Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Summary

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Abstract

Driedimensionale (3D) celculturen bieden een nauwkeurigere weergave van de in vivo micro-omgeving dan conventionele tweedimensionale (2D) culturen, omdat ze verbeterde interacties tussen cellen en de extracellulaire matrix bevorderen. Deze studie had tot doel een efficiënte, kosteneffectieve en reproduceerbare methodologie te ontwikkelen om 3D-celstructuren (sferoïden/organoïden) te genereren met behulp van een innovatief op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Een nieuwe stempel werd gebruikt om 663 microwells per putje van een plaat met 6 putjes te produceren, wat een ideale omgeving bood voor celaggregatie. Primaire cellen van de pancreaseilandjes van varkens werden in deze microwells gezaaid, waar ze samenvoegden om sferoïden/organoïden te vormen. De culturen werden geïncubeerd bij 37 °C onder 5% CO₂ en het medium werd om de 3 dagen vervangen. De sferoïdevorming werd periodiek gecontroleerd en er werden monsters verzameld voor karakterisering. De methode genereerde met succes uniforme en hoogwaardige sferoïden, waardoor experimentele variabiliteit werd verminderd, manipulatie werd geminimaliseerd en celinteracties werden verbeterd. Het gebruik van op agarose gebaseerde micropatroonmallen zorgde voor een vereenvoudigde, gecontroleerde omgeving voor 3D-culturen en bood een gestandaardiseerde en kosteneffectieve oplossing. Deze methodologie ondersteunt toepassingen voor het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie en biedt een praktisch en schaalbaar platform voor 3D-celcultuurmodellen die eenvoudig kunnen worden geïmplementeerd in verschillende laboratoriumomgevingen.

Introduction

In de afgelopen 50 jaar hebben talrijke celbiologische onderzoeken aangetoond dat tweedimensionale (2D) culturen er niet in slagen de in vivo omstandigheden die in diermodellen worden waargenomen nauwkeurig na te bootsen¹. Structureel gezien staan 2D-celculturen niet toe dat cellen zich driedimensionaal organiseren en de situatie repliceren die wordt waargenomen in in vivo systemen. Bovendien zijn cellulaire signaalroutes veranderd in 2D-culturen in vergelijking met driedimensionale (3D) culturen, wat waarschijnlijk zou kunnen verklaren waarom bepaalde soorten drugsscreening met behulp van 2D-culturen zo discrepant zijn². Een aanzienlijke vooruitgang in celkweektechnieken ontstond met de introductie van 3D-kweeksystemen. 3D-systemen variëren aanzienlijk in complexiteit, afhankelijk van de cellulaire samenstelling en cytoarchitectuur. Over het algemeen worden er twee soorten structuren gegenereerd, namelijk: sferoïden en organoïden. Spheroïden worden beschreven als eenvoudige clusters van cellen verkregen uit normale of tumorweefsels, embryoïde lichamen en cellijnen. De vorming van 3D-structuren wordt beïnvloed door verschillende factoren, waaronder cel-celinteracties en signaalroutes die worden gemedieerd door componenten van de extracellulaire matrix (ECM), die structurele ondersteuning en biochemische signalen bieden. Deze elementen reguleren interacties die bijdragen aan de weefselorganisatie en -functie³. Het sferoïde kweeksysteem werd voor het eerst beschreven in het begin van de jaren 1970, waarbij V79 longcellijnen van Chinese hamsters werden gebruikt als een model van nodulaire carcinomen, die onder niet-hechtende omstandigheden groeiden en perfecte bollen vormden⁴. Organoïden worden beschreven als clusters van orgaanspecifieke celtypen afgeleid van stam- of voorlopercellen, die zichzelf organiseren door middel van processen, zoals celsortering en afstammingsspecificatie, op een ruimtelijk beperkte manier, een weerspiegeling van de in vivo ontwikkeling⁵.

Er zijn verschillende beschikbare methoden en materialen beschikbaar om cellen onder 3D-omstandigheden te kweken. De belangrijkste methoden die momenteel worden gebruikt voor het genereren van 3D-culturen zijn: 1) hangende druppels; 2) roterende celcultuur en kunststoffen met een lage hechting; 3) piramideplaten met kegelvormige putjes; 4) macroporeuze steigers; 5) magnetische kralen; en 6) steigervrije hydrogels.

Het ophangen van druppels is de methode die wordt gebruikt om steigervrije 3D-culturen te verkrijgen. Deze methode heeft bepaalde beperkingen, waaronder de noodzaak van uitgebreide behandeling, lage productie-efficiëntie, sferische geometrie en blootstelling aan hoge schuifkrachten. Bovendien kunnen specifieke procedures, zoals het vervangen van medium of het toevoegen van verbindingen, een uitdaging zijn en kunnen ze leiden tot materiaalverlies. Bovendien geven literatuurrapporten aan dat sommige cellijnen er niet in slagen om dicht opeengepakte sferoïden te produceren wanneer deze benadering wordt toegepast⁶.

Roterende celcultuur en kunststoffen met een lage hechting worden gebruikt om te voorkomen dat cellen zich aan het substraat hechten, waardoor ze samenklonteren en sferoïden vormen. Dit proces vereist specifieke kolven en/of agitatie/rotatie. Hoewel dit een van de meest eenvoudige benaderingen is voor de grootschalige productie van sferoïden of organoïden, is het niet zonder nadelen, zoals de behoefte aan specifieke apparatuur, een korte levensduur van de cultuur, variatie in grootte in sferoïden, mechanische schade aan cellen en lage efficiëntie⁶.

Piramideplaten met kegelvormige putjes zijn in de handel verkrijgbare platen die van invloed zijn op de kosten, naast het feit dat sommige manipulaties de vorming van sferoïden/organoïden kunnen belemmeren⁷.

Macroporeuze steigers worden ook gebruikt voor 3D-teelt; Een groot obstakel ligt echter in het bereiken van effectieve celzaaiing en uniforme verdeling. Dit probleem doet zich voor omdat de poriegroottes te klein kunnen zijn voor celpenetratie of te groot om de cellen veilig vast te houden. Om dit probleem aan te pakken, zijn verschillende strategieën onderzocht⁸, die een directe invloed hebben op de complexiteit en kosten van deze techniek.

De methodologie voor magnetische kralen genereert een klein aantal sferoïden/organoïden, heeft hoge kosten en kan residuen van nanodeeltjes in de cellen achterlaten⁹.

Onder de systemen voor het kweken van sferoïden zijn niet-klevende agarose-hydrogels beschikbaar, die een steigervrije hydrogel vertegenwoordigen. Deze aanpak biedt opmerkelijke voordelen, zoals nauwkeurige controle over de grootte van de 3D-structuren en de capaciteit om een aanzienlijk aantal van deze structuren per plaat te genereren. Bij deze methode worden cellen ingebracht in een hydrogel met voorgevormde putjes, waarin ze zinken en zichzelf assembleren tot 3D-sferoïden¹⁰.

In deze studie presenteren we een apparaat en methodologie voor het genereren van agarose-microwells met behulp van een micropatroonmal op een eenvoudige, efficiënte, reproduceerbare en goedkope manier.

Het gebruik van deze stempel als mal om microwells in agarose te genereren, geholpen door de zwaartekracht, heeft tot doel de celinteractie binnen de microwell en cellulaire organisatie te verbeteren, door 3D-structuren (sferoïden/organoïden) in vitro te genereren op een eenvoudige, efficiënte, reproduceerbare en goedkope manier, waardoor onderzoekstijd en laboratoriummiddelen worden bespaard.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Human Research Ethics Committee van onze instelling CEUA-FMUSP: 1699/2021, goedgekeurd op 8 september 2021 -"Isolatie en inkapseling van pancreaseilandjes bij varkens" en maakt deel uit van het thematische project van onze cel- en moleculaire therapie NUCEL Group (www.usp.br/nucel), FAPESP Grant No. 2016/05311-2, getiteld: "Regeneratieve geneeskunde gericht op de therapie van chronisch-degeneratieve ziekten (kanker en diabetes)".

1. Fabricage van het stempelapparaat

LET OP: Deze stempel wordt op maat gemaakt door de NUCEL groep (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Het stempelapparaat is ontwikkeld met behulp van de software waarnaar wordt verwezen, algemeen erkend vanwege zijn precisie en geavanceerde driedimensionale modelleringsmogelijkheden.

1. Zorg ervoor dat de ontworpen prototypes 663 micropinnen bevatten die zo zijn gerangschikt dat ze een gelijk aantal driedimensionale culturen, zoals sferoïden of organoïden, kunnen genereren. Om de stabiliteit van de stempel op de oppervlakken van de T6-lade te garanderen, plaatst u vijf steunpunten strategisch langs de omtrek van het apparaat.
2. Zorg ervoor dat de micropinnen een conisch ontwerp hebben met instelbare afmetingen, variërend van 1 tot 3 mm lang. De basisdiameter van de conus varieert tussen 0,7 en 1,5 mm, terwijl de conische hoek varieert van 5° tot 10°.
3. Zorg ervoor dat de "stop"-structuur van het apparaat, die de diepte van de micropinnen definieert, een instelbare lengte heeft van 10 tot 19 mm en een diameter van 20 tot 40 mm, met micropinnen gelijkmatig verdeeld over het oppervlak.
4. Ontwerp het apparaat bovendien met een ergonomische handgreep, geschikt voor bediening met één hand, om de bruikbaarheid en precisie tijdens het gebruik te verbeteren.
   OPMERKING: Om de grootschalige productie van het apparaat mogelijk te maken, wordt het digitale bestand in .stl-formaat geleverd, wat essentieel is voor het 3D-printproces.
5. Snijd het eenvoudig met de juiste software en print het met een compatibele 3D-printer. Gebruik de volgende afdrukafmetingen: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, wat zorgt voor een ideale balans tussen functionaliteit en structurele kwaliteit.
6. Gebruik voor de fabricage van het apparaat een foto-uithardende 3D-printer, die compatibel is met de UV-uithardende polymeerhars die een hoge resolutie en uniforme oppervlakteafwerking moet hebben, essentiële kenmerken voor optimale prestaties van het apparaat.
7. Snijd het digitale model om te printen met software die compatibel is met de geselecteerde 3D-printer.

2. Bereiding van agarose microwells

1. Bereid de agarose-oplossing voor.
   1. Weeg het pure agarosepoeder af en los het op in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 1-2% (w/v) te bereiken.
   2. Verwarm de oplossing in een magnetron of waterbad tot deze volledig is opgelost en zorg ervoor dat deze homogeen en transparant is.
      OPMERKING: Vermijd oververhitting of overmatig opwarmen, omdat dit de agarose kan aantasten. Bereid geen grote hoeveelheden voorraadoplossing voor.
   3. Laat de oplossing afkoelen tot ~40 °C, de ideale temperatuur om te pipetteren.
2. Bereid de op maat gemaakte stempel voor.
   1. Was de stempel met een spons met zachte haren en gedestilleerd water om resten te verwijderen.
   2. Stel de gereinigde stempel 5-10 minuten bloot aan UV-licht om steriliteit te garanderen.
3. Vorm de microwells.
   1. Giet/pipetteer ~3 ml van de 40 °C agaroseoplossing in elk putje van een plaat met 6 putjes, zorg voor een uniforme diepte van 2-3 mm.
   2. Plaats de op maat gemaakte stempel in het midden van het putje terwijl de agarose nog warm is.
      OPMERKING: De stempel heeft zijdelingse steunen die zorgen voor uitlijning en stabiliteit, waardoor handmatige ondersteuning niet nodig is. Elke stempel creëert ~663 microwells (~2 mm hoog) per putje. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen op de micropinnen zitten; Als er luchtbellen ontstaan, verplaats dan voorzichtig de stempel om ze te verwijderen.
   3. Laat de agarose 5-10 minuten stollen bij kamertemperatuur zonder de plaat te verplaatsen.
      OPMERKING: Verstoor de agarose niet tijdens het stollen om variaties in de structuur van de microtiter.
   4. Verwijder de stempel met zachte heen en weer gaande bewegingen om het vacuüm te bevrijden zonder de microwells te beschadigen.
      OPMERKING: Deze beweging vergemakkelijkt het binnendringen van de lucht, waardoor de stempel soepel kan worden verwijderd zonder de gel te vervormen. De microwells moeten intact blijven.
   5. Was de microwells 3x met PBS-oplossing om resten te verwijderen.
   6. Stel de plaat gedurende 10 minuten bloot aan UV-licht om microbiële besmetting te voorkomen.
   7. Voeg 3 ml kweekmedium toe en incubeer de plaat een nacht in een CO₂ -incubator bij 37 °C.
      OPMERKING: Deze incubatie controleert de afwezigheid van besmetting vóór het zaaien van de cellen.

3. Celuitzaaiing in microwells

1. Bereid de celsuspensie voor.
   1. Verzamel de cellen via trypsinisatie of een andere dissociatiemethode om een homogene suspensie te verkrijgen.
   2. Tel de cellen en pas de concentratie aan volgens het gewenste aantal per microwell.
      OPMERKING: Om 5.000 cellen per microwell in 663 microwells te zaaien, bereidt u een suspensie voor die ten minste 3.315 × 10⁶ cellen in totaal bevat. Optimaliseer de celconcentratie om centrale necrose te voorkomen en om te zorgen voor voldoende verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof.
2. Zaai de cellen.
   1. Pipetteer ~3 ml van de voorbereide celsuspensie over de microwells en zorg voor een gelijkmatige verdeling door de plaat voorzichtig rond te draaien.
   2. Laat de cellen door de zwaartekracht bezinken (~10-15 min) of voer een zachte centrifugatie uit bij 100 × g gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Centrifugatie kan worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de cellen zich concentreren in de microwells.
   3. Breng de plaat over naar een CO₂ -incubator bij 37 °C met een bevochtigde atmosfeer.

4. Onderhoud van 3D-celculturen

1. Vervang de voedingsbodem.
   1. Vervang het medium elke 2-3 dagen, verwijder 50% van het oude medium en voeg vers medium toe.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de microwells gedurende de kweekperiode ondergedompeld blijven om uitdroging te voorkomen.
2. Monitor de vorming van 3D-culturen.
   1. Ga door met kweken totdat de 3D-structuren volledig gevormd en compact zijn (bijv. 2-3 dagen voor primaire eilandjesculturen van de alvleesklier).
      OPMERKING: Voor culturen die een langere vormingstijd nodig hebben, voert u elke 2-3 dagen een gedeeltelijke mediumwissel uit.

5. Verzameling en karakterisering van 3D-structuren

1. Verzamel de sferoïden/organoïden.
   1. Verwijder het oude medium en verzamel de 3D-structuren door krachtig te pipetteren met behulp van een pipetpunt met een grote diameter of gesneden pipetpunt om compressie of desaggregatie te voorkomen.
      OPMERKING: Krachtig pipetteren moet onder controle worden gecontroleerd om de aggregaten los te maken zonder ze te vervormen.
2. Bereid je voor op analyse.
   1. Gebruik de verzamelde sferoïden/organoïden onmiddellijk of fixeer ze voor toekomstige analyse.
      OPMERKING: De associatie en stabiliteit van sferoïden zijn afhankelijk van het celtype, de vormingstijd en de kweekomstandigheden. Voorzichtigheid is essentieel om dissociatie te voorkomen.

Results

De celcultuur die in dit onderzoek werd gebruikt, was afkomstig van pancreaseilandjes van varkens. Het eilandjespreparaat dat in deze studie werd gebruikt, had een zuiverheid van 80 ± 5% op basis van dithizonkleuring en een levensvatbaarheid van >80% eilandcellen op basis van de detectie van fluoresceïnediacetaat in levende cellen of propidiumjodide in dode cellen (de Live/Dead fluorescentie-methode). Zorg ervoor dat het preparaat van de pancreaseilandjes van varkens ten minste 80% zuive...

Discussion

Hoewel er in de literatuur verschillende 3D-cultuurprotocollen bestaan, testte een studie van Wassmer et ^al.13 verschillende methodologieën voor het genereren van 3D-structuren met behulp van pancreaseilandjes. De auteurs merkten op dat inheemse eilandjes en zelfgeaggregeerde sferoïden een aanzienlijke heterogeniteit vertoonden met betrekking tot grootte en vorm en groter waren dan die verkregen met andere methoden. Op basis van hun bevindingen concludeerden ze da...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L Magnetron	Electrolux	78965840 6699 9	Apparaat dat wordt gebruikt om de agarose-oplossing te verwarmen, waardoor de oplossing gemakkelijker oplost en meer homogeen wordt. Het maakt het mogelijk dat de oplossing de ideale vloeibare toestand bereikt voor de vorming van de putjes.
3DFila Gray Opaque Fotogevoelige 3D Resin			UV-uithardende polymeerhars
3D Printer - Creality Halot One	Creality	N/A	3D-printer die wordt gebruikt voor het printen van het stempelapparaat
Agarose	UNISCIENCE	UNI-R10111	Om de gel te vormen, lost u 1 tot 2% op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of een geschikt medium.
Autodesk Fusion 360			3D-modellering
BB15 CO2 Incubator	Thermo Fisher	51023121	Apparaat dat wordt gebruikt om gekweekte cellen te incuberen in een geschikte en gecontroleerde omgeving.
Chitubox	Chitubox	N/A	Software die wordt gebruikt voor het snijden van het onderdeel voor afdrukken
Klasse II Biologische Veiligheidskast	Grupo VECO	N/A	Zorgt voor een steriele omgeving voor het uitvoeren van celkweek binnen vastgestelde parameters en protocollen.
Kweekmedium	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	Bevat additieven voor de juiste celkweek.
Kweekplaten (P6)	SARSTEDT	1023221	Wordt gebruikt om de agarose te vormen en de cellen te kweken.
Erlenmeyer-kolf (25 mL)	Laborglas	91 216 14	Een container die wordt gebruikt voor het oplossen van 1–2% agarose in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of een ander geschikt medium, meestal verwarmd in een magnetron.
Falcon 15 mL Polystyreen Centrifugeerbuis	Corning	352099	Wordt gebruikt om cellen in suspensie te houden en eventuele verdunning uit te voeren.
Foetaal bovien serum (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Additief voor kweekmedium.
PBS-oplossing (fosfaatgebufferde zoutoplossing)	Lab made	N/A	1x verdund met MiliQ ultrapuur water. Wordt gebruikt om agarose 1 tot 2% op te lossen en om reeds geproduceerde putjes te wassen.
Reagensfles met blauwe dop - Schott	Laborglas	21801545	Wordt gebruikt voor het bereiden en opslaan van kweekmedium.
Stempelaar	NUCEL Group	N/A	Link- Deze link biedt toegang tot het .stl-bestand van het stempelapparaat. Snijd het gewoon met de juiste software en print het met een compatibele 3D-printer. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=sharing
Behandelde kweekflacon met filter 25 cm²	Corning	430639	Wordt gebruikt voor de kweek en het onderhoud van adherante cellen.
Trypsine	Merck	07-07-9002	Voor het losmaken van cellen voor het zaaien.
Ultraviolet licht (UV)	N/A	N/A	Wordt gebruikt om het stempel en de platen te steriliseren.