemput met 500 μL NIH3T3-celsuspensie en incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
  6. Monteer na 2 uur het MLE-12 celbevattende inzetstuk en de NIH3T3 celbevattende bodemput in de trans-well opstelling. Dit is het cocultuurmodel met MLE-12-cellen als bovenste laag en NIH3T3-cellen als onderste laag. Cocultureer de cellen in de tweelaagse membranen gedurende de gewenste tijd.

6. Test van de celdistributie

  1. Bereid 5 μM Cell-Tracker rode en groene oplossing voor in een totaal volume van 2 ml compleet DMEM/F12-medium.
  2. Meng na trypsinisatie MLE-12-cellen met eerder bereide Cell-Tracker rode oplossing en NIH3T3 met Cell-Tracker groene oplossing. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om een optimale cellabeling te garanderen. Voeg 8 ml volledig DMEM/F12-medium toe aan de monsters en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g .
    OPMERKING: Cell Tracker kan de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen niet beïnvloeden. Vandaar dat met Cell-Tracker gekleurde cellen kunnen worden gekweekt tot confluentie. De fluorescentie-intensiteit in de gekleurde cellen kan 4-5 dagen na kweek afnemen.
  3. Herhaal stap 5.3 tot en met 5.6.
  4. Terwijl u onder een confocale microscoop observeert, brengt u het inzetputje over van de plaat met 24 putjes naar een plaat met 12 putjes.
    OPMERKING: Dit minimaliseert de afstand tussen de objectieflens en de cellen, waardoor de celmorfologie kan worden waargenomen.

7. Confocale waarnemingen van 3D gecocultureerde cellen

OPMERKING: De hechting van epitheelcellen aan een PVA NM is zwak in vergelijking met die van fibroblasten aan een PCL NM. Gooi oude media handmatig weg door middel van pipetaspiratie en voeg nieuwe media of oplossing voorzichtig toe aan de wand van putten. Probeer tijdens het kleuringsproces de vliezen niet te laten opdrogen.

OPMERKING: De celhechting kan worden verbeterd door laminine te coaten of peptiden van integrinebindende motieven in PVA-nanovezelsop te nemen 19.

  1. Breng het inzetstuk over op een nieuwe plaat met 24 putjes. Gooi de oude media weg en voeg 150 μL van een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder de 4% PFA-oplossing en was de aangehechte cellen met 150 μL 1x PBS.
  3. Voor blokkering en permeabilisatie 150 μL 5% normaal geitenserum en 0,2% Triton X-100 verdund in 1x PBS toevoegen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  4. Bereid de Alexa Fluor 594-geconjugeerde anti-zona occludens Ab (1:400) en Phalloidin-iFlour 488 (1:1.000) voor door ze te verdunnen in antilichaamverdunningsmiddel. Verwijder de blokkeeroplossing, voeg 150 μL van de fluorofooroplossing per putje toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Bereid de antilichaamoplossingen met de grootste precisie, aangezien dit een directe invloed heeft op de kwaliteit van de resultaten. Vermijd blootstelling aan licht.
  5. Gooi de antilichaamoplossing weg en was de cellen gedurende 10 minuten met 150 μL 1x PBS.
  6. Voeg 150 μL Hoechst 33342 verdund in 1x PBS (1:1.000) toe en incubeer gedurende 10 min; Vermijd blootstelling aan licht.
  7. Verwijder de Hoechst 33342 oplossing en was de aangehechte cellen met 150 μL 1x PBS gedurende 10 min.
  8. Bereid een schoon glasplaatje voor en voeg een precieze hoeveelheid waterige montagegel toe. Gebruik een tang met puntige punten om de membranen voorzichtig los te maken van de omringende rand. Plaats de membranen op de montagegel en zorg ervoor dat de kant met de cellen naar boven wijst. Voeg een precieze hoeveelheid montagegel toe en dek af met een afdekschuif. Sluit de dia's af met nagellak en zorg voor een nauwkeurige en volledige afdichting.
  9. Observeer cellen onder een confocale microscoop met behulp van de volgende beeldvormingsinstellingen: Laservermogensregeling: 405 Intensiteit 10; Laservermogensregeling: 488 Intensiteit 10; Controle laservermogen: 561 Intensiteit 10; Gevoeligheid detector: 420LP (waarde 600); Gevoeligheid detector: 525/50 (waarde 700); Gevoeligheid detector: 561LP (waarde 750).

8. Bepaling van de celhechting aan nanovezels

  1. Gooi de oude media weg en spoel de cellen met 150 μL 1x PBS.
  2. Fixeer de cellen met 150 μL 3% GA verdund in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Was de cellen met 150 μL 1x PBS in 10 min.
  4. Fixeer de cellen secundair door 150 μL 1% osmiumtetroxide (OsO4) verdund in 1x PBS gedurende 1 uur toe te voegen.
    LET OP: OsO4 en zijn damp zijn schadelijk. Het moet worden gebruikt in een zuurkast.
  5. Gooi de oplossing weg en was de cellen met 300 μL 1x PBS gedurende 2 x 10 min.
  6. Dehydrateer de cellen met graduele ethanol van 50%, 70%, 90% en 95% tot 100%, gedurende 10 minuten in elke stap. Voer de laatste uitdrogingsstap uit door gedurende 10 minuten verse 100% ethanol toe te voegen.
  7. Laat de cellen en membranen volledig aan de lucht drogen. Gebruik een tang met de puntige punten om de membranen los te maken en plaats de membranen op de preparaathouder met behulp van een tweezijdige kraan. Voer 5 minuten ionensputteren uit voordat u de cellen observeert onder SEM met een vergroting van 2.000x.

9. Test op celgroei

OPMERKING: In dit protocol wordt de CCK-8-test gebruikt om de celgroeisnelheid te kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Bereid het CCK-8-mengsel voor door 9 delen voorverwarmd DMEM/F12 (per volume) te mengen met 1 deel van het CCK-8-reagens. Voeg na het verwijderen van de oude kweekmedia 150 μL van het CCK-8-mengsel toe aan het celhoudende putje.
  2. Breng het inzetstuk over naar de nieuwe plaat met 24 putjes om het te scheiden van het onderste putje met cellen. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Verzamel het bovenstaande en breng het over in een tube van 1,5 ml. Centrifugeer bij 1.800 × g gedurende 3 min.
  4. Voeg 100 μl van het bovenstaande uit de microcentrifugebuis toe aan de plaat met 96 putjes. Lees optische dichtheid (OD) af bij 450 nm.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst de kritieke stappen voor het coculteren van MLE-12-longepitheelcellen en NIH3T3-fibroblasten door een nanovezelig membraangebaseerd tweelaags model te construeren (Figuur 1). Dit model is geschikt voor beeldvorming van levende cellen, immunohistochemie en kwantitatieve eindpuntanalyse van gecocultureerde cellen. Andere celtypen kunnen ook worden gebruikt door de celdichtheid en groeiomstandigheden te optimaliseren.

SEM toont de uniforme verdeling van gefabriceerde PVA-nanovezels zonder enige parelvorming (Figuur 2A). De diameter van de PVA-nanovezels varieerde van 150 nm tot 230 nm (180 ± 25 nm, gemiddelde ± standaarddeviatie (SD)). De nanovezels in elektrogesponnen PCL NM's waren willekeurig georiënteerd en leken structureel op collageen (Figuur 2B). De meeste vezels in PCL NM's hadden een diameter tussen 300 nm en 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Het PVA-nanovezelmembraan had dus kleinere poriegroottes dan het PCL-nanovezelmembraan.

Vóór het zaaien werden MLE-12- en NIH3T3-cellen gekleurd met respectievelijk Cell-Tracker rood en groen en werden ze tijdens het cocultuurproces gecontroleerd. Zoals te zien is in figuur 3, kon de ruimtelijke verdeling van MLE-12-cellen in de insertkamer en NIH3T3-cellen in de onderste kamer duidelijk worden waargenomen. Focus-stacking-analyse toonde aan dat NIH3T3-cellen werden gedispergeerd en gedetecteerd op verschillende diepten (102 ± 20 μm), terwijl MLE-12-cellen lagen vormden met een dikte van 80 ± 10 μm. SEM toont celhechting aan de membranen. NIH3T3-cellen infiltreren het PCL-nanovezelmembraan en strekken zich uit langs de nanovezelassen, terwijl MLE-12-cellen zich aan het oppervlak van het PVA-nanovezelmembraan hechtten en een aggregatie vertoonden (Figuur 4). Vervolgens onderzochten we de cytoskeletale organisatie van NIH3T3-cellen en MLE-12-cellen door middel van actinekleuring. NIH3T3-cellen gekweekt op PCL nanovezelmembraan vertonen een projectielverdeling van actinefilamenten die lijken op cellen in weefsel, en actinekleuring in MLE-12-cellen gekweekt op PVA-nanovezelmembraan vertoont ronde aggregaten zonder cellulaire verspreiding (Figuur 5).

De distributie en het groeipatroon van MLE-12-cellen in monocultuur en cocultuur werden vergeleken. Cell-Tracker rood gekleurde cellen in monocultuur op de PVA NM's vormden aggregaten, maar de cellen in cocultuurtoestand behielden een gelijkmatige verdeling op het membraan (Figuur 6A). In een 3D-analyse van confocale microscopiebeelden vertoont het groeipatroon van gecocultureerde MLE-12-cellen op de PVA-NM's gelaagde hechting van gekweekte cellen aan het membraan met meer confluente celdichtheid, vergeleken met cellen die zijn gekweekt in afwezigheid van fibroblasten (Figuur 6B). Bovendien waren cel-tot-cel adhesie en expressie van zonaal occludine (ZO)-1 op de celoppervlakken (pijl aangegeven), maar niet van celaggregaten, duidelijker in de cocultuurconditie dan in cultuur zonder fibroblasten (Figuur 6C).

De proliferatie van cellen op de membranen werd gemeten met behulp van de CCK-8-test. De proliferatie van NIH3T3- en MLE-12-cellen nam in de loop van de tijd toe (Figuur 7). Er werden echter lagere groeisnelheden van cellen waargenomen op de membranen dan op een kweekplaat (gegevens niet getoond). Gecocultureerde NIH3T3- en MLE-12-cellen op NM's vertonen een stabiele groeisnelheid in vergelijking met de monogekweekte cellen in een kweekplaat.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch ter illustratie van de NIH3T3 fibroblast en MLE-12 epitheelcel co-cultuur methode in het op steigers gebaseerde tweelagensysteem. Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol; PCL = poly(ε-caprolacton). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Structuur van PVA- en PCL-nanovezels. (A) PVA- en (B) PCL-nanovezelmembranen werden geproduceerd door elektrospinning. De structuur en diameter van de nanovezels worden gemeten door SEM van de membraanoppervlakken. Schaalbalken = 1 μm (A), 10 μm (B). Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol; PCL = poly(ε-caprolacton). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: In een cocultuursysteem, de ruimtelijke verdeling van NIH3T3-cellen op PCL nanovezelmembraan en MLE-12-cellen op PVA-nanovezelmembraan. NIH3T3-cellen (4 × 105) werden gekleurd met Cell-Tracker Green en MLE-12-cellen (3 × 105) werden gekleurd met Cell-Tracker Red. De gezaaide cellen werden gedurende 24 uur gekweekt en geobserveerd met behulp van een Z-stapelbeeld van een confocale microscoop. De getallen zijn aangegeven in μm; Pijlen geven de afmetingen aan met X (breedte), Y (lengte), Z (diepte). Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol; PCL = poly(ε-caprolacton). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Adhesie en morfologie van NIH3T3-cellen op PCL nanovezelmembraan en MLE-12-cellen op PVA-nanovezelmembraan. De cellen werden gedurende 24 uur op de membranen gekweekt en geobserveerd met behulp van SEM met een vergroting van 2.000x. Schaalbalken = 15 μm. Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol; PCL = poly(ε-caprolacton). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Actine-stressvezels in NIH3T3-cellen op PCL-nanovezelmembraan en MLE-12-cellen op PVA-nanovezelmembraan. NIH3T3-cellen (4 × 105) en MLE-12-cellen (3 × 105 cellen) werden respectievelijk op de PCL- en PVA-nanovezelmembranen gezaaid. Na 48 uur cultuur werden de cellen gekleurd met phalloidin-iFlour 488 en geobserveerd met behulp van confocale microscopie. Schaal balken = 50 μm. Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol; PCL = poly(ε-caprolacton); FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Groeipatroon van gecocultureerde MLE-12 cellen op PVA nanovezel membraan. (A) Cell-Tracker rood gekleurde MLE-12-cellen (3 × 105 cellen) werden gezaaid op het PVA-nanovezelmembraan en alleen gekweekt (-NIH3T3-cellen) en met NIH3T3-cellen in een tweelaags systeem (+NIH3T3-cellen) gedurende 48 uur. (B) Monocultuur en coculturende MLE-12-cellen gedurende 48 uur werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en Phalloidin-iFlour 488 en geobserveerd met behulp van een confocale microscoop. De 3D-beelden worden weergegeven met behulp van de oppervlaktefunctie van de Imaris-software. (C) MLE-12-cellen werden gedurende 48 uur gekweekt en fluorescerend gelabeld met Phalloidin-iFlour 488 en anti-ZO-1-antilichaam (rood). Schaal balken = 50 μm. Afkortingen: PVA = polyvinylalcohol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Groeisnelheid van de cellen in een tweelaags cocultuursysteem. NIH3T3-cellen (4 × 105) en MLE-12-cellen (3 × 105) worden gedurende de aangegeven tijd samen gekweekt. De celgroei in de insert en de onderste put wordt gemeten met behulp van de CCK-8-test. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De overgang van 2D-cultuur naar 3D-cultuurmodellen betekent een belangrijke vooruitgang in de ontwikkeling van in vitro cocultuurmodellen. Een 3D-kweekmodel moet de weefselmicro-omgeving nabootsen waarin cellen zich kunnen vermenigvuldigen, aggregeren en differentiëren22. Het gebruik van 3D-cocultuurmodellen op basis van steigers verbetert de replicatie van weefselarchitectuur. In deze studie zorgt een op NM gebaseerd trans-well-systeem voor indirecte 3D-cocultuur van twee soorten cellen. De PCL NM met grote poriën in de onderste kamer maakt cellulaire infiltratie mogelijk en bootst de interstitiële matrix na. Deze steiger ondersteunt de groei en ruimtelijke organisatie van fibroblasten. Het gebruik van een PVA-nanovezelmembraan in de bovenste kamer maakt de vorming van MLE-12-epitheelcellen in de laag mogelijk. De diameter en poriegrootte van het PVA-nanovezelmembraan maken het een ideaal substraat voor het ondersteunen van de hechting en groei van epitheelcellen, die epitheelcellen op het basaalmembraan in epitheelweefsels nabootsen19.

Celadhesieve eiwitten zoals fibronectine en laminine zijn sleuteleiwitten in de ECM, die cellen verbinden met collageenfibrillen23. Epitheelcellen interageren met laminine via integrinereceptoren op hun oppervlak18. MLE-12-cellen die op de PVA-NM's waren gezaaid, hechtten zich aan en groeiden driedimensionaal op het membraan. De binding van epitheelcellen aan de poreuze PVA NM was echter laag, wat resulteerde in aggregatie omdat ze geen specifieke biologische motieven hebben die interageren met gekweekte cellen. In ons cocultuursysteem is er geen direct cel-celcontact tussen NIH3T3- en MLE-12-cellen en vindt communicatie uitsluitend plaats via paracriene signalering. De aanwezigheid van gecocultureerde NIH3T3-cellen kan de aanhechting van MLE-12-cellen aan het membraan gedurende de kweekperiode stabiliseren. Deze stabilisatie kan worden toegeschreven aan de afscheiding van oplosbare factoren door de fibroblasten, waaronder collageen, fibronectine, laminine en verschillende groeifactoren24. Ter vergelijking: in een tumormodel met directe cocultuur van fibroblasten en kankercellen in een PCL nanofibreus scaffold, veranderen fibroblasten de eigenschappen van de ECM door middel van matrixremodellering25.

Epitheelcellen rusten op een basaalmembraan dat fungeert als groeiondersteuning en selectief doorlaatbare laag. Verschillende technologische strategieën, waaronder organoïdetechnologie, worden momenteel ontwikkeld om 3D-complexe modellen van epitheelweefsels te creëren26. De organoïdestructuur belemmert echter het gebruik van conventionele assays27. Bovendien wordt conventionele microscopie voor het verzamelen van experimentele gegevens bemoeilijkt door het feit dat organoïden worden gekweekt terwijl ze zijn ingebed in een 3D-hydrogelmatrix27. In deze studie werd de insertiekamer gescheiden van de lage kamer om nauwkeurige observatie van epitheelcellen gekweekt op PVA NM mogelijk te maken. Bovendien worden 3D-organoïden geproduceerd door de differentiatie van stamcellen. Het kweken van stamcellen duurt dus lang en is een complexe procedure in vergelijking met een cocultatiesysteem, en de heterogeniteit van organoïden wordt gerapporteerd28.

In vergelijking met monocultuur verbetert cocultuur van epitheelcellen en fibroblasten de hechting aan de steiger en behoudt het een stabiele groei en functie van de gekweekte epitheelcellen. Bovendien zijn aanvullende materialen, waaronder groeifactoren en cytokines, niet nodig in het kweekmedium vanwege oplosbare factoren die worden uitgescheiden door co-gekweekte fibroblasten. Ondanks de voordelen van het gebruik van nanovezelachtige steigers in celcocultuur door structurele ondersteuning te bieden, kunnen ze geen ECM bieden om kweekcellen te omringen in vergelijking met biocompatibele hydrogels29. Deze beperking kan dus worden bereikt met behulp van cellen op NM met overgelaagde hydrogels.

Concluderend kan worden gesteld dat een eenvoudig co-cultuursysteem voor gelijktijdige kweek van fibroblasten en epitheelcellen cruciaal is in verschillende fysiologische en farmacologische contexten, waaronder regeneratie van epitheelweefsel, micro-omgeving van de tumor, toxiciteitstest en test op geneesmiddelactiviteit. Een 3D-cocultuursysteem op basis van nanovezelmembranen zal worden geïnstrumenteerd en ontworpen voor screeningsstudies met hoge doorvoer voor de absorptie en het transport van geneesmiddelen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid en Welzijn van de Republiek Korea (HR16C0001); het Basic Science Research Capacity Enhancement Project via de subsidie van het Korea Basic Science Institute (National Research Facilities and Equipment Center), gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (2019R1A6C1010003); en subsidies van de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin/EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicillin/StreptomycinGibco10378016
20x PBSLPS solutionCBP007A
4% ParaformaldehydeBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 geconjugeerd ZO-1-antilichaamInvitrogen339194
Antibody diluent OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 assay kitDonginbioCCK-3000
Celcultuurschaal (150x20)SPL20151
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Red CMTPXInvitrogenC34552
ChloroformSamchunC0584
Conische buisSPL50050
DekglasCorningCLS2980245
DMEM hoge glucoseWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Droogkastbasis met vlakke flens, schroefdraadDWK Life Sciences 7.022 260
DURAN glazen Droogkastdeksel & StopkraanDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Stopkraan, met PTFE-spindelDWK Life Sciences 10322671
Electrospinning-machineNanoNCESR200RD
Ethylalcohol, PuurSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Fluorescentie Laser Confocal Scanner Module K1-fluoNanoscope Systems
Gel/mountBiomeda Corp.M01
Glutaraldehyde-oplossingSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Metalen mondstuk 27GNanoNC
NailpolishNature republic
Normaal geitenserumVector LaboratoriesS-1000
OsmiumtetraoxideSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Kunststof Spuit_Lure Lock (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poly(acrylzuur)Sigma Aldrich323667
Poly(vinylalcohol)Sigma Aldrich341584
PolycaprolactonSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Scanning Electron MicroscopySECSNE-4500M
GlijglasMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 Multimode ReaderBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Electrospinning TechniquePolyvinyl Alcohol MembranePolycaprolactone MembraneFibroblast CocultureParacrine SignalingConfocal MicroscopyScanning Electron Microscopy

Gerelateerde artikelen