Een vereenvoudigde operatie voor het endovasculaire perforatiemodel van muizen van subarachnoïdale bloeding

Samenvatting

Hier presenteren we een vereenvoudigde operatie voor het endovasculaire perforatiemodel van muizen van subarachnoïdale bloeding in combinatie met neurologische scores.

Samenvatting

Het endovasculaire perforatiemodel wordt vaak gebruikt als methode om subarachnoïdale bloeding (SAB) te simuleren in experimentele studies. Hoe uitgebreid en betrouwbaar het ook is, het vereist ingewikkelde technieken. Dit protocol vereenvoudigt het model tot in detail, gecombineerd met neurologische scores. We gebruiken een nylon hechtdraad om de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) te lussen en te trekken om de bloedstroom tijdelijk te blokkeren, anders dan de traditionele ligatie, die een duidelijk operatief veld biedt. Het gebruik van de elektrocauterisatiepen om de bloedvaten te versmelten, vermindert het risico op bloedingen. Bovendien gebruiken we een filament met een zwarte markering om het gemakkelijk te maken om de diepte van de punctie te bepalen.

De ongehinderde vooruitgang van de zwarte marker voorbij de halsslagadervertakking, waar de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) divergeert in de interne halsslagader (ICA), vergezeld van minimale weerstand, geeft aan dat het filament met succes is doorgegaan naar de intracraniële overgang van de voorste hersenslagader (ACA) en de middelste hersenslagader (MCA). Dit fenomeen geeft de positionering van het filament aan op een kritisch cerebrovasculair convergentiepunt. Door het filament vervolgens iets naar voren te schuiven om het bloedvat te doorboren, kan de endovasculaire perforatie bij muizen gemakkelijker worden bediend, waardoor de toepassing van het endovasculaire perforatiemodel bij genetisch gemodificeerde muizen wordt vergemakkelijkt. Dit kan van cruciaal belang zijn voor moleculair onderzoek en farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling.

Inleiding

Subarachnoïdale bloeding (SAB), een ernstig subtype van een beroerte, wordt in verband gebracht met hoge morbiditeits- en mortaliteitscijfers, vooral bij mensen van midden vijftig. Spontane SAB wordt voornamelijk veroorzaakt door het scheuren van intracraniële aneurysma's, die voornamelijk voorkomt in de cirkel van Willis ^1,2. Klinisch presenteren patiënten zich vaak met donderslaghoofdpijn, neurologische disfunctie en een snelle afname van het bewustzijn³. Ondanks de vooruitgang in de neurokritische zorg sterft bijna 40% van de patiënten binnen een maand na een bloeding⁴. Na aneurysmatische SAB kunnen verschillende secundaire complicaties optreden, wat leidt tot progressieve neurologische achteruitgang. De pathofysiologie en klinische kenmerken van SAB worden echter nog steeds slecht begrepen.

Om de onderliggende mechanismen beter te begrijpen en de therapeutische strategieën te verbeteren, zijn uitgebreide en betrouwbare modellen bij kleine dieren dus onmisbaar. Tot op heden zijn er tal van protocollen voor het opstellen van SAH-modellen voorgesteld. Eén benadering omvat bijvoorbeeld het injecteren van autoloog bloed in de cisterna magna. Een ander aangepast protocol omvat twee afzonderlijke injecties, één in de cisterna magna en de andere in de cisterne van het optische chiasme. De autologe bloedinjectie wordt op grote schaal toegepast vanwege de technische eenvoud en het gunstige sterftecijfer ^5,6. Om de mogelijkheid te bereiken om een kleiner en goedkoper proefdier te gebruiken, beschreven Barry et al. het eerste SAH-model op ratten in 1979 waarbij de basilaire slagader werd doorboord met wolfraammicro-elektroden na het verwijderen van de schedel⁷.

In 1995 werd een ander endovasculaire perforatiemodel gepresenteerd, een aangepaste versie van het Zea-Longa-model van cerebrale ischemie, waarvan de huidige vorm later het meest gebruikte model bleek te zijn om SAH⁸ te bestuderen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat muizen en mensen een vergelijkbare intracraniële vasculaire structuur hebben, aangeduid als de cirkel van Willis, waar het intracraniële aneurysma voornamelijk voorkomt⁹. Deze niet-craniotomiemethode repliceert de ruptuurmechanismen van het menselijk aneurysma door middel van nauwkeurige ICA-bifurcatieperforatie¹⁰. Verder wordt de genetisch gemodificeerde muis vaak gebruikt bij de studie van moleculaire mechanismen. Vanwege de gecompliceerde technieken bij kleine dieren wordt het endovasculaire perforatiemodel echter voornamelijk gebruikt bij ratten of konijnen, terwijl de toepassing ervan bij muizen relatief minder vaak voorkomt. Daarom is het van groot belang om het endovasculaire perforatiemodel van muizen te vereenvoudigen en het hoge sterftecijfer te verminderen.

Hier presenteren we een vereenvoudigde aanpassing van het endovasculaire perforatiemodel bij muizen, waarbij een aangepaste versie van de Garcia neurologische beoordelingsschaal¹¹ wordt geïntegreerd. Onze modificatie biedt een eenvoudig, handig en betrouwbaar model voor toekomstige experimentele studies van SAB.

Protocol

C57BL/6 mannelijke muizen (6-8 weken oud), vrij van specifieke ziekteverwekkers, werden gehouden in een dierenfaciliteit met gereguleerde temperatuur- en acclimatisatieomstandigheden, gehouden op een licht/donker-cyclus van 12 uur. De muizen kregen onbeperkte toegang tot een standaard knaagdierdieet en gesteriliseerd kraanwater. Voor de start van de experimenten werd een acclimatisatieperiode van 2 weken toegestaan. Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Longhua Hospital en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Science and Technology Committee van China voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Voorbereiding van dieren

1. Plaats de muis op een verwarmingskussen dat is voorverwarmd tot 37 °C en blijf deze temperatuur handhaven totdat de operatie is voltooid.
2. Verdoof de muis door inhalatie van 2-2,5% isofluraan. Onderhoud met 1-1,5% isofluraan tijdens de operatie bij een debiet van 0,4-0,6 l/min.
3. Plaats de muis op de operatietafel, stabiliseer zijn hoofd, houd hem in rugligging en zet zijn ledematen vast met tape.

2. SAH-inductie

1. Snijd met een schaar in de huid langs het midden van de voorste nek (Figuur 1A).
2. Ontleed het bindweefsel en leg de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en zijn vertakkingen bloot.
   OPMERKING: Bescherm de nervus vagus en de aangrenzende klieren voorzichtig (Figuur 1B).
3. Lus de CCA met 6-0 nylon hechtdraad en laat de twee uiteinden vrij zonder ligatie (Figuur 1C).
4. Verbind beide uiteinden van de hechtdraad met de tape en trek de hechtdraad voorzichtig naar beneden en naar rechts in een hoek van 45° ten opzichte van het horizontale vlak. Bevestig de tape aan de operatietafel om de CCA tijdelijk te blokkeren (Afbeelding 1D).
   OPMERKING: Wanneer de bloedstroom in het verstopte bloedvat draadachtig wordt, duidt dit op een succesvolle occlusie.
5. Ligate de uitwendige halsslagader (ECA) met een nylon hechtdraad (Figuur 1E).
   OPMERKING: De cauterisatieplaats moet zich zo dicht mogelijk bij het bovenste uiteinde bevinden, met een lengte van ongeveer 2 mm vanaf de halsslagadervertakking.
6. Smelt de ECA distaal van de ligatieplaats vast met behulp van een elektrocauterisatiepen (figuur 1F).
7. Trek de ECA langzaam naar beneden totdat de interne halsslagader (ICA) bloot komt te liggen. Lijn de ECA en de ICA in een rechte lijn uit en zorg voor de juiste positie voor de volgende procedure (Figuur 1G).
8. Slijp de bovenkant van het filament. Een markeringspunt op het filament bevindt zich op 8 mm van de bovenkant.
9. Maak met een schaar een kleine incisie voor het inbrengen van filament in de ECA. Breng het filament in met een tang (Figuur 1H).
10. Beweeg het filament voorzichtig met een tang vooruit totdat de zwarte markering volledig door de vertakking van CCA en ICA is gegaan. Schuif 2 mm iets vooruit om het bloedvat te doorboren (Figuur 1I).
    OPMERKING: Er wordt aanzienlijke weerstand gevoeld, wat aangeeft dat de bifurcatie van de voorste hersenslagader (ACA) en middelste hersenslagader (MCA) is bereikt.
11. Trek het filament onmiddellijk na het perforeren in.
12. Smelt de ECA vast met behulp van een elektrocauterisatiepen (figuur 1J).
13. Verwijder de tape en trek de nylon hechtdraad van de CCA terug om de doorbloeding te herstellen. Let op de duidelijke pulsatie van de CCA (Figuur 1K).
14. Sluit de incisie in de nek af met 5-0 resorbeerbare hechtingen.

3. Schijn groep

1. Voer in de schijngroep dezelfde chirurgische ingreep uit, behalve dat het filament gedeeltelijk in de ICA wordt voortgebracht en wordt teruggetrokken zonder¹² te doorboren.

4. Einde van het experiment

1. Evalueer vierentwintig uur na de operatie de neurologische prestaties volgens de gewijzigde versie van het scoresysteem gerapporteerd door Sugawara et ^al.11 (van de originele Garcia et ^al.13). Voer de volgende zes beoordelingen op een geblindeerde manier uit: spontane activiteit, beweging van alle ledematen, beweging van de voorpoot, klimmen in de muur van de draadkooi, reactie op aanraking aan beide zijden van de romp en reactie op vibrissae-stimulatie. Evalueer de neurologische functie met behulp van de gedragsscoretabel (tabel 1).
2. Verdoof de muis met ingeademd isofluraan. Plaats de muis in rugligging en bevestig hem met tape aan de operatietafel, waarbij u zijn ledematen vastzet. Gebruik vervolgens een schaar om een incisie te maken langs de middellijn van de buik, snijd door de buikwand en leg de borstholte bloot. Snijd voorzichtig het borstbeen door om het hart bloot te leggen.
3. Steek voorzichtig een infuusnaald in de linker hartkamer en zorg ervoor dat de naald stabiel is en niet in het hart doordringt.
4. Begin met perfunderen met voorgekoelde 1x PBS (4 °C) bij een geschikt debiet (ongeveer 10 ml/min) totdat de uitstromende vloeistof helder en transparant wordt, wat aangeeft dat het bloed volledig is vervangen.
5. Zodra de perfusie is voltooid, verwijdert u de infuusnaald en stopt u de vloeistofinfusie. Ga verder met het verzamelen van hersenweefsel.

5. Postoperatieve behandeling

1. Bij het sluiten van de huid, dien een intramusculaire injectie van lornoxicam toe om de pijn van de muizen te verlichten.
2. Breng tijdens de operatie erytromycine oogzalf aan op beide ogen om de droogheid van de ogen te verbeteren.
3. Injecteer na de operatie, op basis van de hoeveelheid bloedverlies tijdens het chirurgische proces, intraperitoneaal 0,2-0,4 ml zoutoplossing in de muis om de vloeistof te vervangen.
4. Injecteer penicilline intramusculair in een dosis van 40.000 eenheden per dag gedurende 3 opeenvolgende dagen om infectie te voorkomen.
5. Controleer de dieren regelmatig op spontane ademhaling gedurende de eerste uren na de operatie en controleer tweemaal daags op vooraf gedefinieerde humane eindpunten. Euthanaseer de muizen onmiddellijk met CO₂ als blijkt dat ze ademhalingsproblemen hebben veroorzaakt door de operatie of aan eindpunten voldoen, waaronder >20% gewichtsverlies ten opzichte van de uitgangswaarde, aanhoudend onvermogen om toegang te krijgen tot voedsel/water of ernstige neurologische stoornissen.
   OPMERKING: Het dier wordt niet zonder toezicht achtergelaten totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om de sternale lighouding te behouden en wordt niet teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig hersteld is.

Resultaten

Neurologische scores
Negen muizen van elke groep werden 24 uur na de operatie beoordeeld met behulp van een wijziging van het scoresysteem gerapporteerd door Sugawara et ^al.11 om SAB te evalueren. De maximaal haalbare score is 18. Onder hen scoorden n = 9 dieren in de schijngroep allemaal 18. In de SAH-groep was de gemiddelde score 11 (p < 0,0001) (Figuur 2).

Pathologische verand...

Discussie

Concluderend presenteert deze studie een vereenvoudigd en betrouwbaar muizenmodel van subarachnoïdale bloeding (SAB) geïnduceerd door het inbrengen van endovasculaire filamenten, wat een gemakkelijke en effectieve aanpak biedt. Vergeleken met het bestaande endovasculaire perforatiemodel is dit protocol hetzelfde in de perforatiestap: het filament wordt ingebracht in de externe halsslagader (ECA), naar voren gebracht via de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) en vervolgens naar de inter...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL/6 muizen	Shanghai Jiesjie Laboratory Animal Co., LTD
elektrocoagulatiepen	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Geschikt voor gebruik bij oppervlakkige kleine operaties, weefselterming en cauterisering van vegetatie.
isofluran	RWD	R650-IE	Isoflurane is een inhalatie-algemeen anestheticum. Het heeft een kleine bloed/gasverdelingscoëfficiënt. Bij gebruik voor anesthesie bij dieren kan het soepel, snel en comfortabel anesthesie induceren, met een snelle hersteltijd, goede spierrelaxatie en geen prikkelend effect op het sympathische zenuwstelsel. De stofwisselingssnelheid van isoflurane in de lever is laag, dus het heeft weinig toxiciteit voor de lever en er zijn geen duidelijke bijwerkingen, zelfs niet bij herhaald gebruik. Om de nadelige effecten van anesthesiegassen op het milieu en laboratoriumpersoneel te voorkomen, wordt aanbevolen om deze samen met een gasterugwinningssysteem te gebruiken.
MACO-filament	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	Meestal gebruikt voor muizen met een gewicht van 20-25 g, de draadpunt is gesmolten tot een halfronde vorm, zonder polylysine of siliconencoating, gemarkeerd op 9-10 mm afstand van de punt, gedesinfecteerd en kan direct worden gebruikt. Dit model heeft drie verpakkingsspecificaties. Het wordt aanbevolen om een voorproefje uit te voeren voor het formele experiment om het juiste model te bepalen.
microscoop	Olympus	BX61VS	Een volledig gemotoriseerde rechtopstaande microscoop uitgerust met het UIS2 optisch systeem, ontworpen voor hoogwaardige en hoogprecisie beeldvorming. Functies omvatten een gemotoriseerde neusstuk, podium en focus, evenals virtuele dia mogelijkheden voor het maken van grote, hoge resolutie digitale beelden van specimens. Geschikt voor geavanceerde onderzoekstoepassingen in pathologie, celbiologie, neurowetenschappen en materiaalkunde.
nylon hechtdraad	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Een niet-absorbeerbare chirurgische hechting gemaakt van hoogsterkte, biocompatibele materialen.