Methodenartikel

Extractie van de Young's Modulus van inheemse muizen pulmonale basaalmembranen uit door atoomkrachtmicroscopie afgeleide krachtkaarten

DOI:

10.3791/67784

⸱

31 januari 2025

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol visualiseert hoe cryosecties van muizenlongweefsel moeten worden voorbereid, experimenten met atoomkrachtmicroscopiekaarten kunnen worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geanalyseerd om Young's modulus van het inheemse muizenlongbasaalmembraan te bepalen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atoomkrachtmicroscopie (AFM) maakt de karakterisering van de mechanische eigenschappen van een monster met een ruimtelijke resolutie van enkele tientallen nanometers mogelijk. Omdat zoogdiercellen de mechanica van hun directe micro-omgeving waarnemen en erop reageren, is de karakterisering van biomechanische eigenschappen van weefsels met een hoge ruimtelijke resolutie cruciaal voor het begrijpen van verschillende ontwikkelings-, homeostatische en pathologische processen. Het basaalmembraan (BM), een ongeveer 100 - 400 nm dunne extracellulaire matrix (ECM) substructuur, speelt een belangrijke rol bij tumorprogressie en metastasevorming. Hoewel het bepalen van Young's modulus van zo'n dunne ECM-substructuur een uitdaging is, bieden biomechanische gegevens van de BM fundamentele nieuwe inzichten in hoe de BM het celgedrag beïnvloedt en bieden ze bovendien waardevol diagnostisch potentieel. Hier presenteren we een gevisualiseerd protocol voor het beoordelen van BM-mechanica in longweefsel van muizen, een van de belangrijkste organen die vatbaar zijn voor metastase. We beschrijven een efficiënte workflow voor het bepalen van de Young's modulus van de BM, die zich bevindt tussen de endotheel- en epitheelcellagen in longweefsel. De stapsgewijze instructies omvatten het invriezen van longweefsel bij muizen, cryosectie en AFM-krachtmapregistratie op weefselsecties. Daarnaast bieden we een semi-automatische data-analyseprocedure met behulp van de CANTER Processing Toolbox, een in eigen huis ontwikkelde gebruiksvriendelijke AFM-data-analysesoftware. Deze tool maakt het mogelijk om opgenomen krachtkaarten automatisch te laden, om te zetten in kracht- versus piëzo-extensiecurven naar kracht-versleten-indrukkingscurves, berekening van Young's moduli en het genereren van Young's moduluskaarten. Ten slotte laat het zien hoe de moduluswaarden van Young kunnen worden bepaald en geïsoleerd die zijn afgeleid van de pulmonale BM door het gebruik van een ruimtelijke filtertool.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kaarten van de AFM-kracht zijn als wijd gebruikt techniek voor het bepalen van de nanomechanische eigenschappen van een divers waaier van biologische steekproeven met nanometer ruimtelijke resolutie en piconewtonkrachtgevoeligheid 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 tevoorschijn gekomen . Baanbrekend onderzoek naar de toepassing van AFM-metingen op biologische monsters onder fysiologische omstandigheden werd uitgevoerd door P. Hansma en collega's 13,14,15,16,17,18,19,20. Vervolgens werden AFM-krachtmetingen gebruikt om de mechanische eigenschappen van individuele moleculen21, levende cellen en hun cytoskelet 9,10,22,23,24,25,26, weefsels en weefselsecties 6,8,11,27,28 te beoordelen, 29,30,31, evenals biologische hydrogels 3,4,32. In ons onderzoek, gebruikten wij AFM om de mechanische eigenschappen van biologische en chemische verbindingen 18,33,34,35,36,37 te onderzoeken en om de nanomechanische kenmerken van individuele cellen 38,39,40 te meten. Bovendien toonden metingen van groeischijfkraakbeen8 aan dat de collageenarchitectuur en Young's modulus van de extracellulaire matrix (ECM) de deling van chondrocyten leiden en bijgevolg de groeirichting van de muizengroeischijf tijdens de embryonale ontwikkeling. Verder hebben we de veranderingen onderzocht die verband houden met kraakbeendegeneratie en artrose in gewrichtskraakbeen 2,41,42,43,44,45,46,47.

In de afgelopen jaren hebben talrijke AFM-onderzoeken de mechanische eigenschappen van zowel gezond als pathologisch longweefsel onderzocht 48,49,50,51,52. Deze onderzoeken onderzochten echter voornamelijk de algemene weefselmechanica, niet gericht op specifieke weefselcomponenten zoals de BM. De BM vormt een dunne laag (100 nm - 400 nm bij mensen) van een gespecialiseerde ECM-structuur die de meeste organen en weefselstructuren van zoogdieren, zoals neuronen, spieren, adipocytenweefsels en bloedvaten, bekleedt. We ontdekten dat de mechanische eigenschappen van de pulmonale BM van muizen een cruciale rol spelen tijdens de metastasevorming op een manier dat een zachtere BM correleert met een hogere overlevingskans bij borst- en nierkankerpatiënten53. Bovendien bleek uit dit onderzoek dat het uitgescheiden extracellulaire matrixeiwit netrin-4 de Young-modulus van de BM verlaagt door een stoichiometrische 1:1-interactie met laminine γ1, een sleutelcomponent die aanwezig is in bijna alle lamininenetwerken in BM's40.

Hier presenteren we de visualisatie van ons ontwikkelde protocol om de Young's modulus (EBM) van de 100 - 200 nm dunne muizenpulmonale BM te bepalen. De Young's modulus van de BM is een maat voor de stijfheid en wordt gedefinieerd als de verhouding van spanning (kracht per oppervlakte-eenheid) versus de resulterende axiale spanning (verplaatsing) tijdens een lineaire elastische vervorming54, in dit geval een kleine compressie van de BM door de inspringende AFM-tip. In een AFM-experiment kunnen de kracht en de verplaatsing (indrukdiepte) worden verkregen uit de AFM-vrijdragende afbuiging en de cantileverpositie, en de modulus van Young (de spanning-rek-relatie) kan worden geëxtraheerd uit de resulterende kracht versus indrukkingscurve met behulp van een geschikt elastisch model, dat rekening houdt met de geometrie van de inspringingspunt (in dit geval een gewijzigd Hertz Model55). De belangrijkste stappen worden weergegeven in figuur 1. In eerste instantie schetst dit protocol de methodologie voor het voorbereiden en inbedden van muizenlongweefselmonsters in OCT-verbinding (zie stap 1), waardoor de daaropvolgende cryosectieprocedure (stap 2) wordt vergemakkelijkt die de bepaling van de BM-stijfheid mogelijk maakt met behulp van AFM-krachtkaarten. De hier gepresenteerde cryosectietechniek, waarbij gebruik wordt gemaakt van enkelzijdige en dubbelzijdige tape, maakt het mogelijk om longweefsel te segmenteren zonder dat fixatie nodig is en zonder ontdooiing van de sectie. De gedetailleerde AFM-procedure voor het verzamelen van geschikte gegevens om BM-stijfheid te beoordelen, wordt beschreven in het derde deel van het protocol. In het volgende deel van het protocol leggen we uit hoe de gegenereerde krachtvolumes automatisch kunnen worden geanalyseerd (stap 4.1) met behulp van een in-house ontwikkelde MATLAB-gebaseerde software, de CANTER Processing Toolbox56. In deze stap wordt de modulus van Young geëxtraheerd uit elke geregistreerde kracht-indrukkingscurve door een aangepast Hertz-model te passen, dat wordt gecorrigeerd voor de indringergeometrie, in dit geval een vierzijdige piramide55. Ten slotte beschrijven we in stap 4.2 en 4.3 hoe de Spatial Filtering Tool en de R2 Filtering Tool van de ontwikkelde toolbox kunnen worden toegepast om de moduluswaarden van Young die specifiek zijn voor het basaalmembraan (BM) te extraheren uit de uitgebreide set van Young's moduluswaarden verkregen in de krachtkaart die alle weefselcompartimenten van de alveolaire wand bevat.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures voor het omgaan met diermonsters zijn goedgekeurd door de Raad voor Dierproeven van het Ministerie van Milieu en Voedselvoorziening van Denemarken (toestemmingsnummer 2017-15-0201-01265) volgens de Deense wet op dierenwelzijn. Om dit protocol te demonstreren, gebruikten we een mannelijke C57BL/6-muis op de leeftijd van 13 weken.

LET OP: In het volgende protocol vereisen verschillende stappen het hanteren van weefselmonsters. Draag altijd voldoende handschoenen en een laboratoriumjas bij het hanteren van biologische monsters.

1. Voorbereiding van het monster

  1. Plaats een vers geoogste muizenlong in een wegwerpvorm van 15 x 15 x 5 mm. Gebruik een spuit van 10 ml met een naald van 0,9 mm en injecteer voorzichtig een verhouding van 1:1 (volume/volume) van het medium voor de optimale snijtemperatuur (OCT) tot de met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in het monster terwijl u tegelijkertijd de naald terugtrekt. Voer de injectie uit bij kamertemperatuur terwijl u het monster stevig vasthoudt met een klein chirurgisch pincet. De injectie wordt als voltooid beschouwd wanneer het monster opgezwollen raakt en er een merkbare hoeveelheid sijpeling wordt waargenomen.
  2. Vul pure OCT in de mal totdat het monster volledig is ondergedompeld. Om ervoor te zorgen dat de hele long volledig wordt ingevroren, bewaart u het monster gedurende ten minste 4 uur bij een temperatuur van -80 °C.
    OPMERKING: Op dit punt kan het monster minimaal 2 jaar worden bewaard bij -80 °C. Op basis van de specificaties van de fabrikant voor de OCT is de bewaartijd van ingebed weefsel meer dan 10 jaar. Over het algemeen wordt aanbevolen om monsters die langer dan 4 maanden moeten worden bewaard, in een transparante film te verpakken om te voorkomen dat vocht in het monster wordt opgenomen.

2. Cryosectie van ingebed longmonster

  1. Regel de temperatuur van de cryotoomkamer tot -17 °C, aangezien dit de optimale snijtemperatuur is voor longweefselmonsters. Stel de temperatuur van de snijstage in op -22 °C, als deze functie beschikbaar is. Dit dient om ervoor te zorgen dat de optimale snijtemperatuur op het monsteroppervlak gedurende het gehele snijproces wordt gehandhaafd.
  2. Bereid 40 microscoopglaasjes voor met dubbelzijdig plakband dat voorzichtig in het midden van het glasplaatje wordt geplaatst voordat u een centrifugebuis van 15 ml over de tape rolt om een stevige en luchtbelvrije hechting te garanderen. Zorg ervoor dat de lengte van het dubbelzijdige plakband ongeveer gelijk is aan de breedte van het OCT-blok dat het monster bevat. Microscoopglaasjes met een matte rand maken het mogelijk om te labelen met een potlood met monsterinformatie en het sectienummer.
  3. Plaats de voorbereide microscoopglaasjes in een objectglaasjesdoos. Plaats vervolgens de doos met de objectglaasjes in de cryotoomkamer om ze af te koelen.
    OPMERKING: Het koelen van de objectglaasjes voorkomt het optreden van een vries-dooicyclus bij het oppakken van de secties, wat de mechanische eigenschappen van het monster in gevaar zou brengen.
  4. Bereid meerdere enkelzijdige plakbanden voor, elk ongeveer even groot als het bevroren monsterblok.
  5. Vul de binnenste twee ringen van de monsterhouder met OCT-medium. Plaats het monster in het OCT-medium op de monsterhouder en zorg ervoor dat het zo vlak mogelijk is. Plaats vervolgens de monsterhouder ongeveer 10 minuten in de cryotoomkamer totdat het OCT-medium volledig is gestold en het monster stevig aan de houder is bevestigd.
  6. Installeer de houder met het monster op de snijfase van de cryotoom. Pas alle essentiële componenten van de cryotoom, zoals de helling van de snijfase en de positie van het mes, aan volgens de gebruikershandleiding van het apparaat om een snijvlak tot stand te brengen dat evenwijdig aan het oppervlak van het OCT-blok is uitgelijnd.
  7. Voer de eerste trim van het monster uit door de dikte van de doorsnede aan te passen tot 50 μm en begin met snijden totdat de gewenste locatie in het monster is bereikt (meestal ongeveer 500 μm in het longmonster vanaf het oppervlak) voor het verzamelen van weefselglaasjes. Stel de doorsnededikte van het cryotoom in op 15 μm, wat overeenkomt met de gewenste dikte van de weefselcoupes.
    LET OP: Het is van cruciaal belang om voorzichtig te zijn bij het gebruik van een snij-instrument, zoals een cryotoom. Om persoonlijke veiligheid te garanderen, dient u zich te houden aan de veiligheidsrichtlijnen van de fabrikant en uw vingers uit de buurt van het mes te houden.
  8. Bevestig een stuk eenzijdig plakband aan het monster door stevige druk uit te oefenen met de duim. Zorg er vooraf voor dat de duim is afgekoeld door deze enkele seconden tegen de kamerwand van de cryotoom te houden.
    OPMERKING: De tape moet stevig op het monster worden aangebracht, aangezien elk gebrek aan hechting ertoe kan leiden dat de tape tijdens het snijden van het weefsel losraakt.
  9. Produceer een weefseldoorsnede van 15 μm met de cryotoom. Gebruik een borstel om de sectie te richten en om te voorkomen dat het plakband tijdens het snijden loskomt van het monster. Voor een glad oppervlak van de weefselsectie is het essentieel dat het snijtempo langzaam en constant blijft.
  10. Het gedeelte dat in de vorige stap is gemaakt, ligt nu plat op het messenblok met de tape naar boven. Gebruik een van de gekoelde microscoopglaasjes met de dubbelzijdige tape uit de objectglaasjesdoos en druk deze stevig op de sectie om deze op te pakken. Plaats vervolgens het microscoopglaasje, dat nu het gedeelte draagt, terug in de doos van het objectglaasje.
    NOTITIE: Wanneer u het microscoopglaasje en de sectie hanteert, zorg er dan voor dat deze te allen tijde in de cryotoomkamer blijft om te voorkomen dat de sectie ontdooit tijdens de snijprocedure.
  11. Herhaal de vorige drie stappen totdat het vereiste aantal secties, d.w.z. 40, is verzameld.
  12. Als u klaar bent, plaatst u het deksel op de glijdoos en brengt u deze over op droogijs in een vriezer van -20 °C. Ruim ten slotte de cryotoom op door alle gebruikte items te desinfecteren en het UV-licht in de cryotoomkamer aan te zetten.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd. Bewaar de monsters bij een temperatuur van -20 °C totdat de AFM-metingen zijn uitgevoerd. De aanbevolen bewaartijd voor de secties en het OCT-medium mag niet langer zijn dan 6 weken. Na deze periode kunnen de secties en het OCT-medium veranderingen vertonen die lijken op vriesbrand als gevolg van hun aanzienlijke oppervlakte en de neiging om vocht op te nemen.

3. AFM-krachtkaarten van een longsectie

OPMERKING: Voor dit protocol werd de JPK NanoWizard 4XP (AFM) en de gemotoriseerde stage van Bruker in combinatie met de DMi8 (omgekeerde optische microscoop) van Leica gebruikt om krachtverplaatsingscurven van de longsecties vast te leggen.

  1. Opzetten van de AFM
    1. Schakel alle benodigde apparaten van de AFM-instelling in (bijv. computer, AFM-controller, trillingsisolatietafel, optische microscoop, enz.).
    2. Start de AFM-besturingssoftware. Selecteer in het overzicht Experiment kiezen de modus QI Advanced Imaging . Geef daarnaast de locatie op waar de experimentgegevens en kalibratiebestanden moeten worden opgeslagen.
      OPMERKING: Als u niet over de QI Advanced Imaging-extensie beschikt, gebruikt u de modus Contact Mode Force Mapping als alternatieve optie.
    3. Kies een uitkraging met een geschikte veerconstante voor het specifieke type monster dat wordt waargenomen. Voor de monsters van zacht longweefsel wordt de MLCT Cantilever F van Bruker met een piramidale punt en een nominale veerconstante van 0,6 N/m aanbevolen. Als een chip meerdere cantilevers bevat (zoals de MLCT), verwijder dan eventuele langere cantilevers van de chip met een pincet onder een stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat alleen de cantilever die voor de meting wordt gebruikt, in contact komt met het monster.
      OPMERKING: Andere uitkragingen die in contact komen met het monster dan die welke voor de meting zijn gebruikt, kunnen leiden tot ongewenste beweging van het monster tijdens het experiment of zelfs tot het losraken van het monster van de onderliggende tape.
      LET OP: Kom niet in contact met de cantilever die voor de meting wordt gebruikt met het pincet in de huidige of volgende stap.
    4. Voer de installatie van de chip op de draagarmhouder uit. Plaats de houder in de AFM-kop. Plaats de AFM-kop op de monstertrap, die zich op de omgekeerde optische microscoop bevindt. Lijn het optische hendelpad uit volgens de instructies in de gebruikershandleiding. De juiste uitlijning van het optische hendelpad wordt bereikt wanneer de laserstraal in eerste instantie aan de voorkant van de meetcantilever wordt geplaatst en vervolgens de gereflecteerde laserstraal het midden van de gesegmenteerde fotodiode raakt.
  2. Uitkragende kalibratie met behulp van de thermische ruismethode57
    OPMERKING: De kalibratie van de cantilever omvat het bepalen van de omgekeerde optische hendelgevoeligheid (InvOLS) en de veerconstante. De individuele kalibratie van elke gebruikte cantilever is noodzakelijk omdat de nominale veerconstante die typisch is voor cantilevers meestal slechts een ruwe benadering is. In experimenten waarbij de mechanische eigenschappen van een monster worden bepaald aan de hand van geregistreerde krachtcurves, zoals beschreven in dit protocol, is het essentieel om de InvOLS rechtstreeks te bepalen via een op contact gebaseerde methode op een stijf substraat. Alternatieve methoden voor het bepalen van de InvOLS, zoals het afleiden van de InvOLS uit de geometrie van de cantilever, kunnen slechts een ruwe benadering geven en zijn niet geschikt voor het type toepassing dat hier wordt beschreven. Als alternatief, als uitkragingen worden gebruikt waarbij de leverancier de exacte veerconstante levert, kan de InvOLS worden bepaald aan de hand van een procedure beschreven door Schiller et al.58.
    1. Plaats een microscoopglaasje op de monsterfase van de AFM. Het microscoopglaasje dient als het stijve substraat voor de contactgebaseerde bepaling van de InvOLS.
    2. Nadat u de AFM-kop op de monsterfase hebt geplaatst, laat u de kop zakken met behulp van de stappenmotoren totdat de resterende opening tussen de vrijdragende houder en het microscoopglaasje slechts ongeveer 1 - 2 mm is. Breng PBS aan op de zijkant van de draagarmhouder, laat deze naar beneden stromen en vormt een vloeibare meniscus in de opening tussen de houder en het microscoopglaasje met behulp van een spuit van 1 ml met een lange naald (0.9 mm x 70 mm).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat dezelfde vloeistof, zoals buffer of media, die wordt gebruikt voor de krachtvolumemetingen van het monster, ook wordt gebruikt voor het kalibratieproces.
    3. Als u een kalibratie op basis van contacten in de software wilt uitvoeren, navigeert u naar de pagina Gegevens verkrijgen en selecteert u de optie Geavanceerde weergave. Open de Calibration Manager met behulp van de hamburgermenuknop in de rechterbovenhoek. Selecteer in deze interface Contactgebaseerd als de methode en kies de MLCT F-cantilever in het vervolgkeuzemenu als de naam van de cantilever. Stel bovendien het instelpunt in op 1 V en het aantal scans op 10 in de overeenkomstige invoervelden.
    4. Voer op de pagina Gegevens ophalen in het linkerbedieningspaneel een instelpunt van 1 V in voor de automatische naderingsprocedure. Klik op de knop Blauwe pijl naar beneden in de linkerbovenhoek van de gebruikersinterface om de automatische benadering te starten. Wanneer de aanpak is voltooid en de cantilever in contact is met het microscoopglaasje, klikt u op de knop Kalibreren in het venster van Calibration Manager .
      OPMERKING: De InvOLS en de vrijdragende veerconstante worden dan beide automatisch bepaald door 10 krachtcurven te registreren, evenals de spectrale dichtheid van het thermisch vermogen (PSD), die wordt gebruikt om de veerconstante te bepalen met de thermische ruismethode57. Nadat de automatische kalibratieprocedure is voltooid, wordt visueel gecontroleerd of de aangebrachte curve de normale modus (eerste piek) van de geregistreerde PSD van de cantilever correct beschrijft en of de bepaalde veerconstante dezelfde orde van grootte heeft als de nominale veerconstante die door de fabrikant van de cantilever is opgegeven. Als dit niet het geval is, moet het aanpasbereik handmatig worden aangepast om ervoor te zorgen dat de pasvorm convergeert naar en de eerste piek van het thermische vermogensspectrum vertegenwoordigt.
    5. Nadat de kalibratie is voltooid, sluit u het venster Kalibratiebeheer . Na het sluiten van de Calibration Manager wordt een kalibratiebestand (*.tnd ascii-bestand) in de vooraf geselecteerde map (zie stap 3.1.2) gegenereerd met de vastgestelde kalibratieresultaten, die later nodig zijn voor de gegevensanalyse. Documenteer de kalibratiewaarden voor toekomstig gebruik tijdens het gegevensanalyseproces, bijvoorbeeld in het laboratoriumnotitieboekje.
      LET OP: Verander vanaf deze stap de laserpositie op de cantilever niet, stel de spiegel in de AFM-kop niet af of verplaats de cantileverhouder. Het wijzigen van deze elementen heeft invloed op de InvOLS en maakt de kalibratiewaarden ongeldig. Om thermische drift te compenseren, past u de positie van de gesegmenteerde fotodiode van de AFM-kop aan.
  3. Analyse van een alveolaire wand op een longgedeelte
    1. Haal het preparaatglaasje uit de vriezer om te evalueren. Laat het monster ongeveer 1 minuut bij kamertemperatuur ontdooien tot het volledige OCT-medium helder is geworden. Voeg vervolgens enkele druppeltjes PBS toe aan het longweefselgedeelte om het te rehydrateren.
    2. Plaats het microscoopglaasje met het longweefselgedeelte op de monsterfase. Installeer de AFM-kop terug op de monstertrap en laat de kop zakken totdat de uitkraging ongeveer 1 mm boven het monster is geplaatst. Voeg wat extra PBS toe aan de zijkant van de draagarmhouder met behulp van een spuit van 1 ml in combinatie met een naald van 0,9 mm x 70 mm totdat er een vloeibare meniscus tussen het weefselgedeelte en de draagarmhouder is gevormd.
    3. Navigeer naar de Instellingen Manager door te klikken op de knop met het moersleutelpictogram in de rechterbovenhoek van de gebruikersinterface. Pas in Instellingenbeheer de volgende algemene instellingen aan. Stel in het gedeelte Naderingsinstellingen de doelhoogte in op 4 μm. Ga vervolgens in het gedeelte Instellingen voor huidige modus naar de Geavanceerde feedbackinstellingen en stel de Multiplier in op 1. Selecteer ten slotte in de subsectie Force-instellingen , die zich ook in de sectie Huidige modusinstellingen bevindt, de optie Ingetrokken piëzo in het vervolgkeuzemenu Modus aan het einde .
    4. Gebruik de omgekeerde optische microscoop om een intacte alveolaire wand te identificeren en ernaar te navigeren. Een intacte muur wordt in het heldere veldbeeld gekenmerkt door donkere en gladde randen. (zie figuur 2A-B).
      OPMERKING: Het importeren van het helderveldbeeld in de AFM-besturingssoftware, indien beschikbaar, kan helpen bij het navigeren van de cantilever naar een bepaalde alveolaire wand en het nauwkeurig vastleggen van een kracht- of QI-kaart erop. In de JPK SPM-software wordt deze functie Direct Overlay genoemd.
    5. Stel de parameters in voor de krachtindrukkingscurven in het linkerbedieningspaneel op basis van de gebruikte AFM, de gebruikte cantilever en de waargenomen steekproef. Voor de NanoWizard 4XP en de MLCT Cantilever F van Bruker raden we de volgende parameters aan: Setpoint = 5 nN; z lengte = 8 μm; Z-snelheid = 300 μm/s.
      OPMERKING: De aanbevolen z-lengte van 8 μm is vrij groot. Dit wordt toegeschreven aan de kenmerken van longweefsel. Aangezien longweefsel doorgaans vrij zacht is, kan de diepte van de inkeping op bepaalde punten oplopen tot 4 μm, zelfs met een relatief bescheiden indrukpunt van 5 nN. Om te garanderen dat de basislijn, wanneer de punt niet in contact komt met het monster, ten minste ongeveer de helft van de krachtindrukkingscurve uitmaakt, wordt aanbevolen de totale lengte van de curve op 8 μm in te stellen. Dit zal de curve-analyse later aanzienlijk vereenvoudigen. Voor andere bio-AFM's zouden deze parameters ook van toepassing moeten zijn, hoewel de nomenclatuur voor bepaalde parameters, zoals het instelpunt, dat de maximale indrukkracht bepaalt, van fabrikant tot fabrikant kan verschillen. Als het AFM-systeem niet in staat is om de hier gegeven hoge verticale snelheid te bereiken, is het noodzakelijk om de z-snelheid te verlagen volgens de aanbeveling van uw AFM-fabrikant.
      LET OP: Om de vergelijkbaarheid van de resultaten te garanderen, is het essentieel om identieke z-benaderingssnelheden te gebruiken voor alle experimenten.
    6. Stel de locatie en grootte van de eerste overzichtskrachtkaart in en zorg ervoor dat deze de gehele alveolaire wand omvat, die zich uitstrekt van de ene luchtzijde naar de andere. Voor longweefselmonsters van muizen is een grootte tussen 20 μm x 20 μm en 30 μm x 30 μm meestal voldoende. Ongeacht de specifieke grootte van de kaart, stelt u het aantal pixels (dat overeenkomt met het aantal geregistreerde krachtcurves) in op 50 x 50. Dit leidt tot het genereren van 2.500 krachtinspringingscurven voor elke kaart, die de nodige resolutie biedt om de BM in het hellingskanaal van de krachtkaart te identificeren. (zie figuur 2C-D).
    7. Onderzoek na het opnemen van de overzichtskaart het hoogte- en hellingskanaal van de krachtkaart. Als het hoogtekanaal aangeeft dat de alveolaire wand intact is (zie figuur 2D) en als het mogelijk is om de BM in het hellingskanaal te onderscheiden als een duidelijk gedefinieerde heldere lijn (zie figuur 2C,E) tussen twee lagen van het epitheel en het endotheel, maak dan een meer gefocusseerde krachtkaart met een grootte van 3 μm x 3 μm of 4 μm x 4 μm op de BM. Houd de pixels op 50 x 50 rondingen.
      OPMERKING: Deze procedure leidt tot een hogere kaartresolutie en maakt het mogelijk om een groter aantal moduluswaarden van Young vast te leggen, met name voor de BM (zie figuur 2E-F). Bovendien maakt dit een nauwkeuriger onderscheid mogelijk tussen het BM en de omliggende weefsels, waardoor de precisie van het daaropvolgende ruimtelijke filterproces wordt verbeterd. Als de kanalen van de overzichtskaart een ingestorte of gescheurde muur laten zien, artefacten als gevolg van het feit dat de uitkraging het monster niet alleen met de punt raakt, of geen identificeerbare BM in het hellingskanaal, navigeer dan naar een andere muur op de weefselsectie totdat een muur met een artefactvrije beoordeling van de BM kan worden geïdentificeerd.
      Herhaal de voorgaande stappen (3.3.6 en 3.3.7) op verdere secties van hetzelfde longmonster totdat het gewenste aantal alveolaire wanden is beoordeeld. Voor elk longmonster worden ten minste vier wanden aanbevolen om robuuste resultaten te bereiken59.
    8. Zodra de meting is voltooid, reinigt u alle apparatuur en materialen die in contact zijn gekomen met het monster en PBS. Als het monster niet meer nodig is, gooi het dan weg in een autoclaveerbare glasafvalcontainer. Sla alle geregistreerde gegevens op en sluit de AFM-besturingssoftware en computer af. Schakel ten slotte alle elektrische apparaten uit die zijn gebruikt.
      OPMERKING: Op dit punt kan het protocol worden gepauzeerd. De experimentele gegevens worden opgeslagen en kunnen op een later tijdstip worden geanalyseerd.

4. Gegevensanalyse

  1. Analyse van kracht-indringingscurven
    OPMERKING: Een gedetailleerde handleiding van de toepassing Krachtcurveanalyse vindt u hier: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
    1. Start de CANTER Processing Toolbox56 in MATLAB en open de applicatie Force Curve Analysis .
      OPMERKING: De Toolbox kan worden gedownload van de GitHub-repository door deze link te volgen: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. Het README.md bestand, bestaande uit een uitgebreide handleiding over het installeren en starten van de software met behulp van MATLAB, is beschikbaar in de GitHub-repository. Meer informatie over elke applicatie die in de Toolbox is opgenomen, is te vinden in de bijbehorende wiki op https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki.
    2. Laad de force-toewijzing met hoge resolutie (3 μm x 3 μm of 4 μm x 4 μm) door op de knop Bestand selecteren te klikken, naar de locatie te navigeren waar de force-toewijzing is opgeslagen, erop te dubbelklikken en vervolgens op de knop Gegevens laden in de gebruikersinterface van de toepassing te klikken.
    3. Er verschijnt een pop-upvenster met een verzoek om de kalibratiewaarden (InvOLS en veerconstante) die zijn bepaald (zie stap 3.2) voor de cantilever die is gebruikt om de krachtkaart vast te leggen die in de vorige protocolstap is geselecteerd. Voer de kalibratiewaarden in de respectievelijke bewerkingsvelden in. Als ze tijdens stap 3.2.4 niet zijn gedocumenteerd, raadpleegt u het automatisch gegenereerde kalibratiebestand, dat ook de kalibratiewaarden bevat. Houd de standaardoptie ja voor de vraag of de scheiding van de stortplaats en de steekproef moet worden berekend. Klik vervolgens op de knop Verzenden om verder te gaan.
    4. Er verschijnt een tweede pop-upvenster waarin u de indentergeometrie en Poisson-verhouding voor het ingesprongen monster kunt selecteren. Selecteer voor de gebruikte MLCT-uitkragingen Vierzijdige piramide als puntgeometrie en voer 17,5° in voor de halve hoek ten opzichte van de rand (beide zijn de standaardwaarden). Gebruik de standaard Poisson-verhouding van 0,5, wat staat voor een niet-samendrukbaar materiaal. Om door te gaan met de laadprocedure van de QI-kaart, klikt u op de knop Verzenden .
      OPMERKING: Tijdens de belastingsprocedure worden de geregistreerde afbuigings-verplaatsingscurven (ruwe gegevens van de AFM) omgezet in krachtindrukkingscurven op basis van de verstrekte kalibratiewaarden. Voor een uitgebreid begrip van de afzonderlijke transformatiestappen en de bijbehorende vergelijkingen, zie de aanvullende informatie van Hartmann et al.59.
    5. Na voltooiing van het laadproces wordt de initiële krachtcurve van de krachtkaart op het scherm weergegeven. Zorg ervoor dat de basislijncorrectiemodus Offset + Tilt is geselecteerd. Deze modus detecteert automatisch de basislijn van de krachtinductiecurve en corrigeert de kanteling en verticale verschuiving naar nul. Selecteer bovendien via het Hertz-model als het algoritme voor de Contact Point Finder en gebruik een waarde van 20% in het daarvoor bestemde bewerkingsveld voor deze optie. Dit algoritme is met name geschikt voor het detecteren van het contactpunt in krachtindrukkingscurven die zijn geregistreerd op monsters van zacht weefsel. Stel ten slotte de inpasdiepte in het bijbehorende bewerkingsveld in op 1,5 μm.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de stijfheid van het microscoopglaasje geen invloed heeft op de resulterende Young's modulus, wordt aanbevolen om de maximale pasdiepte in te stellen op een waarde die niet groter is dan 10% van de dikte van de weefselsectie60. Voor meer details over de correctiealgoritmen, zie de aanvullende informatie van Hartmann et al.59.
      LET OP: Gebruik in alle experimenten dezelfde pasdiepte om te garanderen dat de resultaten vergelijkbaar zijn.
    6. Als u de pasvorm van het gewijzigde Hertz-model wilt toepassen op alle krachtinspringingscurven van de QI-kaart, klikt u op de knop Behouden en toepassen op alles . Er wordt een dialoogvenster geopend met de vraag of elke krachtcurve al dan niet moet worden weergegeven tijdens de analyse. Door de curves niet weer te geven, wordt de verwerkingssnelheid iets versneld.
    7. Na voltooiing van de laatste krachtcurve-analyse verschijnt er een venster met de vraag of de fit-resultaten moeten worden opgeslagen. Om de resultaten in beide op te slaan. tsv (door tabs gescheiden waarden) en .xlsx (Excel) bestandsindelingen, klik op Ja en voer een naam in voor de resultaatbestanden. Bovendien wordt een tekstbestand met de bestandsextensie *.meta_data opgeslagen, dat alle details bevat met betrekking tot de analyse van de curves, zoals de gebruikte kalibratiewaarden, het gekozen pasvormmodel, het geselecteerde contactpuntdetectiealgoritme, het pasvormbereik en andere relevante informatie.
    8. Sluit de toepassing Krachtcurveanalyse door op het kruispictogram in de rechterbovenhoek van het hoofdvenster te klikken.
  2. Ruimtelijke filtering van QI-kaartresultaten
    OPMERKING: De ruimtelijke filterstap zorgt ervoor dat alleen de moduluswaarden van Young van de QI-kaarten die afkomstig zijn van de BM in aanmerking worden genomen voor verdere analyse. Een gedetailleerde handleiding voor de Result Filtering Tool vindt u hier: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
    1. Selecteer de Result Filtering Tool uit de lijst met applicaties in het applicatieselectievenster van de CANTER Processing Toolbox en start de applicatie door op de knop Start Application te klikken.
    2. Als u de pasvormresultaten wilt laden, klikt u op Openen in de bovenste menubalk van de gebruikersinterface van de Resultaatfiltertool . Zoek in het daaropvolgende pop-upvenster de eerste Set-knop op het tabblad JPK Maps en kies het .tsv-bestand dat de resultaten van de analyse van de krachtcurve bevat (zie stap 4.1.6). Klik op de tweede Set-knop en zoek het QI-kaartbestand dat overeenkomt met het reeds geselecteerde .tsv-bestand. Klik vervolgens op Verzenden om de kaartgegevens en de resultaten van de krachtcurveanalyse te laden.
    3. Selecteer de Emodul-optie in het vervolgkeuzemenu Weergegeven kanaal om de verkregen Young's modulus-resultaten als een kaartafbeelding weer te geven. Kies bovendien de optie Emodul (indien nog niet geselecteerd) in het vervolgkeuzemenu Gegevenskanaal onder de histogramplot om de verdeling van de geladen Young's moduluswaarden van de QI-kaart te visualiseren.
    4. Klik op de pijl Manipulatiestroom , die zich in het midden van de gebruikersinterface bevindt, en zorg ervoor dat deze naar de rechterkant wijst. Zet de schakelknop voor het afbeeldingsfilter op de positie Aan in het filterpaneel boven de histogramassen. Selecteer de optie Uit de vrije hand in het vervolgkeuzemenu Geometrie filteren en klik vervolgens op de knop Toevoegen .
    5. Teken in de afbeelding van het bovenste kanaal het filtermasker door de BM te omcirkelen terwijl u de linkermuistoets ingedrukt houdt. De BM is in de Young's moduluskaart herkenbaar als een heldere (hoge Young's moduluswaarden) structuur in vergelijking met het aangrenzende zachtere weefsel (zie figuur 3A). Wanneer u klaar bent met het tekenen van het masker, laat u de linkermuistoets los en dubbelklikt u op het masker dat op de kaart moet worden toegepast. De histogramgrafiek aan de rechterkant toont nu alleen de moduluswaarden van Young voor de kaartgebieden die groen zijn gemarkeerd (de standaardkleur; zie Figuur 3C-D).
    6. Als u een nieuw .tsv-resultaatbestand wilt maken dat alleen de gemaskeerde moduluswaarden van Young bevat, klikt u in de bovenste menubalk van de gebruikersinterface op Opslaan > histogram opslaan > Gegevens opslaan. U kunt ook met de rechtermuisknop op een leeg gebied van de histogramplotassen klikken en gegevens opslaan selecteren in het contextmenu.
    7. Klik op Alles selecteren in het pop-upvenster waarin u wordt gevraagd naar welke resultaten u naar het .tsv-bestand moet schrijven. Bevestig vervolgens de selectie door op de knop OK te klikken. Voer daarna een naam in voor het .tsv-bestand in het dialoogvenster Opslaan, kies de gewenste opslaglocatie en klik ten slotte op OK om de gefilterde resultaten op te slaan.
    8. Sluit de tool voor het filteren van resultaten door op het kruispictogram in de rechterbovenhoek van de applicatie te klikken.
  3. R2 filteren van resultaten
    OPMERKING: Deze protocolstap zorgt ervoor dat alleen de modulusresultaten van Young in aanmerking worden genomen als het gewijzigde Hertz-model een goede overeenkomst vertoonde met de kracht-indrukkingscurve waarop het was gemonteerd. Een gedetailleerde handleiding voor de R² Filtering Tool vindt u hier: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
    1. Start de R² Filtering Tool door deze te selecteren in de lijst met applicaties van het applicatieselectievenster van de CANTER Processing Toolbox en te klikken op Start Application.
    2. Navigeer naar de bovenste menubalk van de gebruikersinterface en klik op .tsv-bestand openen. Zoek in het dialoogvenster voor het volgende laadbestand het .tsv-bestand met de Young's modulusresultaten van de BM die tijdens de vorige stap 4.2.5 is opgeslagen en selecteer het door te dubbelklikken.
    3. Er verschijnt een dialoogvenster met een lijst met de gegevenskolommen in het TSV-bestand. Selecteer Emodul als de kolom met de modulusgegevens van Young. Kies vervolgens in een apart keuzelijstdialoogvenster waarin om de R²-gegevens wordt gevraagd, rsquare_fit. Zodra de laadprocedure is voltooid, worden de geladen modulusgegevens van Young weergegeven in de vorm van een histogram linksboven in het scherm, terwijl de R²-gegevensverdeling wordt weergegeven in de grafiek rechtsboven.
    4. Voer 0,96 in het bewerkingsveld in het midden van de grafische gebruikersinterface in. Klik op de knop Gegevens filteren om het R²-filter toe te passen met behulp van de ingevoerde waarde. Met deze actie worden alleen de resultaten behouden die een R²-waarde van 0,96 of hoger hebben. De gefilterde verdelingen van de Young's modulus-resultaten en de bijbehorende R²-waarden worden weergegeven in de onderste helft van de gebruikersinterface.
    5. Selecteer Gefilterde gegevens opslaan in de bovenste menubalk om een nieuw .tsv-bestand te maken dat alleen de resultaten bevat die voldoen aan het gedefinieerde R²-filtercriterium van > 0,96. De opgeslagen gegevens kunnen nu bijvoorbeeld als histogram worden weergegeven met behulp van de Histogram Plotting Tool, die de modulusverdeling van Young voor de onderzochte pulmonale BM visualiseert (zie figuur 4A).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de identificatie en meting van een intacte alveolaire wand, is het primaire resultaat van dit protocol de gefilterde Young's moduluswaarden van de BM. Het is belangrijk op te merken dat het niet mogelijk is om in elke weefselsectie een geschikte alveolaire wand te vinden voor AFM-meting. In onze experimentele waarnemingen vertoonde ongeveer 75% van de cryosecties afkomstig van longmonsters van muizen een kwantificeerbare alveolaire wand. Om de ruimtelijke verdeling van de modulus van Young in een pulmonale BM nauwkeurig te bepalen, adviseren we om krachtkaarten te gebruiken die 3 μm x 3 μm of 4 μm x 4 μm beslaan. Deze aanpak zorgt voor voldoende resolutie voor het onderzoeken van pulmonale BM's van muizen, die doorgaans 100 nm - 200 nm dik zijn. Daarom omvat de experimentele benadering het vastleggen van 50 x 50 krachtcurven voor elke krachtkaart, wat een totaal van 2.500 krachtcurven oplevert. Binnen de krachtkaart zijn de krachtcurven gelijkmatig verdeeld. Dit impliceert dat naast de Young's modulus van de BM, de weefselstructuren rond de BM worden onderzocht, zelfs in de kleine krachtkaarten. Om de Young's modulus uitsluitend van de pulmonale BM nauwkeurig en selectief te bepalen, hebben we daarom een filterproces in twee stappen in dit protocol geïmplementeerd.

De eerste filterstap van operator-afhankelijke ruimtelijke filtering selecteert de resultaten van de krachtcurve die afkomstig zijn van de pulmonale BM van muizen, die ongeveer 10% tot 25% van de totale resultaatwaarden in de geanalyseerde krachtkaart uitmaken. Na deze eerste ruimtelijke filtering worden ongeveer 250 - 625 fit-resultaten bewaard voor verdere analyse. De volgende filterstap zorgt ervoor dat alleen de BM-gerelateerde resultaten die afkomstig zijn van krachtcurven die adequaat zijn beschreven door het gewijzigde Hertz-model, worden opgenomen. Daarom wordt de bepalingscoëfficiënt (R2) van het gewijzigde Hertz-model fit als filtercriterium gebruikt. Onze empirische ervaring suggereert dat het houden van resultaten met R2-waarden hoger dan 0,96 geschikt is voor fit-resultaten die worden verkregen door zich aan dit protocol te houden. Het is belangrijk op te merken dat de R2-waarde aanzienlijk wordt beïnvloed door de kwaliteit (gladheid) en lengte van de basislijn van de krachtcurve, de bepaling van het contactpunt en de convergentie van het aangepaste model. Na de toepassing van beide filterprocedures blijven er doorgaans ongeveer 100 tot 500 Young's moduluswaarden over voor de BM van een enkele alveolaire wand.

De verdeling van deze resterende Young's moduluswaarden van de BM kan worden gevisualiseerd met behulp van een histogram (Figuur 4A). Het is belangrijk op te merken dat de resulterende Young's moduluswaarden van de pulmonale BM een log-normale verdeling volgen, die gewoonlijk wordt waargenomen voor willekeurige variabelen die alleen positieve waarden kunnen bereiken61. Dit wordt gevisualiseerd door de QQ-plot in figuur 4B. Bijgevolg kan een normale (Gaussische) verdeling worden toegepast op de verdeling van de log-getransformeerde Young's modulus (E) waarden. Hier werd de natuurlijke logaritme (ln) gebruikt om de E-waarden te transformeren. De piekpositie van de verdeling (μ) en standaarddeviatie (σ) werden uit deze fit geëxtraheerd en vervolgens opnieuw getransformeerd om de representatieve Young's modulus te verkrijgen, aangeduid als EBM, met behulp van de volgende vergelijking:

figure-results-1

Merk op dat na de retransformatie het standaarddeviatie-interval niet langer symmetrisch is rond de piekwaarde. De negatieve (σ-) en positieve (σ+) randen van het standaarddeviatie-interval kunnen worden berekend met behulp van de volgende uitdrukkingen:

figure-results-2

figure-results-3

Deze vergelijkingen zijn een gevolg van het feit dat de exponentiële functie de inverse functie van de natuurlijke logaritmeis 62.

Na het opnieuw transformeren van de piekwaarde μ = 9,31 en de standaarddeviatie σ = 0,18 bepaald op basis van het histogram in figuur 4A, is de representatieve moduluswaarde van Young EBM = 11,05 kPa met een standaarddeviatie-interval van [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Als alternatief kan een log-normale verdeling worden aangepast aan het histogram van niet-getransformeerde Young's modulus (E)-waarden om de karakteristieke parameters van de verdeling te bepalen.

Het wordt aanbevolen om ten minste vier wanden per muis te analyseren om een robuust representatief resultaat te verkrijgen, zoals we in detail hebben aangetoond in Hartmann et al.59. Om de representatieve Young's modulus EBM voor een muis te bepalen, werden de log-getransformeerde waarden van alle vier de muren uitgezet in één gecombineerd histogram en werden μ en σ bepaald door een normale verdeling aan te passen. Vervolgens worden μ en σ opnieuw getransformeerd zoals eerder beschreven om EBM en het standaarddeviatie-interval voor de muis van de proefpersoon op te halen.

figure-results-4
Figuur 1: Overzicht van de belangrijkste protocolstappen om de Young's modulus van een muizen pulmonale basaalmembraan te bepalen. De eerste stap is het verkrijgen en voorbereiden van muizenlongen, gevolgd door het inbedden ervan. Daarom wordt de long geïnjecteerd met een combinatie van OCT-medium en PBS en vervolgens volledig ondergedompeld in de OCT-verbinding. Daarna worden 15 μm dikke longweefselcoupes verkregen door cryosectie met een cryotoom. In dit protocol beschrijven we het proces van het gebruik van enkelzijdige en tweezijdige plakband om monsters tijdens het snijproces op hun plaats te houden. Vervolgens worden de moduluswaarden van de Young van de BM bepaald door middel van AFM-krachtkaartmetingen op de weefselsecties. Na voltooiing van het analyseproces van de krachtcurve worden ruimtelijke en R²-filtering toegepast om de Young's modulusresultaten te isoleren van de structuur van belang, met name de BM (weergegeven in groen in de krachtkaart en gekwantificeerd in de log-getransformeerde Young's modulusverdeling). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 2: Een voorbeeldig AFM-experiment van de krachtkaart dat op een sectie van het longweefsel van muizen wordt uitgevoerd. (A) Het overzichtsbeeld van de helderveldmicroscopie van een sectie van het longweefsel van muizen, die de identificatie van geschikte intacte alveolaire wanden mogelijk maakt die zich tussen twee longblaasjes bevinden. Aan de rechterkant van de afbeelding is de driehoekige MLCT-uitkraging F van de AFM zichtbaar. (B) Vergrote weergave van een geselecteerde wand binnen de weefselsectie. (C) Helling en (D) hoogtekanaal van een overzichtskaart van 15 x 15 μm met 50 x 50 krachtcurven van de alveolaire wand. In het hellingskanaal kan de BM worden geïdentificeerd als een heldere lijn (witte pijl), die een structuur van verhoogde stijfheid in de muur aangeeft. Het hoogtekanaal bevestigt de integriteit van de muur en vertoont geen tekenen van breuk. Na de identificatie van de BM in de overzichtskaart van 15 x 15 μm, wordt een kleinere kaart van 4 x 4 μm (E: hellingskanaal, F: hoogtekanaal) met 50 x 50 krachtcurven geregistreerd. Schaalbalken: (A) 200 μm en (B-D) 25 μm. De bereiken van de kleurenschalen van de getoonde AFM-beelden zijn (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (overzichtsbeeld) en 2,42 - 8,37 nN/μm (kleiner beeld), (F) 0 - 3,38 μm (overzichtsbeeld) en 0 - 1,99 μm (kleiner beeld), van donker tot helder. Lineaire kleurenschalen werden gebruikt voor alle AFM-beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 3: Visualisatie van de ruimtelijke filterprocedure. (A) De moduluskaart van Young die het resultaat is van de analyse van de krachtcurve, zoals weergegeven in de Result Filtering Tool om de ruimtelijke filtering van de resultaten mogelijk te maken. De BM is herkenbaar als een heldere (hoge moduluswaarden van Young) streep omgeven door zachtere weefselcompartimenten. (B) Histogram van de moduluswaarden van Young die overeenkomen met de ongefilterde kaart (A). Na de (C) toepassing van het ruimtelijke filtermasker (groen gebied), (D) bevat het histogram uitsluitend de moduluswaarden van Young uit het groen gemarkeerde gebied, dat werd geïdentificeerd als de BM. Merk op dat de resterende zachte waarden die aan de linkerkant van het histogram waarneembaar zijn, kunnen worden toegeschreven aan slecht convergerende fits, die in de volgende R²-filterstap zullen worden geëlimineerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 4: Young's modulusverdeling van een muizenpulmonale BM ontvangen door dit protocol te volgen. (A) Log-genormaliseerd histogram van de resulterende BM Young's moduluswaarden (N = 325). Door een normale verdeling (zwarte ononderbroken lijn) aan te passen, wordt de gemiddelde waarde μ = 9,31 met een standaarddeviatie van σ = 0,18 bepaald. Na retransformatie komt dit overeen met een Young's modulus van de BM van EBM = 11,05 kPa met een asymmetrisch standaarddeviatie-interval van [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ Grafiek van de kwantielen van de logaritmische moduluswaarden van BM Young versus de kwantielen van een standaard normale verdeling. Deze grafiek laat zien dat, met uitzondering van enkele waarden in de linker- en rechterstaart van de verdeling, de resulterende moduluswaarden van Young voornamelijk log-normaal verdeeld zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mechanische eigenschappen van BM's hebben veel belangstelling gekregen vanwege hun invloed op verschillende cellulaire functies, zoals tumorontluiking, cellulaire differentiatie, celbeweging en de toegankelijkheid van chromatine 53,63,64,65,66,67,68 . Bijgevolg bestaat er een onvervulde kloof in het vermogen om BM-mechanica op een consistente en meetbare manier te beoordelen. Dit protocol heeft tot doel AFM-gebruikers in staat te stellen de Young's modulus van pulmonale BM's te bepalen uit gezonde of pathologische muizenlongmonsters die zijn verkregen uit wildtype of genetisch gemodificeerde muizen. De gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface op basis van MATLAB-applicatie CANTER Processing Toolbox56 vergemakkelijkt de stroomafwaartse analyse van AFM-gegevens. Dit protocol zal naar verwachting nuttig zijn voor andere onderzoekers die studies uitvoeren die kunnen leiden tot vooruitgang in klinische diagnose, beheer of nieuwe behandelingsstrategieën voor longaandoeningen.

Kritieke stappen in het protocol zijn onder meer ervoor zorgen dat tijdens de cryosectie van het longmonster de weefselsecties op geen enkel moment ontdooien om veranderingen van de mechanische eigenschappen als gevolg van vries-dooicycli te voorkomen. Daarom is het essentieel om alleen voorgekoelde microscoopglaasjes te gebruiken om de secties te verzamelen en deze alleen in de kamer van de cryotoom te hanteren. De meest cruciale stap tijdens de registratie van krachtkaarten op een alveolaire wand is het gebruik van het gegenereerde hellingsbeeld, dat een kwalitatief overzicht geeft van de stijfheidsverdeling van het onderzochte gebied, om een geschikte meetlocatie van de BM te identificeren. De ruimtelijke filtering van de verkregen Young's moduluswaarden vormt een cruciale stap in het protocol en is een belangrijk kenmerk van de CANTER Processing Toolbox. Deze filterstap stelt de onderzoeker in staat om de BM, die zich tussen twee zachtere cellagen bevindt, te identificeren aan de hand van zijn kenmerkende stijvere voetafdruk en de overeenkomstige Young's moduluswaarden van de BM te extraheren voor verdere analyse.

Deze geavanceerde analyseworkflow onthulde dat netrin-4 knock-outmuizen een aanzienlijk (ongeveer tweevoudig) hogere Young's modulus in hun longbasaalmembraan vertoonden in vergelijking met wildtype nestmuizen53. Het huidige protocol vergemakkelijkt dus de vergelijkende analyse van verschillende aandoeningen of groepen.

Naast AFM bestaan er tal van methodologieën voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van biomaterialen, waaronder optische of magnetische pincetten 69,70,71 op moleculair niveau, micro-indentatietechnieken 72,73 op een tussenliggende schaal en beperkte of onbeperkte compressietesten74,75 op macroscopisch niveau. Met name drukmyografie, trektesten76,77 en reologie78 zijn gebruikt om de BM-stijfheid van vasculaire monsters en gereconstitueerde BM-matrices te beoordelen. Technieken zoals drukmyografie en trektesten kunnen echter alleen de mechanische kenmerken van complete weefsels of hele weefselstructuren, zoals hele bloedvaten, beoordelen, die verschillende cellagen en structurele elementen bevatten. Als gevolg hiervan worden bij het gebruik van deze methoden om de biomechanica van BM te evalueren, de mechanische eigenschappen van niet-BM, zoals cellulaire componenten, altijd over de BM-resultaten heen gelegd, waardoor het moeilijk wordt om de specifieke eigenschappen van de BM zelf te isoleren.

In dit protocol wordt de functie van belang (BM) geëxtraheerd door ruimtelijke filtering van de resultaten van de krachtkaart. Een beperking van deze benadering is de vereiste dat het kenmerk van belang waarneembaar en identificeerbaar is als een duidelijk patroon in de verkregen moduluskaarten van Young of een ander beschikbaar kaartkanaal. De BM in alveolair weefsel is bijvoorbeeld alleen identificeerbaar vanwege de onderling verbonden structuur, die een significant hogere Young's modulus vertoont in vergelijking met de omringende cellen. Bijgevolg manifesteert de BM zich als een continue heldere streep in de verkregen Young's moduluskaarten. Niettemin vertonen andere biologische structuren mechanische eigenschappen die niet voldoende verschillen van die van het omringende weefsel om ruimtelijke filtering in de kaartresultaten mogelijk te maken. Hoewel het protocol kan worden gecombineerd met andere methoden om structuren in de geregistreerde krachtkaarten te identificeren, zoals immunofluorescentiekleuring, kan deze benadering resultaten opleveren die moeilijk te interpreteren zijn. Deze complicatie kan optreden omdat kleuringsprocedures de mechanische eigenschappen van weefsels kunnen veranderen. Bijgevolg mag elke verwerking of kleuring van het weefsel voorafgaand aan AFM-metingen alleen worden uitgevoerd als er geen alternatieve methode beschikbaar is om het kenmerk van belang te identificeren. Bovendien is het belangrijk om de juiste controle-experimenten uit te voeren waarbij de biomechanische eigenschappen van gekleurde en niet-gekleurde monsters worden vergeleken.

Het protocol introduceert een methode voor het identificeren van doelstructuren op basis van het moduluscontrast van Young. Bijgevolg kan het worden aangebracht op weefsels met een anatomische BM die vergelijkbaar is met die van de longen, inclusief de schildklier, dikke darm en prostaat. (zie Uitgebreide gegevensfiguur in Hartmann et al.59). Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld voor het analyseren van BM-mechanica, zijn dit protocol en de CANTER Processing Toolbox56 veelzijdig genoeg om elk mechanisch onderscheiden en verbonden gebied binnen AFM-krachtkaarten te onderzoeken (zie de instructies op www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki). Deze brede toepasbaarheid maakt deze tool waardevol in het hele AFM-veld en ondersteunt de toenemende aandacht voor mechanobiologie in de bredere wetenschappelijke gemeenschap.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BH en HC-S. erkenning van financiering van het Beierse staatsministerie van Wetenschap en Kunsten via de Beierse onderzoeksfocus Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) en het Beierse Academische Forum (BayWISS)-Doctoral Consortium Health Research. De ontwikkeling van de data-analysesoftware CANTER Processing Toolbox werd gefinancierd door de Duitse Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek als onderdeel van deelproject 1 (CL 409/4-1/2) van het onderzoeksconsortium Exploring articular cartilage and subchondral bone degeneration and regeneration in osteoarthritis - ExCarBon (FOR2407-1/2). B.H. en H.C.-S. erken financiering van de Duitse Onderzoeksstichting via de grote instrumentatiecampagne GGA-HAW (INST 99/38-1). Dit werk werd verder ondersteund door de Deense Kankervereniging (R204-A12454 (R.R.)) en de Duitse Onderzoeksstichting (539446614 tot R.R.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL SyringeB Braun9166017VInjekt-F
10 mL SyringeB Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 mL Falcon tubeSarstedt62.554.002screw cap tube
Cantilever - MLCTBruker AFM Probes3444AFM cantilever met een piramidale tipvorm
Cryotome bladesLeica Biosystems14035843496Laagprofiel wegwerpbladen DB80LX
Cryotome sample holderLeica Biosystems14047740044Specimen disc 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay ExtensionBrukerSoftware-extensie voor de JPK SPM Software die het importeren van de optische afbeelding van de omgekeerde microscoop in de Data Viewer van de SPM-software mogelijk maakt.
Disposable base moldScience ServicesSA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
Double-sided tapetesa Film56661-00002Fotofilmtape
Fixed-Spring Cantilever HolderBruker
Inverted Microscope - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK Motorized StageBruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM SoftwareBruker
K5 CMOS Microscope KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksVersie R2024a of hoger
MATLAB - Curve Fitting Toolbox Mathworks
MATLAB - Image Processing ToolboxMathworks
MATLAB - Signal Processing Toolbox Mathworks
MATLAB - Statistics and Machine Learning ToolboxMathworks
Microscope slidesCarl RothH869.1Eenvoudige microscoopglazen voor cantilever-kalibratie
Microscope slides - frosted edgeCarl RothH870.1Microscoopglazen met ontsmette rand voor cryosectie
Needle ø0.9 mm × 25 mmB Braun4657500OCT-injectie  in het longmonster
Needle ø0.9 mm × 70 mmB Braun4665791Lange naald om PBS toe te passen onder de AFM
OCT compoundSakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. Compound
Phosphate Buffered SalineBio&SellBS.L1825PBS-oplossing zonder Ca2+, Mg2+, 500 mL
QI Advanced Imaging ExtensionBrukerSoftware-extensie voor de JPK SPM Software die voor elke opgenomen beeldpixel de volledige onderliggende krachtcurve biedt.
ScalpelB Braun5518083Chirurgisch wegwerp-scalpel
ScissorsKaut-BullingerM681700Precieze schaar 13 cm 
Single-sided tapetesa Film57330-00000kristallen heldere tape, 33 m x 19 mm
Slide boxGWL Storing SystemsK50WDiabox voor 50 dia's
Stereo Microscope - Stemi DR1663Zeiss
Tweezers - Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsteens, D., et al. Atomic force microscopy-based characterization and design of biointerfaces. Nat Rev Mater. 2 (5), 17008(2017).
  2. Aro, E., et al. Severe extracellular matrix abnormalities and chondrodysplasia in mice lacking collagen prolyl 4-hydroxylase isoenzyme II in combination with a reduced amount of isoenzyme I. J Biol Chem. 290 (27), 16964-16978 (2015).
  3. Domke, J., Radmacher, M. Measuring the elastic properties of thin polymer films with the atomic force microscope. Langmuir. 14 (12), 3320-3325 (1998).
  4. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), e0220281(2019).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: validation with a gel-microfiber composite. Biophys J. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  7. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nanotechnol. 7 (11), 757-765 (2012).
  8. Prein, C., et al. Structural and mechanical properties of the proliferative zone of the developing murine growth plate cartilage assessed by atomic force microscopy. Matrix Biol. 50, 1-15 (2016).
  9. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophys J. 70 (1), 556-567 (1996).
  10. Radmacher, M., Tillamnn, R. W., Fritz, M., Gaub, H. E. From molecules to cells: imaging soft samples with the atomic force microscope. Science. 257 (5078), 1900-1905 (1992).
  11. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nat Nanotechnol. 4, 186-192 (2009).
  12. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophys J. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  13. Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  14. Hansma, P. K., et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids. Appl Phys Lett. 64 (13), 1738-1740 (1994).
  15. Moy, V. T., Florin, E. L., Gaub, H. E. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. Science. 266 (5183), 257-259 (1994).
  16. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, H. G., Hansma, P. K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. Science. 265 (5178), 1577-1579 (1994).
  17. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, P. K. Imaging soft samples with the atomic force microscope: gelatin in water and propanol. Biophys J. 69 (1), 264-270 (1995).
  18. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat Struct Biol. 6 (4), 346-349 (1999).
  19. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  20. Drake, B., et al. Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope. Science. 243 (4898), 1586-1589 (1989).
  21. Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical stability of single DNA molecules. Biophys J. 78 (4), 1997-2007 (2000).
  22. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophys J. 78 (1), 520-535 (2000).
  23. Lekka, M., et al. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy. Eur Biophys J. 28 (4), 312-316 (1999).
  24. Weisenhorn, A. L., Khorsandi, M., Kasas, S., Gotzos, V., Butt, H. J. Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM. Nanotechnology. 4 (2), 106(1993).
  25. Rotsch, C., Jacobson, K., Radmacher, M. Dimensional and mechanical dynamics of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by using atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (3), 921-926 (1999).
  26. Goldmann, W. H., Ezzell, R. M. Viscoelasticity in wild-type and vinculin-deficient (5.51) mouse F9 embryonic carcinoma cells examined by atomic force microscopy and rheology. Exp Cell Res. 226 (1), 234-237 (1996).
  27. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomater. 126, 315-325 (2021).
  28. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthr Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  29. Kinney, J. H., Balooch, M., Marshall, S. J., Marshall, G. W. Jr, Weihs, T. P. Atomic force microscope measurements of the hardness and elasticity of peritubular and intertubular human dentin. J Biomech Eng. 118 (1), 133-135 (1996).
  30. Symposium on Thin Films - Stresses and Mechanical Properties VI,. 1996 MRS Spring Meeting. Lundkvist, A., et al. , 353-358 (1997).
  31. Tao, N. J., Lindsay, S. M., Lees, S. Measuring the microelastic properties of biological material. Biophys J. 63 (4), 1165-1169 (1992).
  32. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Eng Med Biol Mag. 16 (2), 47-57 (1997).
  33. Becke, T. D., et al. Pilus-1 backbone protein RrgB of Streptococcus pneumoniae binds collagen I in a force-dependent way. ACS Nano. 13 (6), 7155-7165 (2019).
  34. Becke, T. D., et al. Single molecule force spectroscopy reveals two-domain binding mode of Pilus-1 tip protein RrgA of Streptococcus pneumoniae to fibronectin. ACS Nano. 12 (1), 549-558 (2018).
  35. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical activation drastically accelerates amide bond hydrolysis, matching enzyme activity. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  36. Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Single-molecule force-clamp experiments reveal kinetics of mechanically activated silyl ester hydrolysis. ACS Nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).
  37. Docheva, D., et al. Researching into the cellular shape, volume and elasticity of mesenchymal stem cells, osteoblasts and osteosarcoma cells by atomic force microscopy. J Cell Mol Med. 12 (2), 537-552 (2008).
  38. Docheva, D., Padula, D., Schieker, M., Clausen-Schaumann, H. Effect of collagen I and fibronectin on the adhesion, elasticity and cytoskeletal organization of prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 361-366 (2010).
  39. Kiderlen, S., et al. Age related changes in cell stiffness of tendon stem/progenitor cells and a rejuvenating effect of ROCK-inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 509 (3), 839-844 (2019).
  40. Reuten, R., et al. Structural decoding of netrin-4 reveals a regulatory function towards mature basement membranes. Nat Commun. 7, 13515(2016).
  41. Fleischhauer, L., et al. Nano-scale mechanical properties of the articular cartilage zones in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Appl Sci. 12 (5), 2596(2022).
  42. Alberton, P., et al. Aggrecan hypomorphism compromises articular cartilage biomechanical properties and is associated with increased incidence of spontaneous osteoarthritis. Int J Mol Sci. 20 (5), 1-16 (2019).
  43. Alberton, P., et al. Aggrecan is critical in maintaining the cartilage matrix biomechanics which in turn influences the correct development of the growth plate. Osteoarthr Cartilage. 27, S178-S178 (2019).
  44. Gronau, T., et al. Forced exercise-induced osteoarthritis is attenuated in mice lacking the small leucine-rich proteoglycan decorin. Ann Rheum Dis. 76 (2), 442-449 (2017).
  45. Hartmann, B., et al. Early detection of cartilage degeneration: A comparison of histology, fiber Bragg grating-based micro-indentation, and atomic force microscopy-based nano-indentation. Int J Mol Sci. 21 (19), 7384-7398 (2020).
  46. Rellmann, Y., et al. ER stress in ERp57 knockout knee joint chondrocytes induces osteoarthritic cartilage degradation and osteophyte formation. Int J Mol Sci. 23 (1), 182(2021).
  47. Kamper, M., et al. Early changes in morphology, bone mineral density and matrix composition of vertebrae lead to disc degeneration in aged collagen IX -/- mice. Matrix Biol. 49, 132-143 (2016).
  48. Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. Characterizing the elastic properties of tissues. Mater Today. 14 (3), 96-105 (2011).
  49. Junior, C., et al. Baseline stiffness modulates the non-linear response to stretch of the extracellular matrix in pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12928(2021).
  50. Junior, C., et al. Multi-step extracellular matrix remodelling and stiffening in the development of idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 24 (2), 1708(2023).
  51. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. J Mech Behav Biomed Mater. 74, 118-127 (2017).
  52. Zemla, J., et al. AFM-based nanomechanical characterization of bronchoscopic samples in asthma patients. J Mol Recognit. 31 (12), e2752(2018).
  53. Reuten, R., et al. Basement membrane stiffness determines metastases formation. Nat Mater. 20 (6), 892-903 (2021).
  54. Johnstone, A. H. CRC Handbook of Chemistry and Physics. J Chem Technol Biotechnol. 50 (2), 294-295 (1991).
  55. Rico, F., et al. Probing mechanical properties of living cells by atomic force microscopy with blunted pyramidal cantilever tips. Phys Rev E. 72 (2), 1-10 (2005).
  56. CANTER Processing Toolbox v.5.7.0. , GitHub. (2022).
  57. Hutter, J. L. J. B. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64 (7), 1868-1873 (1993).
  58. Schillers, H., et al. Standardized nanomechanical atomic force microscopy procedure (SNAP) for measuring soft and biological samples. Sci Rep. 7 (1), 5117(2017).
  59. Hartmann, B., et al. Profiling native pulmonary basement membrane stiffness using atomic force microscopy. Nat Protoc. 19 (5), 1498-1528 (2024).
  60. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys J. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  61. Jolicoeur, P. Introduction to Biometry. , Springer US. Boston, MA. (1999).
  62. Bronshtein, I. N., Semendyayev, K. A., Musiol, G., Mühlig, H. Handbook of Mathematics. , 6th Edition, Springer. Berlin. (2015).
  63. Fiore, V. F., et al. Mechanics of a multilayer epithelium instruct tumour architecture and function. Nature. 585 (7825), 433-439 (2020).
  64. Koester, J., et al. Niche stiffening compromises hair follicle stem cell potential during ageing by reducing bivalent promoter accessibility. Nat Cell Biol. 23 (7), 771-781 (2021).
  65. Bedzhov, I., Zernicka-Goetz, M. Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell. 156 (5), 1032-1044 (2014).
  66. Kyprianou, C., et al. Basement membrane remodelling regulates mouse embryogenesis. Nature. 582 (7811), 253-258 (2020).
  67. Saraswathibhatla, A., Indana, D., Chaudhuri, O. Cell-extracellular matrix mechanotransduction in 3D. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 495-516 (2023).
  68. Sherwood, D. R. Basement membrane remodeling guides cell migration and cell morphogenesis during development. Curr Opin Cell Biol. 72, 19-27 (2021).
  69. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11 (5), 288(1986).
  70. Marago, O. M., Jones, P. H., Gucciardi, P. G., Volpe, G., Ferrari, A. C. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 8 (11), 807-819 (2013).
  71. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  72. Marchi, G., et al. Microindentation sensor system based on an optical fiber Bragg grating for the mechanical characterization of articular cartilage by stress-relaxation. Sens Actuators B. 252, 440-449 (2017).
  73. Wakitani, S., et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel. Tissue Eng. 4 (4), 429-444 (1998).
  74. Moutos, F. T., Freed, L. E., Guilak, F. A biomimetic three-dimensional woven composite scaffold for functional tissue engineering of cartilage. Nat Mater. 6 (2), 162-167 (2007).
  75. Schwarz, S., et al. Contactless vibrational analysis of transparent hydrogel structures using laser-Doppler vibrometry. Exp Mech. 60 (8), 1067-1078 (2020).
  76. Bhave, G., Colon, S., Ferrell, N. The sulfilimine cross-link of collagen IV contributes to kidney tubular basement membrane stiffness. Am J Physiol Renal Physiol. 313 (3), F596-F602 (2017).
  77. Fisher, R. F., Wakely, J. The elastic constants and ultrastructural organization of a basement membrane (lens capsule). Proc R Soc Lond B Biol Sci. 193 (1113), 335-358 (1976).
  78. Wisdom, K. M., et al. Covalent cross-linking of basement membrane-like matrices physically restricts invasive protrusions in breast cancer cells. Matrix Biol. 85-86, 94-111 (2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Pulmonale basaalmembraankrachtmappingmechanica van de basaalmembraancryosectieextracellulaire matrixlongweefselkracht indentatiecurvenCANTER Processing Toolbox

Gerelateerde artikelen