Methodenartikel

Toepassing van een nieuwe hyaluronzuurhydrogel voor driedimensionale follikelcultuur en methodologie voor cryopreservatie van de ovariële follikel bij muizen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67786

⸱

9 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cleveland Clinic Fertility Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een nieuw driedimensionaal (3D) kweekmodel waarbij gebruik wordt gemaakt van een tyramine-gekoppelde hyaluronzuurhydrogel om preantrale follikels uit de eierstok van de muis in te kapselen en te kweken. We beschrijven ook twee benaderingen van cryopreservatie van de ovariële follikel door vitrificatie.

Samenvatting

De 3D-architectuur van de ovariële follikel en de complexe interacties tussen somatische celcomponenten en de eicel die nodig zijn voor cytoplasmatische en nucleaire rijping zijn moeilijk te handhaven in conventionele tweedimensionale (2D) kweeksystemen. We beschrijven een nieuw 3D-kweekmodel met behulp van een tyramine-gekoppelde hyaluronzuurhydrogel voor het inkapselen en kweken van ovariële follikels van muizen. De hyaluron-inkapselingstechniek maakt 3D-groei van follikels en behoud van trofische factoren in de nabijheid van de zich ontwikkelende follikels mogelijk. Deze hydrogel is zeer veelzijdig en kan zowel op geïsoleerde follikels als op eierstokweefselfragmenten worden aangebracht. De visco-elastische eigenschappen van de HA-gel maken het mogelijk om de stijfheid aan te passen en de vormbaarheid te bieden op basis van de gelconcentratie. Preantrale follikels die zich in dit cultuurmodel ontwikkelen, zijn in staat om de meiotische rijping binnen 10-12 dagen na kweek te voltooien en een metafase II-eicel te ovuleren bij activering met hCG. Dit artikel beschrijft ook twee benaderingen van cryopreservatie van de ovariële follikel door vitrificatie.

Inleiding

Menselijke in-vitrofolculogenese blijft een uitdaging, zelfs vier decennia na de eerste geboorte door in-vitrofertilisatie. Tot opheden ontbreekt er nog steeds een methodologie voor menselijke ovariële follikelcultuur die de productie van een levensvatbaar embryo ondersteunt, wat resulteert in een gezonde baby. De optimale fysische eigenschappen die nodig zijn voor de groei van menselijke in vitro follikels moeten nog worden bepaald. De intacte eierstok is bevolkt met duizenden follikels in verschillende stadia van ontwikkeling, en de regulering van hun groei is een complex proces (Figuur 1)2. Kiemblaasjes (GV) eicellen van menselijke preantrale follikels hebben in cultuur wel 30 dagen nodig om meiotisch volwassen te worden en de metafase II fase3 te bereiken. Bidirectionele communicatie tussen de eicel en de omliggende granulosacellen via gap junctions is van cruciaal belang voor cytoplasmatische en nucleaire rijping 4,5,6.

Conventionele 2D-kweeksystemen zijn niet ideaal voor follikelkweek, vooral niet in grotere zoogdiermodellen die langere tijd in cultuur vergen. Follikels hechten zich aan de schaal en de link tussen granulosacellen en de eicel wordt zwakker naarmate granulosacellen wegmigreren. Driedimensionale (3D) kweeksystemen voor follikels zijn daarom naar voren gekomen als een middel om in vivo fysiologie beter na tebootsen 7,8.

Inkapseling van follikels in een matrix om 3D-groei te bevorderen, is een benadering geweest voor het behoud van de folliculaire architectuur tijdens in vitro cultuur (IVC). Biomatrices van natuurlijke polymeren (zoals collageen, agarose, fibrine, alginaat en hyaluronzuur), evenals synthetische polymeren (zoals polyethyleenglycol, polyvinylalcohol en polyglycolzuur), zijn getest 7,9,10,11,12,13. Van de mechanische eigenschappen van een biomatrix is aangetoond dat ze van invloed zijn op de verspreiding van voedingsstoffen, de differentiatie van thecale cellen, de vorming van antrum en de hormonale secretie14. Collageen, als onderdeel van de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) van de cel, is een van de vroegste geteste matrices en was aanvankelijk veelbelovend 15,16,17. De logistiek van het standaardiseren van preparaten van collageen, slechte mechanische eigenschappen en stabiliteit hebben het gebruik ervan echter beperkt18. Agarose is getest op cumulus-eicelcomplexen (COC's) die vrijkomen uit antrale follikels en primordiale follikels19,20. Meer recentelijk is een geprinte 3D-agaroseschimmel veelbelovend gebleken voor steigervrije follikelcultuur21. Inkapseling van calciumalginaat, voor het eerst gerapporteerd in 2003, is tot op heden het meest bestudeerde systeem voor IVC22. Het is getest op muizen, runderen, apen en menselijke follikels 23,24,25,26,27. Met calciumalginaat worden follikels afzonderlijk in microdruppels van het polymeer geladen en blootgesteld aan calciumchloride om een gelkraal te genereren. Extractie van follikels uit de kraal vereist behandeling met een chelaatvormer. Deze matrix heeft echter enkele nadelen. Alginaat is een polysacharide geïsoleerd uit algen en hoewel het ondersteuning biedt, maakt het geen deel uit van de natuurlijke extracellulaire matrix van de follikel. Gegevens suggereren een hogere incidentie van spindeldefecten na IVC in alginaat28. Latere aanpassingen van het systeem door alginaat te combineren met fibrine of andere extracellulaire matrixcomponenten (ECM) hebben ertoe bijgedragen dat het calciumalginaatsysteem effectiever is geworden29,30.

Groeiend bewijs wijst erop dat de extracellulaire matrix een belangrijke modulator is bij celgroei 10,31,32 . Het biedt niet alleen ondersteuning, maar speelt ook een cruciale rol bij de aanhechting, functie, groei en communicatie van cellen. Een van de belangrijkste componenten van ECM is hyaluronzuur, een van nature voorkomend glycosaminoglycaan. In de ovariële follikel wordt hyaluronzuur geproduceerd door granulosacellen en draagt het bij aan de structurele integriteit en functie van de zich ontwikkelende follikel33,34. Integratie van hyaluronzuur in een follikelkweekmodel kan daarom helpen bij het creëren van een meer fysiologische omgeving en het verbeteren van de productie van functioneel competente eicellen.

Dit werk beschrijft de nieuwe toepassing van een tyramine-gekoppeld hyaluronzuur als biomatrix voor verse en diepgevroren ovariële follikelkweek en in vitro rijping van eicellen (IVM). We beschrijven ook technieken voor cryopreservatie van follikels door vitrificatie op twee soorten apparaten. De ene methode omvat directe onderdompeling in vloeibare stikstof, terwijl bij de tweede methode de follikels vóór onderdompeling in een rietje worden ingesloten. Het primaire doel is om aan te tonen dat, ondanks verschillen, zowel methodologieën als apparaten betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor cryopreservatie van de follikels.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de institutionele protocollen voor gebruik en verzorging van dieren van de Cleveland Clinic en volgens de richtlijnen en voorschriften van de National Institutes of Health for Care and Use of Laboratory Animals.

1. Medium bereiding

OPMERKING: De hieronder beschreven media worden gebruikt voor de verschillende stappen van deze procedure: behandeling van eierstokweefsel (OT), OT-collagenasedigestie, follikelcultuur (FCM) en vitrificatie. Bereid al het medium in een weefselkweekkap met behulp van een steriele techniek.

  1. Medium voor het hanteren van eierstokweefsel
    1. Vul 20 ml Leibovitz's medium (L-15) aan met 0,1% foetaal runderserum (FBS) in een weefselkweekkolf van 50 ml (T-50).
    2. Sluit de dop goed af en plaats de kolf een nacht in de broedmachine om op te warmen tot 37 °C voor gebruik. Dit medium wordt gebruikt voor het hanteren van eierstokweefsel en follikels buiten de incubator en heeft geen CO2 nodig om de pH van 7,2 tot 7,4 te behouden
      LET OP: Stel de vaat niet bloot aan CO2 -gas, anders wordt het medium zuur.
  2. Collagenase spijsverteringsmedium
    1. Voeg op de ochtend van de follikeloogst 1 mg Type I collagenase (295 E/mg) toe aan een reageerbuis met 2,2 ml voorverwarmd OT-medium. De uiteindelijke gewenste concentratie van collagenase is 134 E/ml Filter steriliseren met behulp van een spuitfilter van 0,22 μm. Sluit de dop goed af en plaats deze in een warmhoudblok.
  3. Follikelkweekmedium en olie
    1. Bereid 30 ml Minimum Essential Medium alpha aangevuld met 5% foetaal runderserum in een T-50 kolf. Aanvullen met 100 mIU/ml FSH, 10 mIU/ml LH, 10 μg/ml insuline, 5 μg/ml transferrine en 5 ng/ml selenium.
    2. Breng de FCM voor bij 37 °C met 6% CO2 en lucht een nacht in de broedmachine voor gebruik.
    3. Doe 50 ml minerale olie in de kolf, dop losjes af en zet een nacht in de broedmachine.
  4. Verglazingsmedia voor FL en FL-clusters
    1. Het basale medium voor alle oplossingen is Global-Hepes aangevuld met 20% synthetische eiwitvervanger. Bereid 20 ml VS1-oplossing met 7,5% ethyleenglycol (EG) en 7,5% dimethylsulfoxide (DMSO) in basaal medium.
    2. Bereid 20 ml VS2 met 15% EG, 15% DMSO en 0,5 M sucrose in basaal medium. Steriliseer alle oplossingen met een spuitfilter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C tot gebruik. Oplossingen kunnen tot 4 weken worden gebruikt.
  5. Verwarmende media voor verglaasde follikels en FL-clusters
    1. Het basale medium voor alle oplossingen is Global-Hepes aangevuld met 20% synthetische eiwitvervanger. Bereid 20 ml basaal medium voor met 0,25 M sucrose. Label als WS1.
    2. Bereid 20 ml basaal medium voor met 0,125 M sucrose en label als WS2. Filter steriliseer met 0,22 μm spuitfilter. Bewaar oplossingen maximaal 4 weken bij 4 °C.

2. Eierstok oogst

  1. Euthanaseer 10-14 dagen oude B6D2F1-pups door cervicale dislocatie (geen anesthesie). Gebruik 3-4 pups om 250-300 intacte preantrale follikels te verkrijgen om mee te experimenteren.
  2. Leg het dier op zijn rug en veeg de buik af met 70% isopropylalcohol. Maak een kleine horizontale snede in de middellijn met een schone schaar. Pak de huid boven en onder de snede vast met een fijne tang en trek in beide richtingen (naar hoofd en voeten) om de buik bloot te leggen.
  3. Knip met een tweede set schone scharen en een fijne tang de buikwand door. Til de darmspiralen op. Zoek de baarmoederhoorns, eileiders en eierstokken. Snijd de eierstokken weg en plaats ze in een gerecht met 1 ml OT en behandel ze medium verwarmd tot 37 °C.
  4. Snijd met een ontleedmicroscoop al het vet en het eiervlies weg. Snijd de eierstokken door.

3. Isolatie van follikel en FL-cluster (FL-C)

  1. Gebruik een laminaire stromingskap met een verwarmd oppervlak van 37 °C voor isolatie en behandeling van de follikels. Werk aseptisch in de kap. Wees voorzichtig met de FCM-schaal. Gebruik de bubbler om de schotel te vergassen met 5% CO2 wanneer u in de laminaire stromingskap werkt.
    OPMERKING: Alle oplossingen moeten worden voorverwarmd tot 37 °C. FCM-medium, evenals minerale olie, moeten vóór gebruik een nacht in een broedmachine bij 37 °C met 6% CO2 worden voorgeëquilibreerd. De gemiddelde pH zal verschuiven wanneer deze langer dan 10 minuten buiten de broedmachine is.
  2. Piquet 6 ml voorgebalanceerde FCM in twee schaaltjes van 60 mm en bedek deze met minerale olie. Plaats terug in de couveuse.
  3. Piket 1 ml collagenase in een schotel met middenput en 3 ml OT-medium in de buitenwand. Verplaats de eierstokken naar collagenaseoplossing met behulp van een glazen micropipet (1000 μm). Incubeer de schaal gedurende 30-40 minuten op het verwarmde oppervlak van de laminaire stromingskap.
  4. Aan het einde van de collagenase-incubatie pipetteer u 6 ml OT-medium in twee weefselkweekschaaltjes van 60 mm met het label 1 en 2. Plaats op het warme oppervlak van de kap.
  5. Verplaats met een micropipet de met collagenase behandelde eierstokken naar de buitenste put om vrij te spoelen van collagenase. Vervang de micropipetten en verplaats de eierstokken naar OT-schaal 1.
  6. Oogst follikels van elke eierstok met behulp van een P200-pipettor. Maak de follikels vrij door herhaalde aspiratie en uitdrijving van de met enzym behandelde eierstok door de pipetpunt die in verschillende maten is gesneden. Het mechanisch uiteenzetten van weefsel in fragmenten met twee naalden van 27 G vóór het pipetteren is ook nuttig bij het vrijmaken van individuele follikels. Elke muispup moet 60-75 intacte follikels van de gewenste grootte opleveren.
  7. Breng indien nodig niet-gedissocieerde stukjes eierstok terug in collagenase gedurende nog eens 5-10 minuten, spoel af en herhaal het pipetteren om meer follikels vrij te maken.
    OPMERKING: Overmatige blootstelling aan collagenase zal resulteren in verstoring van de granulosacellagen rond de eicel. Probeer niet de hele eierstok te breken. Stop zodra 250-300 follikels zijn verzameld.
  8. Onderzoek vrijgekomen follikels met behulp van een ontleedmicroscoop met een vergroting van 40x. Identificeer secundaire pre-antrale follikels (~120 -140 μm diameter) met een centraal gelegen eicel ingesloten in een intact basaalmembraan (basale lamina). De follikel van deze grootte heeft doorgaans 2-4 lagen granulosacellen die het ei omringen (zie figuur 1).
    OPMERKING: Vergelijk de follikels met het openen van een micropipetpunt van 175 μm om de follikelgrootte bij benadering te bepalen. De follikel moet ongeveer 3/4 van de pipetdiameter hebben. Dit is de snelste methode om follikels van de gewenste grootte te selecteren.
  9. Verplaats met behulp van een micropipet van 175 μm de geselecteerde follikels naar de OT2-schaal. Spoel na voltooiing van de verzameling alle follikels in de FCM1-schaal om eventuele sporen van het OT-medium te verwijderen. Breng vervolgens over naar de FCM2-schaal.
  10. Plaats de schaal 60 minuten in een broedmachine voordat u met het inbedden begint.
  11. Voer voor isolatie van de follikelcluster de stappen 3.1 tot en met 3.5 uit. Gebruik twee tuberculinespuiten (27 G) om de eierstok in fragmenten uit elkaar te halen en vervolgens in kleine clusters van 6-10 follikels.
    OPMERKING: Cultuur van follikelclusters (FL-C) is een alternatief voor het kweken van individuele follikels. Deze methode behoudt de inheemse folliculaire architectuur samen met stromale componenten. De follikelgrootte in FL-C is niet uniform. Follikels behouden hun in vivo configuratie met primordiale, primaire en secundaire follikels.
  12. Verzamel deze follikelclusters (FL-C) met een micropipet van 200 μm in het OT2-schaaltje. Spoel na voltooiing van de verzameling alle FL-C af en breng deze over naar FCM2 om te wachten op inbedding.

4. Inbedding van follikels en follikelclusters

  1. Bereid een 10 mg/ml stockoplossing van geactiveerde tyramine-gekoppelde hyaluronhydrogel (HA). Rehydrateer 250 mg tyramine gesubstitueerd natriumhyaluronaatpoeder met 25 ml mierikswortelperoxidase-enzym (HRP; 10 IE/ml) in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Eenmaal opgelost, bewaart u 500 μL aliquots van deze geactiveerde HA-voorraad bij -4 °C voor toekomstige experimenten.
  2. Voor follikelexperimenten ontdooit u de HA-stockoplossing en verdunt u deze tot een concentratie van 3 mg/ml in een globaal medium dat is opgewarmd tot 37 °C. Voer alle inbeddingsstappen uit in een laminaire stromingskap met een bankoppervlak dat is verwarmd tot 37 °C. Gebruik een schaaltje van 60 mm met acht putjes van 100 μL voor het inbedden en de daaropvolgende follikelkweek.
  3. Verplaats de ingebedde follikels of FL-clusters van de FCM-schaal naar een druppel HA-gel om vrij te spoelen van het kweekmedium. Het trackingmedium zal de gelvorming verstoren. Plaats de FCM-schaal terug onder de bubbler om te gassen.
    OPMERKING: Geïsoleerde follikels kunnen worden ingebed, afzonderlijk of in groepen, afhankelijk van het experiment. Over het algemeen geven we de voorkeur aan het zaaien van 2-4 follikels per kraal.
  4. Doe 1 μL 0,03% waterstofperoxide (H2O2) op een petrischaaltje. Voeg 25 μl 3 mg/ml HA-gel toe aan de druppel waterstofperoxide en meng door te pipetteren om de verknoping te starten (zie figuur 2).
  5. Zuig met behulp van een P20-pipettor het HA-H2O2-mengsel op en pipetteer een druppel (~8-10 μL) in twee afzonderlijke putjes van de 8-putjes cultuurschaal. Vermijd het maken van bubbels.
  6. Breng met behulp van een micropipet van 200 μm snel de follikels of een FL-C over in het midden van elke druppel (Figuur 3). Snelheid is belangrijk, want zodra de HA wordt blootgesteld aan de katalysator (peroxide), begint deze binnen 1-2 minuten te geleren. Pas op dat er geen luchtbellen ontstaan tijdens het zaaien.
    OPMERKING: Om de groei van individuele follikels te volgen, plaatst u de follikels op een afstand van elkaar. Plaats de follikels niet te dicht bij de gelbodem, anders kunnen ze tijdens IVC voldoende naar beneden zakken om zich te hechten.
  7. Wacht ~ 3 minuten om het geleerproces te voltooien en voeg vervolgens 100 μL voorgebalanceerde FCM toe aan elk putje. Herhaal dit proces en laad de follikels in alle acht putjes. Bedek met warme, voorgebalanceerde minerale olie en plaats de schaal in een incubator.

5. Verglazing van follikels en FL-clusters

OPMERKING: Verglazing kan worden gedaan met behulp van een open drager (Cryoloop; CL), waardoor direct contact met vloeibare stikstof mogelijk is, of anders een gesloten drager (Rapid I; RI), waarbij het monster is verzegeld in een rietje aan de buitenkant en dus nooit in contact komt met vloeibare stikstof. Figuur 4 toont de apparaten en contrasten van de twee vitrificatiesystemen. Het is aangetoond dat verglazing op beide apparaten effectief is voor cryopreservatie van embryo's35.

  1. Gesloten drager RI-vitrificatie
    1. Verwarm 2 ml aliquots VS-oplossingen voor tot 37 °C in een verwarmd blok. Voer alle vitrificatiestappen uit op het verwarmde oppervlak van de laminaire stromingskap met behulp van een ontleedmicroscoop om de follikel en drager zichtbaar te maken.
    2. Vul de geïsoleerde cryobox met vloeibare stikstof (LN2). Plaats het buitenste rietje van het apparaat in een houder in de doos, zodat het gedeeltelijk wordt ondergedompeld in vloeibare stikstof. Leg de binnenste plastic stok met een klein gaatje over het deksel van een petrischaal ter voorbereiding op het laden.
    3. Doe twee druppels VS1 naast elkaar op een petrischaaltje aan de bovenkant. Gebruik een micropipet van 200 μm om twee follikels in de eerste druppel te plaatsen. Spoel af en ga snel over op de tweede druppel VS1. Incubeer gedurende 5 minuten. Als FL-clusters worden gevitrificeerd, verwerk dan één cluster tegelijk.
    4. Doe drie druppels VS2 naast elkaar op dezelfde schaal wanneer de eerste incubatie bijna voltooid is. Beweeg vervolgens snel de follikels achtereenvolgens door de drie VS2-druppels binnen 60 s en laad op de drager. Zorg ervoor dat u een minimale hoeveelheid vloeistof met de follikels opzuigt om te voorkomen dat u het medium van de ene druppel naar de andere volgt.
    5. Om de drager te laden, pakt u twee follikels op en deponeert u met minimale vloeistof in het kleine gaatje in de plastic stok. Het uiteindelijke vloeistofvolume in het gat is minuscuul < 0,5 μL. Vermijd overvulling, waardoor vloeistof uit het gat en op de plastic stok terechtkomt.
    6. Laat de stok in het voorgekoelde buitenste rietje vallen. Gebruik de ultrasone sealer om het rietje te sluiten en af te sluiten. Plaats het rietje in een beker die aan de cryostok is bevestigd. Er kunnen maximaal 4 rietjes in dezelfde beker worden geplaatst.
    7. Dek de stok af met een plastic beschermhoes. Dompel het riet onder in een opslagtank voor vloeibare stikstof (LN2).
  2. Open drager CL vitrificatie
    1. Verwarm VS-oplossingen voor op 37 °C. Voer alle vitrificatiestappen uit op het verwarmde oppervlak van de laminaire stromingskap. Bereid van tevoren het aantal benodigde CL open carriers voor. Steek de metalen CL-steel in de gemagnetiseerde dop van de injectieflacon en zorg ervoor dat deze stevig vastzit (gebruik indien nodig een klein beetje lijm).
    2. Vul de geïsoleerde cryobox met vloeibare stikstof (LN2). Plaats een rek in de cryobox om de cryovials zo vast te houden dat LN2 zich onder de bovenkant van de injectieflacon bevindt.
    3. Vul de speciale gemagnetiseerde en geventileerde injectieflacon met LN2. Plaats het op het rek. Voer de vitrificatiestappen uit zoals beschreven in de stappen 6.1.3 tot en met 6.1.5. Het enige verschil is dat we doorgaans vijf follikels tegelijk verwerken. Nogmaals, zorg ervoor dat u de vloeistof van druppel tot druppel zo min mogelijk volgt.
    4. Om follikels te laden, pakt u de CL open drager vast aan de bevestigde magnetische dop met behulp van de metalen staaf. Dompel de CL open drager in een aparte druppel VS2 om een film van cryoprotectant te maken.
    5. Pak met een micropipet alle follikels of het FL-cluster op en plaats ze met zo min mogelijk vloeistof op de film. Werk snel, want de follikels moeten worden geladen voordat de film begint te drogen.
    6. Dompel de CL onmiddellijk onder in de cryovial gevuld met LN2 om het monster te verglaasen. Sluit de dop af en plaats de injectieflacon op de cryocan. Dek af met een plastic hoes. Dompel de stok onder in een opslagtank voor vloeibare stikstof.

6. Opwarming van verglaasde follikels en FL-clusters

  1. RI gesloten drager opwarming
    1. Bereid een gerecht met een goed gerecht in het midden met 3 ml voorgebalanceerde FCM in het buitenste putje en 1 ml in het middelste putje. Bedek met olie en plaats in de broedmachine.
    2. Doe 0.5 ml voorverwarmde WS1 en WS2 in twee gelabelde gerechten met een goede middenverpakking. Verplaats stokken met monsters uit de opslagtank in een cryobox gevuld met LN2.
    3. Verwijder de plastic stokafdekking. Haal het rietje uit de beker, houd het ondergedompeld en schuif het in de houdergleuf in de cryobox.
    4. Knip met een fijne schaar het buitenste rietje af net boven de zwarte stip die de bovenkant van de binnenste RI-drager met follikels aangeeft.
    5. Til met een fijne tang de binnenste plastic stok iets uit het buitenste rietje. Pak het apparaat vast en dompel de stick snel onder in WS1, waarbij u voorzichtig ronddraait om de follikels te ontladen. Snelheid is cruciaal. Follikels moeten binnen 10 s in WS1 worden gelost.
    6. Gebruik een ontleedmicroscoop om de follikels zichtbaar te maken en ervoor te zorgen dat ze allemaal uit de drager zijn gelost. Gebruik na 2 minuten in WS1 een micropipet om alle follikels (of FL-Cluster) naar WS2 te verplaatsen, waarbij u ervoor zorgt dat u het medium niet volgt.
    7. Spoel na 3 minuten de follikels in de buitenste put van de FCM-schaal af en ga dan goed naar het midden. Plaats terug in de broedmachine gedurende 1-2 uur voordat u het inbedt.
  2. CL Open drager opwarming
    1. Bereid FCM- en WS-gerechten zoals hierboven beschreven. Verplaats het riet met follikels van een opslagtank naar een cryodoos gevuld met LN2. Verwijder de plastic stokhoes.
    2. Gebruik de magnetische staaf om de cryoviale dop op te tillen totdat de metalen steel van de CL zichtbaar is.
    3. Pak met een tang de metalen steel vast. Verwijder de CL uit de injectieflacon en dompel deze zeer snel onder in WS 1, waarbij u voorzichtig ronddraait om de follikels te ontladen. Laad binnen 10 s uit in WS1. Controleer met behulp van een ontleedbereik of alle follikels zijn ontladen
    4. Alle resterende stappen voor het opwarmen zijn hetzelfde als bij RI gesloten draaggolfstappen vanaf stap 7.1.6.

7. Follikel en FL-cluster beeldvorming en mediaverandering

  1. Bewaak follikels en FL-clusters in putten tijdens het kweekinterval van 10-12 dagen met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop met Hoffman-contrastmodulatie-optica en uitgerust met een high-definition camera. Gebruik beeldvormingssoftware om beelden vast te leggen met een totale vergroting van 40x en 100x of 200x, afhankelijk van de grootte.
  2. Beeldvorming en beoordeling van follikels
    1. Op cultuurdag 1, na inbedding, worden alle kweekputten in beeld gebracht met een vergroting van 40x en 200x met behulp van een omgekeerde microscoop om de basismorfologie en grootte vast te stellen. Zet de schaal terug in de broedmachine.
    2. Bekijk afbeeldingen en noteer het aantal volledig ingebedde follikels in elke gelparel. Maak voor FL-C een schatting van het aantal follikels aan het begin van de kweek.
    3. Meet met behulp van beeldvormingssoftware de follikeldiameter langs verticale en horizontale vlakken vanaf de rand van het basaalmembraan. Meet de eicelgrootte op dezelfde manier vanaf de buitenrand van de zona. Noteer gemiddelde waarden. Meet de diameter van de cluster verticaal en horizontaal.
    4. Ga door met het afbeelden van culturen om de 2-3 dagen. Meet de diameters van de follikels die niet met elkaar in contact komen. Bij FL-C worden de clusters tijdens IVC opgerold, zodat het hele cluster in het verticale en horizontale vlak kan worden gemeten.
      OPMERKING: Voor follikels die dicht bij elkaar zijn gegroepeerd, zijn individuele follikelgrenzen mogelijk niet waarneembaar na dag 4 van de kweek, dus er worden geen metingen gedaan.
    5. Classificeer follikels die donker of apoptotisch worden, evenals follikels waarin de eicel niet langer is omgeven door granulosacellen of is geëxtrudeerd als niet-levensvatbaar. Houd alle follikels of FL-C in de gaten die zich aan het oppervlak van de schotel hebben gehecht (zie afbeelding 5).
    6. Observeer de follikels zorgvuldig op antrumvorming vanaf dag 8. Follikels met antrums zien eruit alsof ze een open plek of lichtere ruimte in zich hebben (Figuur 6).
    7. Voer elke 2 dagen een halve verandering van het kweekmedium uit. Gebruik een P200 pipettor, ingesteld op 50 μL. Steek de punt in de put onder de olielaag en weg van de gelparel. Zuig langzaam 50 μL van het kweekmedium op. Vervang het medium door langzaam 50 μl verse FCM onder de olielaag te pipetteren. Vermijd het maken van bubbels.

8. Rijping van eicellen in ingekapselde follikels

OPMERKING: De laatste rijpingsstap wordt meestal gestart wanneer de vorming van antrum onder het totale aantal gezaaide (en levensvatbare) follikels meer dan 40% bereikt. In het geval dat de antrumvorming echter laag of niet zichtbaar is, raden we aan om te triggeren op dag 12 van de cultuur. We hebben geen voordeel gezien van langer wachten. Voor FL-C-culturen wordt rijping meestal geactiveerd wanneer antrums worden waargenomen in 40% van de putten of uiterlijk op dag 12.

  1. Bereid in vitro rijpingsmedium (IVM) voor door FCM aan te vullen met 1,5 IE/ml humaan choriongonadotrofine (hCG) en 5 ng/ml epidermale groeifactor (EGF).
  2. Activeer de rijping door FCM in elk putje rond 5 uur te vervangen door 100 μL IVM-medium. Gebruik na een nacht rijping (16-18 uur na trigger) een dissectiemicroscoop met een vergroting van 40x om elke cultuur goed te onderzoeken op cumulus-eicelcomplexen (COC's) die hebben geovuleerd uit de HA-gelkraal. De COC's bevinden zich meestal net boven de gelparel of anders in de buurt.
  3. Verzamel de ovuleerde COC's in een schaal met een middenputje met 1 ml voorgebalanceerde FCM bedekt met olie en plaats de schaal terug in de broedmachine.
  4. Verzamel eicellen uit follikels die nog ingebed zijn door de HA-kraal voorzichtig te pipetteren met een P200-pipettor om niet-ovulaire COC's vrij te maken. Vang deze op in een apart schaaltje met FCM.
  5. Bereid een gerecht met een goed middenstuk voor met 1 ml hyaluronidase (10 IE/ml) en 3 ml FCM-medium in de buitenwand.
  6. Breng de geovuleerde COC's over in een hyaluronidase-oplossing en stel deze kort bloot aan het enzym (30-45 s) om de eicel van granulosacellen te ontbloten om de nucleaire status van de eicel te visualiseren. Spoel de eicellen af om het enzym te verwijderen voordat u ze in druppels van 5 μl vers medium onder olie plaatst voor een gedetailleerde beoordeling. Plaats de schaal in de broedmachine. Herhaal dit proces voor de niet-ovuleerde COC's.
  7. Noteer het totale aantal ovulaire en niet-ovulaire eieren dat is teruggevonden. Foto's en beoordeel de nucleaire status (GV, metafase I of metafase II) van elke teruggevonden eicel. Meet en registreer de diameter.
  8. Bereken het IVC-overlevingspercentage op basis van het totale aantal levensvatbare follikels (die de dag van hCG-trigger halen) en het totale aantal teruggevonden eieren. Bereken het percentage metafase II eicellen van de ovulaire COC's. Herhaal dit voor alle eicellen die zijn teruggewonnen uit de niet-ovuleerde COC's.
  9. Bepaal de rijpingssnelheid naar metafase II op dezelfde manier voor FL-C.

Resultaten

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het gebruik van een nieuwe tyramine-gekoppelde hyalurongel voor in vitro cultuur van preantrale follikels van muizen36,37. Figuur 6 illustreert de verschillen tussen preantrale follikelgroei wanneer geplaatst in een conventioneel 2D-kweeksysteem versus een enkele follikel ingekapseld in HA-gel voor 3D-cultuur. De inheemse follikelarchitectuur wordt gehandhaafd tijdens de 12 dagen van de cultuur met een antrum dat duidelijk zichtbaar is op de laatste dag van de groei.

De HA-gel is zeer veelzijdig en maakt de groei van geïsoleerde follikels afzonderlijk of in groepen mogelijk en ook eierstokweefsel wordt mechanisch opgesplitst in kleine clusters van follikels. De gel is transparant, waardoor het mogelijk is om follikels te visualiseren, zelfs op verschillende diepten. Ingekapselde follikels en FL-C vertonen radiale expansie door voortdurende proliferatie van granulosacellen (Figuur 7). De initiële follikeldiameters zijn gemiddeld 139,8 ± 28 μm en de GV-eiceldiameter meet 63,5 ± 4,6 μm. In afzonderlijk gekweekte follikels meten de uiteindelijke diameters ongeveer 385,6 ± 36,7 μm, een ongeveer 3-voudige toename in grootte. Ovulated metafase II eicellen meten ongeveer 84,8 ± 3,8 μm. Binnen gekweekte FL-clusters is de follikelgrootte vrij divers (Figuur 5, Figuur 7). Ovulatie eicellen na hCG-trigger worden gevonden in de buurt van de follikel (Figuur 8). Het merendeel van de metafase II eicellen zal worden opgehaald uit de ovulaire COC's. Follikels die nog steeds ingebed zijn na de trigger bevatten meestal GV en metafase I eicellen.

Tabel 1 vergelijkt de rijpingssnelheden tussen geïsoleerde follikels en FL-clusters van verse of bevroren eierstokken. FL-C uit gecryopreserveerde eierstokken had significant lagere rijpingssnelheden. Microscopische waarnemingen toonden aan dat ze vaak gebroken basale lamina hadden, waardoor ze behoorlijk vatbaar waren voor voortijdige eicelextrusie. De fragiele aard van follikelclusters werd enigszins tegengegaan door inkapseling. Collagenasebehandeling van gecryopreserveerde eierstokken werd vermeden omdat het vooral schadelijk was bij een lage overleving en een lage opbrengst van intacte follikels.

Cryopreservatie van geïsoleerde follikels is veel effectiever dan het behoud van de hele eierstok. Hoge rijpingssnelheden kunnen worden bereikt met beide onderzochte vitrificatiemethoden (tabel 2). Ondanks grote verschillen in afkoelsnelheid, verschilde de rijping van de eicellen na IVC niet. De CL open drager zorgt voor meer efficiëntie, aangezien er tot tien follikels op een enkele CL open drager kunnen worden geladen. Dit verkort ook de totale tijd voor het herstellen van meerdere gecryopreserveerde follikels. Voor elke eventuele klinische toepassing van vitrificatie voor menselijke follikels kan echter de voorkeur worden gegeven aan een gesloten verzegeld systeem.

Chromatinerangschikking rond de nucleolus van de GV-eicel kan worden gebruikt om eicellen te identificeren die het meest waarschijnlijk zullen bevruchten na de eisprong en zich ontwikkelen tot blastocysten38. Figuur 9 illustreert live kleuring van eicellen om het chromatinedistributiepatroon te visualiseren.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de follikelgroei. Dit diagram illustreert de verschillende stadia van de ontwikkeling van de follikels, van een primaire follikel tot het secundaire preantrale stadium en uiteindelijk tot een volledig rijpe tertiaire follikel die klaar is voor de eisprong. Een microscopisch beeld van een typische preantrale follikel wordt ook getoond met zijn verschillende morfologische kenmerken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema van de HA-inkapselingsmethode. De structuur van de hyaluron-gel en de verschillende stappen voor follikelinbedding worden in dit diagram geïllustreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Isolatie en inkapseling van de follikel. (A, B) Preantrale follikel geselecteerd voor inbedding bij vergroting 40x en 200x. (C) Apoptotische follikel wordt getoond met gezonde preantrale follikel met eicel niet helemaal centraal. (D) Afbeelding van HA-gelkraal gezaaid met follikels en (E) met twee FL-C. Afbeeldingen gemaakt met een stereomicroscoop om de hele gelkraal te laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vitrificatieapparaten voor cryopreservatie van geïsoleerde follikels. Met het CL open draagapparaat wordt de vitrificatiestap uitgevoerd door directe onderdompeling van de follikels in vloeibare stikstof. De afkoelsnelheid is dan ook extreem hoog, meer dan -20.000 °C/min. Bij de gesloten RI-drager daarentegen worden de follikels op de binnenste plastic stok geladen en in een buitenste rietje gedompeld in vloeibare stikstof. Deze gesloten vitrificatiemethode vermijdt direct contact met vloeibare stikstof. De koelsnelheid is echter aanzienlijk lager bij -1220 °C/min. Het laden en herstellen van follikels van beide dragers is eenvoudig. De CL open drager was geschikt voor het laden van maximaal tien follikels per apparaat, vergeleken met slechts twee met de RI gesloten drager. Dit cijfer is gewijzigd van35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve beelden van ondervonden problemen. (A) Follikelcluster met eicel die wordt geëxtrudeerd. (B) Geïsoleerde follikels met gebroken basale laminamembraan en één met een geëxtrudeerde eicel. (C) Ingebedde follikel onder een luchtbel in de gel. (D) Follikelcluster die in gel bleef (links) in vergelijking met cluster die te diep was ingebed en uiteindelijk aan de schaal vastzat. Het brede scala aan follikelgroottes in FL-C is duidelijk zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Vergelijking van follikelgroei in conventies 2-D versus 3-D cultuur in HA. Bij 2D-groei werd op dag 4 een afvlakking van de follikel en aanhechting van granulosacellen aan de weefselkweekschaal waargenomen, waardoor de eicel kwetsbaar werd voor granulosacelmigratie, verstoring van gap junctions en voortijdige eicelextrusie. De HA-ingekapselde follikel bleef gedurende het hele kweekinterval los. Granulosa-celexpansie vond plaats in alle richtingen, omhulde de eicel en behield de 3D-architectuur. Dit cijfer is gewijzigd van36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Representatieve beelden van follikels ingekapseld in tyramine-gekoppelde hyaluron-gel. (A) Preantrale follikel verzameld na collagenasevertering van verse eierstok op dag 1. (B) Geldruppel gezaaid met vier preantrale follikels afgebeeld op dag 1 en (C) Dag 4 van de kweek (D) Follikelcluster van verse eierstok op dag 2 (E) op dag 6 en (F) op dag 9 van de teelt. (G) Follikelcluster mechanisch ontleed uit de verglaasde hele eierstok getoond op dag 2 en (H) op dag 6 van de kweek. (I) Follikel met antrumvorming is duidelijk zichtbaar op dag 9 van de cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Oeicelovulatie. (A, B) Ovuleerd cumulus-eicelcomplex (COC) getoond naast HA-gel kraal. (C) Eicellen werden in beeld gebracht na enzymatische behandeling van COC's met hyaluronidase om omliggende cumuluscellen te verwijderen. Talrijke metafase II eicellen. (D) Metafase II eicel met prominent poollichaam. Vergroting 400x. (E) Live beeldvorming van metafase II eicel met behulp van gepolariseerd licht en een beeldvormingssysteem om meiotische spoel te visualiseren en de organisatie te beoordelen, gedaan zoals beschreven in37. Vergroting 400x. Normale dubbelbrekende spindel zichtbaar. (F) Metafase II eicel gefixeerd en gekleurd met anti-alfa/bèta-tubuline en propidiumjodide om de meiotische spoelorganisatie te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Reorganisatie van chromatine in GV-eicellen. Chromatinerangschikking in GV-eicellen na antrumvorming werd onderzocht door kleuring van DNA met Hoechst 33342 (50 ng/ml). Representatieve follikels werden geoogst uit HA-parels door voorzichtig te pipetteren. Granulosacellen werden verwijderd met behulp van hyaluronidase. GV-eicellen werden vervolgens gedurende 15 minuten gekleurd (zie protocol van Monti et al.38). De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 40x. (A) GV-eicel getoond op dag 1 bij de start van de kweek met het niet-omgeven chromatine (NSN) kleuringspatroon. (B) GV-eicel uit groeiende follikel met antrum weergegeven op de dag van hCG-trigger. Chromatine condenseerde en vormde een perinucleaire ring rond de nucleolus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ParameterVerse eierstokBevroren eierstok
FL-geïsoleerdFL-ClusterFL-Cluster
Follikels waargenomen tijdens IVC13015469
Ovulatie na HCG (%)71%66%93%
(92/130)(101/154)(64/69)
GVBD (%)30%28%52%
(28/92)(28/101)(33/64)
MII eicelvorming (%)59%55%*34%
(54//92)(56/101)(22/64)

Tabel 1: Resultaten met HA-ingebedde follikels van verse en gevitrificeerde eierstokken. Follikels en FL-C uit verse eierstokken werden in vitro gerijpt na inkapseling in HA-gel. HA-gel werd ook getest op follikels van eierstokken die waren gevitrificeerd met behulp van een EG/DMSO-protocol39. Bij verse eierstokken werden zowel individuele follikels (FL) als follikelclusters (FL-C) verzameld na collagenasevertering. Voor vitrified eierstokken was blootstelling aan collagenase in feite schadelijk voor de follikels. De beste aanpak met gecryopreserveerde eierstokken was om FL-clusters te isoleren in plaats van individuele follikels en om alleen mechanische dissectie met naalden te gebruiken. De tabel vergelijkt de resultaten tussen HA-kralen gezaaid met follikels in groepen van 4-6 versus kralen met een enkele FL-C die 6-10 follikels bevat. *De rijpingssnelheid met FL-C uit gecryopreserveerde eierstokken was significant lager (p = 0,008; Chi-kwadraatanalyse om te testen op significantie).

VervoerderRICL
(Gesloten)(Openen)
Overleving (%)100% (24/24)100% (41/41)
Antrumvorming* (%)25.0% (6/24)75.6% (31/41)*
Ovulatiepercentage (%)66.7% (16/24)87.8% (36/41)
Rijpingspercentage (% MII's)81.3% (13/16)69.4% (25/36)

Tabel 2: Resultaten na cryopreservatie van geïsoleerde follikels op twee verschillende vitrificatieapparaten. Hoge rijpingssnelheden werden bereikt met zowel het open CL-apparaat als de gesloten RI-drager, met zijn lagere koelsnelheid. Antrumvorming was de enige uitkomstmaat waarvan werd vastgesteld dat deze significant was, maar geen invloed had op de totale rijpingssnelheid (p < 0,05; Chi-kwadraatanalyse om te testen op significantie).

Discussie

De mogelijkheid om de mechanische eigenschappen en biologische afbreekbaarheid van de tyramine-gekoppelde HA-hydrogel te controleren, biedt veel voordelen voor weefselmanipulatietoepassingen. Ons laboratorium is de eerste die deze specifieke HA-gel voor de groei van de ovariële follikel toepast. Deze gepatenteerde tyramine-gesubstitueerde natriumhyaluronaatgel (TS-NAHY) is een nieuw hydrogelsysteem op basis van hyaluronzuur dat is ontwikkeld in de Cleveland Clinic. Verknoping van de gel wordt aangedreven door blootstelling van de peroxidase in de geactiveerde gelmix aan een oxidatiemiddel. Dit kan zowel in vitro als in vivo. Gevormde TS-NAHY-hydrogels vertonen een breed spectrum aan eigenschappen, van zwakke gel, een pasta tot een fragiele vaste stof, afhankelijk van de concentratie gel40.

De teleurstellende vooruitgang met de ovariële follikelcultuur benadrukt de noodzaak om nieuwe kweekmodellen te ontwerpen. Het creëren van een kweeksysteem dat uitsluitend gebaseerd is op inheemse extracellulaire matrixcomponenten kan een voordeligere benadering zijn. Het beschreven HA-cultuurmodel is gemakkelijk te gebruiken op een fysiologische manier zonder dat er extra ECM-componenten nodig zijn. De gel is transparant, waardoor een gedetailleerde visualisatie van de follikels mogelijk is. De visco-elastische eigenschappen van de HA-gel vergemakkelijken de aanpassing van de stijfheid en de vormbaarheid. Deze eigenschap vergroot de veelzijdigheid van deze biomatrix. Stijfheid van een biomatrix kan van invloed zijn op de proliferatie van granulosacellen en de vorming van antrum 30,41,42. Van follikels die zijn afgeleid van kweekomgevingen die tolerant zijn voor antrumvorming is gemeld dat ze andere genexpressieprofielen hebben dan die in een niet-ondersteunend kweeksysteem43. De follikels van primaten lijken een stijvere matrix nodig te hebben44. Het afstemmen van de biomatrix op de behoeften van verschillende diersoorten, waaronder mensen, zal waarschijnlijk belangrijk zijn voor een succesvolle in-vitrorijping.

Voor de preantrale follikelgroei van muizen hebben we gelconcentraties getest variërend van 2-5 mg/ml36. De rijpingspercentages van eicellen varieerden van 44% tot 58%. Hogere concentraties van de HA-gel zorgden voor meer kneedbaarheid en behoud van een 3D-structuur, maar de uitzetting van de follikels werd beïnvloed. Lagere HA-concentraties zorgden voor meer radiale expansie van de follikel, maar verhoogden het risico dat de follikel spontaan werd geëxtrudeerd vóór het einde van IVC. De HA concentratie van 3-3,5 mg/ml werkte het beste voor preantrale follikels van muizen. Het klein houden van de geldruppel was essentieel voor het vormen van HA-gelkralen met voldoende diepte om de follikels tijdens IVC in een 3D-configuratie te houden. Grotere druppels werden afgeplat, wat resulteerde in de afdaling van de follikels door de gel en aanhechting aan het plaatoppervlak. Een beperking van het gebruik van dit biomateriaal voor inbedding is de extreem snelle geleertijd. Het maakt het moeilijk om meer dan twee HA-gelkralen tegelijk te zaaien. Het verhogen van de efficiëntie van het uitzaaien van follikels in de HA-gel is een gebied dat we proberen te verbeteren.

De kweek van follikelclusters in een 3D-omgeving met behulp van HA heeft een groot potentieel. De normale ovariële architectuur blijft behouden, met follikels van verschillende grootte die in contact komen met elkaar en het ondersteunende stroma. LH kan de groei van kleinere preantrale follikels in de FL-C helpen door veranderingen in de vroege differentiërende thecale cellen te induceren, dus werd het opgenomen in het FCM-medium45. Het voortzetten van de cultuur van FL-C in de afgelopen 12 dagen om te zien of een nieuwe groeigolf kan worden geïnitieerd in een van de kleinere follikels die nog steeds zijn ingebed na de hCG-trigger, moet verder worden bestudeerd. Verdere optimalisatie van het kweekmilieu kan een voorwaarde zijn voor de kweek van follikels van verschillende groottebereiken in een weefselfragment. Een voordeel van dit 3D HA-cultuurmodel met FL-C is dat het een nauwkeurige nabootsing van in vivo folliculaire rangschikking en interacties mogelijk maakt. Een ander belangrijk kenmerk is dat, in tegenstelling tot calciumalginaat en andere polymeersystemen, ovulatie en rijping kunnen worden geïnduceerd zonder de follikels fysiek uit het weefsel of de gelmatrix te verwijderen.

De tijd die nodig is voor in vitro follikelkweek en het verkrijgen van rijpe eicellen om in te vriezen is lang, vooral bij grote zoogdieren. Het vermogen om geoogste follikels of follikelclusters te cryopreserveren, biedt een manier om deze stap uit te stellen tot een later en mogelijk gunstiger tijdstip. Als een dergelijke technologie op een dag kan worden toegepast op menselijke follikels tijdens de eierstokoogst, kan dit nuttig zijn. Cryopreservatie van de hele eierstok voor behoud van de vruchtbaarheid is momenteel de enige optie voor patiënten. Maar of het daadwerkelijk de beste methode is, moet nog worden bepaald. In dit artikel presenteren we een vitrificatiemethodologie voor cryopreservatie van preantrale follikels die uitstekende overleving en rijpingspercentages na 3D-cultuur geeft.

Tot slot hebben we een nieuw 3D-cultuurmodel beschreven met behulp van hyaluronzuur, een onderdeel van native ECM. De HA-inkapselingstechniek maakt het mogelijk om trofische factoren in de nabijheid van de zich ontwikkelende follikels te behouden. De methodologie voor inkapseling in de biomatrix is eenvoudig en kan zowel geïsoleerde follikels als follikelclusters accommoderen. Dit laatste kan nieuwe onderzoekswegen openen en inzicht geven in de fundamentele biologie van folliculogenese en de regulatie ervan. Van eicellen uit met HA ingekapselde follikels is aangetoond dat ze functioneel competent zijn37. Deze eicellen kunnen worden bevrucht, in vitro blastocysten vormen en worden geïmplanteerd bij overdracht naar pseudo-zwangere muizen. Deze gegevens valideren het gebruik van tyramine-gekoppeld hyaluronzuur als biomatrix voor 3D-follikelcultuur en in vitro eicelrijping. Dit protocol kan mogelijk worden toegepast op ovariële follikelcultuur in andere diermodellen, waaronder mensen. Andere mogelijke toepassingen voor dit 3-D HA-gelsysteem kunnen embryoïde lichaams- en organoïdecultuur zijn.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten of openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

We willen het hele embryologieteam van Cleveland Clinic bedanken voor hun hulp, evenals de REI-afdeling en in het bijzonder Dr. Falcone voor ondersteuning. Dit project werd gefinancierd via een onderzoeksfonds van de Cleveland Clinic.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-alpha tubulin-FITC gelabeldSigma-AldrichF2168
Anti-beta tubulin-FITC gelabeldSigma-AldrichF2043
BZ-X700Keyence
Center well dishFisher Scientific08-772-12
Collageenase Type IWorthington Biochemical CorporationLS004196
Crycap vial-geventileerdHampton ResearchHR4-904
CryoloopHampton ResearchHR4-974
KristalkapHampton ResearchHR4-733
Kweekschaal 60mmFisher Scientific 08-772B
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Epidermale groeifactor (EGF)R &D Systems236-EG
Ethyleenglycol (EG)Sigma-Aldrich293237
Foetaal runderserum-hitte geïnactiveerdThermoFisher Scientific10082-147
Follikelstimulerend hormoon (FSH)Sigma-AldrichF4021
Global-Hepes  mediumCooperSurgicalLGGH-100
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Human choriongonadotrofine (hCG)Sigma-AldrichCG10
Humaan serumalbumineCooperSurgicalGHSA-125
HyaluronidaseCooperSurgicalART-4007-A
WaterstofperoxideCVS Pharmacy Inc.372441
Insuline-transferrine-selenium (ITS)ThermoFisher Scientific41400-045
Leibovitz medium (L-15)ThermoFisher Scientific11415-064
Luteïniserend hormoonSigma-AldrichL9773
Magnetische stokHampton ResearchHR4-729
Micropipetten (1000 µm)Minitube19025/0050
Micropipetten (175, 200, en 275µm)CooperSurgicalMXL3-175, MXL3-200, MXL3-275
Millex GV filter 0.22 µmMilliporeSLGU033RS
MineralolieCooperSurgicalLGOL-500
Minimum Essential Medium alpha (MEM)ThermoFisher Scientific32561-037
Oöcyten beeldvormingssysteem-SpindleviewHamilton Thorne
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)ThermoFisher Scientific10010-023
Propidium jodideSigma-AldrichP4170
Rapid iVitroLife14406
SmartBoxVitroLife14423
Synthetisch eiwitsubstituut (SPS)CooperSurgicalART-3011
Tyramine -gekoppeld Hyaluronan Biohydrogel Kit LifeCoreENG-00151
Ultrasone sealerVitroLife14415
Universele GPS kweekschaal 8x 100 µl putjesCooperSurgicalUGPS-010

Referenties

  1. Telfer, E. E., Andersen, C. Y. In vitro growth and maturation of primordial follicles and immature oocytes. Fertil Steril. 115 (5), 1116-1125 (2021).
  2. Telfer, E. E., McLaughlin, M. Natural history of the mammalian oocyte. Reprod Biomed Online. 15 (3), 288-295 (2007).
  3. Xiao, S., et al. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5, 17323(2015).
  4. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Dev Biol. 226 (2), 167-179 (2000).
  5. Diaz, F. J., Wigglesworth, K., Eppig, J. J. Oocytes are required for the preantral granulosa cell to cumulus cell transition in mice. Dev Biol. 305 (1), 300-311 (2007).
  6. Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biol Reprod. 73 (2), 351-357 (2005).
  7. Dadashzadeh, A., Moghassemi, S., Shavandi, A., Amorim, C. A. A review on biomaterials for ovarian tissue engineering. Acta Biomater. 135, 48-63 (2021).
  8. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variablesdagger. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  9. Belli, M., et al. Towards a 3D culture of mouse ovarian follicles. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 931-937 (2012).
  10. Berkholtz, C. B., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  11. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reprod Biol Endocrinol. 8, 119(2010).
  12. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Annu Rev Biomed Eng. 16, 29-52 (2014).
  13. Paulini, F., et al. Survival and growth of human preantral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicle isolation and short-term xenografting. Reprod Biomed Online. 33 (3), 425-432 (2016).
  14. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  15. Joo, S., et al. The effect of collagen hydrogel on 3D culture of ovarian follicles. Biomed Mater. 11 (6), 065009(2016).
  16. Telfer, E., Torrance, C., Gosden, R. G. Morphological study of cultured preantral ovarian follicles of mice after transplantation under the kidney capsule. J Reprod Fertil. 89 (2), 565-571 (1990).
  17. Torrance, C., Telfer, E., Gosden, R. G. Quantitative study of the development of isolated mouse pre-antral follicles in collagen gel culture. J Reprod Fertil. 87 (1), 367-374 (1989).
  18. Dong, C., Yonggang, L. V. Application of collagen scaffold in tissue engineering: recent advances and new perspectives. Polymers. 8 (2), 42(2016).
  19. Le, B. A. M., et al. Agarose-based 3D culture improved the developmental competence of oocyte-granulosa complex isolated from porcine preantral follicle. Theriogenology. 223, 11-21 (2024).
  20. Park, J. E., et al. In vitro maturation on an agarose matrix improves the developmental competence of porcine oocytes. Theriogenology. 157, 7-17 (2020).
  21. Zaniker, E. J., et al. Three-dimensionally printed agarose Micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  22. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  23. West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  24. Xu, J., et al. Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins and insulin. Reproduction. 140 (5), 685-697 (2010).
  25. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  26. Amorim, C. A., Van Langendonckt, A., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  27. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth dagger. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2023).
  28. Mainigi, M. A., Ord, T., Schultz, R. M. Meiotic and developmental competence in mice are compromised following follicle development in vitro using an alginate-based culture system. Biol Reprod. 85 (2), 269-276 (2011).
  29. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  30. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials. 30 (29), 5476-5485 (2009).
  31. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
  32. Irving-Rodgers, H. F., Rodgers, R. J. Extracellular matrix of the developing ovarian follicle. Semin Reprod Med. 24 (4), 195-203 (2006).
  33. Salustri, A., Camaioni, A., Di Giacomo, M., Fulop, C., Hascall, V. Hyaluronan and proteoglycans in ovarian follicles. Hum Reprod Update. 5, 293(1999).
  34. Rashki Ghaleno, L., Cristian, P. P., Shahverdi, A., Dardmeh, F., Alipour, H., Valojerd, M. R. Exploring the role of hyaluronic acid in reproductive biology and beyond: Applications in assisted reproduction and tissue engineering. Adv. Biology. 8 (6), e202300621(2024).
  35. Desai, N. N., Goldberg, J. M., Austin, C., Falcone, T. The new Rapid-i carrier is an effective system for human embryo vitrification at both the blastocyst and cleavage stage. Reprod Biol Endocrinol. 11, 41(2013).
  36. Desai, N., Abdelhafez, F., Calabro, A., Falcone, T. Three dimensional culture of fresh and vitrified mouse pre-antral follicles in a hyaluronan-based hydrogel: a preliminary investigation of a novel biomaterial for in vitro follicle maturation. Reprod Biol Endocrinol. 10 (1), 29(2012).
  37. Desai, N., Spangler, M., Nanavaty, V., Gishto, A., Brown, A. New hyaluronan-based biomatrix for 3-D follicle culture yields functionally competent oocytes. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 148(2022).
  38. Monti, M., Redi, C. A. Isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization. J Vis Exp. (107), e53616(2016).
  39. Huang, L., et al. Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 139 (2), 193-198 (2008).
  40. Chan, J., Darr, A., Alam, D., Calabro, A. Investigation of a novel cross-linked hyaluronan hydrogel for use as a soft-tissue filler. Am J Cosmetic Sur. 22, 105-108 (2005).
  41. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. J Vis Exp. (49), e2695(2011).
  42. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  43. West-Farrell, E. R., et al. The mouse follicle microenvironment regulates antrum formation and steroid production: alterations in gene expression profiles. Biol Reprod. 80 (3), 432-439 (2009).
  44. Xu, M., et al. Encapsulated three-dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles. Biol Reprod. 81 (3), 587-594 (2009).
  45. Wu, J., Nayudu, P. L., Kiesel, P. S., Michelmann, H. W. Luteinizing hormone has a stage-limited effect on preantral follicle development in vitro. Biol Reprod. 63 (1), 320-327 (2000).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Driedimensionale kweekvitrificatie van follikelsoocytenrijpinggroei van preantrale follikelsextracellulaire matrixmuisovariumfollikelscryoprotectieve film
Toepassing van een nieuwe hyaluronzuurhydrogel voor driedimensionale follikelcultuur en methodologie voor cryopreservatie van de ovariële follikel bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.