Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwerp en validatie van een volumetrische extrusie bioprinter voor het bioprinten van oplosbaar basaalmembraanextract voor translationeel onderzoek

970 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67788

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Biological Structure Mechanics (LaBS), Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

In dit artikel

Samenvatting

Oplosbare basaalmembraanextracten zijn de meest gebruikte biologische matrices in kankeronderzoek, maar hun complexe reologische gedrag maakt het moeilijk om ze te bioprinten met in de handel verkrijgbare bioprintsystemen. Dit werk presenteert een op maat gemaakte bioprintstrategie om zuivere matrixconstructies te produceren met een goede vormgetrouwheid in zowel enkele als meerdere lagen.

Samenvatting

In translationeel onderzoek zijn 3D in vitro modellen essentieel voor het bevorderen van wetenschappelijk inzicht en therapeutische ontwikkeling. Daartoe spelen oplosbare basaalmembraanextracten (SBM'en), afgeleid van sarcoomcellen van muizen, de sleutelrol bij het repliceren van mechanische en biochemische kenmerken van de in vivo micro-omgeving. Ze zijn bijzonder waardevol in verschillende onderzoeksgebieden, van weefselmanipulatie tot het testen van medicijnen. Ze zijn met name fundamenteel geworden in kankeronderzoek, aangezien traditionele 2D-celculturen, die veel in het veld worden gebruikt, misleidende informatie kunnen opleveren omdat ze de driedimensionale (3D) structuur en de micro-omgeving van de tumor niet vastleggen.

In kankeronderzoek zijn effectieve 3D in vitro modellen cruciaal voor een beter begrip van de evolutie van kanker en het anticiperen op uitdagingen, zoals resistentiemechanismen tegen geneesmiddelen. Organoïden zijn naar voren gekomen als veelbelovende 3D in vitro modellen, die een nauwkeurigere weergave van tumorbiologie bieden. Ze groeien in SBM's terwijl ze een omgeving creëren waarin cellen kunnen groeien en zichzelf kunnen organiseren in 3D-structuren. SBMe brengt echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee, waaronder lage mechanische eigenschappen en complex reologisch gedrag, waardoor het gebruik ervan met in de handel verkrijgbare pneumatische extrusie-bioprintsystemen wordt voorkomen.

Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we een goedkoop, volumetrisch gecontroleerd bioprintsysteem en een specifiek protocol voor het printen van structuren met SBMe. Dit systeem is gebaseerd op een volumetrische extruder en overwint de beperkingen van traditionele pneumatisch aangedreven benaderingen. Eenmaal geassembleerd en geprogrammeerd met een specifieke g-code, kan het systeem zowel zuivere als verdunde SBMe bioprinten om zowel enkel- als meerlaagse constructies te verkrijgen. Deze aanpak biedt een betrouwbaardere en schaalbaardere methode voor het produceren van 3D-celcultuurmodellen, wat de weg vrijmaakt voor effectiever onderzoek naar nieuwe behandelingen en het testen van geneesmiddelen.

Inleiding

In translationeel onderzoek is het creëren van 3D in vitro modellen die de in vivo omgeving nauwkeurig nabootsen essentieel voor het bevorderen van wetenschappelijk inzicht en therapeutische ontwikkeling1. Een belangrijk onderdeel bij het bouwen ervan is het gebruik van extracellulaire matrix (ECM) -analogen, zoals oplosbare basaalmembraanextracten (SBM's), die de complexiteit van natuurlijke weefsels beter weerspiegelen. SBM'en zijn bijzonder waardevol in verschillende onderzoeksgebieden, van weefselmanipulatie tot het testen van geneesmiddelen 2,3. Ze zijn met name fundamenteel geworden in kankeronderzoek, omdat ze mechanische en biochemische kenmerken van de micro-omgeving van de tumor repliceren, waardoor modellen kunnen worden ontwikkeld die tumorgroei, metastase en behandelingsreacties beter weerspiegelen.

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de afgelopen decennia, blijven veel therapieën falen, wat leidt tot frequent falen van de behandeling in klinische omgevingen. Dit falen wordt vaak toegeschreven aan resistentiemechanismen tegen geneesmiddelen die worden veroorzaakt door hoge niveaus van celheterogeniteit 4,5. Effectieve in vitro modellen, die in staat zijn om de complexiteit van menselijke tumoren nauwkeurig samen te vatten, zijn cruciaal om de evolutie van kanker beter te begrijpen en op dit fenomeen te anticiperen.

Traditionele 2D-celculturen zijn van fundamenteel belang geweest in kankeronderzoek, maar kunnen leiden tot misleidende informatie over de werkzaamheid van geneesmiddelen en tumorgedrag, omdat ze er niet in slagen de 3D-structuur en micro-omgeving van werkelijke tumoren vast te leggen 6,7,8. Daarentegen zijn 3D in vitro modellen naar voren gekomen als veelbelovende alternatieven, die een nauwkeurigere weergave bieden van de micro-omgeving van de tumor en biologisch gedrag door 3D-complexiteit na te bootsen 9,10.

In kankeronderzoek worden organoïden veel gebruikt als 3D-modellen voor het bestuderen van ziekten en de werkzaamheid van geneesmiddelen, omdat ze nauwkeurigere en relevantere modellen van menselijke weefsels en organen bieden. Het gebruik van SBMe, afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm-muizensarcoomcellen, is van cruciaal belang geweest voor het bevorderen van kankeronderzoek11,12. Het biedt een gelachtig substraat waarin cellen kunnen groeien, zich vermenigvuldigen en zichzelf kunnen organiseren tot organoïde structuren, wat zorgt voor een goede ontwikkeling en groei 13,14.

SBMe brengt echter een aantal uitdagingen met zich mee vanwege zijn unieke en complexe kenmerken. Als niet-Newtoniaanse vloeistof vertoont SBMe afschuifverdunnende eigenschappen, wat betekent dat de viscositeit afneemt bij toenemende schuifspanning, waardoor de hantering en toepassing inconsistent worden onder variabele krachten. Bovendien draagt het thixotrope gedrag bij aan de complexiteit, omdat het zijn viscositeit na verloop van tijd kan herstellen wanneer schuifspanning wordt verwijderd15,16. Deze eigenschappen, samen met een lage mechanische sterkte (met opslagmoduluswaarden variërend van 10 Pa tot 5.000 Pa, afhankelijk van de eiwitconcentratie) en warmtegevoelig gedrag, verergeren deze uitdagingen, en vereisen een nauwgezette controle tijdens de bereiding en het gebruik, evenals het puur bioprinten.

Standaard pneumatisch aangedreven bioprintsystemen slagen er niet in om de SBMe-dosering goed te regelen, omdat de toepassing van druk oncontroleerbaar gedrag veroorzaakt na het uitwerpen uit de spuit. Het wordt beïnvloed door een fenomeen dat vergelijkbaar is met het "spurt" -effect" beschreven voor polymere smelten, waarbij het debiet abrupt toeneemt tot boven een bepaalde kritische drukwaarde 17,18,19. Zoals gerapporteerd in ons eerdere werk16, maakt de doseerstrategie met volumetrische regeling het mogelijk om SBMe-extrusie los te koppelen van de druk die in de dispenser wordt gegenereerd, die afhankelijk is van de reologische eigenschappen van de matrix, de werkomstandigheden en de geometrie van het mondstuk. In de afgelopen jaren zijn er verschillende pogingen in de markt gedaan om hetzelfde principe te exploiteren, met de Matribot van Corning voorop. Het maakt de behandeling en afzetting van SBMe en andere temperatuurgevoelige bio-inkten mogelijk dankzij gecontroleerde temperatuuromstandigheden. Het kan echter duur zijn, waardoor de toegankelijkheid voor kleinere laboratoria wordt beperkt.

In ons vorige artikel hebben we een goedkoop, op maat gemaakt alternatief gepresenteerd: een volumetrisch aangedreven bioprintsysteem16. Deze versie was gebaseerd op een aangepaste 3D-printer op instapniveau met een op maat gemaakte 3D-geprinte extruder. Ondanks de effectiviteit ervan bij bioprinting, vertoonde het enkele beperkingen in de herhaalbaarheid van printen. Omdat het was afgeleid van een instapmodel 3D-printer, had het wat problemen met de Z-bewegingen en auto-homing. Om aan deze behoeften te voldoen, hebben we een geavanceerde versie van ons op maat gemaakte low-cost volumetrische doseersysteem en een specifiek protocol voor bioprintstructuren met behulp van SBMe ontwikkeld.

Hier bieden we protocollen voor de bouw en het gebruik van dit systeem. Het is samengesteld uit een op maat gemaakte volumetrisch-gestuurde extruder, gebaseerd op onze eerdere studie16, een bioprinterbehuizing en een besturingssysteem. Productie en assemblage worden voor elke module gemaakt. Wanneer het systeem wordt geassembleerd en geprogrammeerd met een specifiek gcode-bestand, volgens de protocolbeschrijving voor matrixverwerking, is het in staat om zuivere of verdunde constructies te bioprinten met behulp van de SBMe met een goede vormgetrouwheid in zowel enkele als meerdere lagen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. 3D printen en assembleren van volumetrische bioprinters

  1. Bereid de bioprintercomponenten voor en 3D-print.
    1. Download de *. STL-ontwerpbestanden uit aanvullend bestand 1.
    2. Lading*. STL-bestand in de eigen slicing-software om de oriëntatie van de stukken op de drukplaat en alle opties die nodig zijn voor de 3D-printer te definiëren. Print de stukken met polymelkzuur (PLA) met opties van gemiddelde kwaliteit (0,4 mm nozzlegrootte, 1,75 mm filamentdiameter, 220 °C extrudertemperatuur, 50 °C printbedplaattemperatuur, 0,2 mm laaghoogte, 300 mm/s printsnelheid).
      OPMERKING: Opties van gemiddelde kwaliteit kunnen verschillen, afhankelijk van de printer die is gebruikt voor het afdrukken van de stukken.
    3. Maak de geprinte stukken los van het 3D-printerbed. Verwijder de geprinte ondersteunende structuren, indien aanwezig, en polijst de oppervlakken waar nodig.
  2. Zet de extruder in elkaar (Figuur 1).
    1. Plaats twee lineaire kogellagers (LM4UU) in de verticale gaten van het duwblok. Steek ook een spindelmoer T8 in het achterste centrale gat en zet deze vast met vier schroeven (M3x10).
    2. Bevestig een stijve askoppeling aan de stappenmotor en bevestig deze vervolgens met vier schroeven (M3x6) aan de behuizing van de extrudermotor.
      OPMERKING: Richt de stappenmotor volgens de groef in de behuizing van de extrudermotor om de juiste positionering van de aansluiting voor kabels mogelijk te maken.
    3. Bevestig de stappenmotor, gemonteerd in stap 1.2.2, aan een T8-spindel (150 mm) met behulp van de eerder geplaatste starre askoppeling. Zorg ervoor dat elk blok goed vastzit met de stelschroeven.
    4. Bevestig een zelfuitlijnend flenslager (8 mm binnendiameter) aan de onderkant van de extruderbasis met twee schroeven (M4x8).
    5. Plaats twee kogellagers (4 x 9 x 4 mm) in de specifieke gaten aan de bovenkant van de extruderbasis en de andere twee in de gaten in het onderste gedeelte.
    6. Plaats het gemonteerde onderdeel (stap 1.2.1) in de extruderbasis via de holte in het bovenste deel van de structuur. Verbind de vier kogellagers (stap 1.2.5) met twee stangen van 4 mm, één voor elke kant. Laat de stangen in stap 1.2.1 door de twee lineaire kogellagers in het geassembleerde onderdeel gaan.
      OPMERKING: Het is ook mogelijk om eerst de staven op de bovenste twee kogellagers te plaatsen en ze vervolgens in de extruderbasis te plaatsen totdat ze het onderste kogellager bereiken en alles in de gedefinieerde sleuven is vastgezet.
    7. Plaats het geassembleerde onderdeel in stap 1.2.3 in het centrale gat van de extruderbasis. Draai de spindel om de spindelmoer te passeren en het zelfuitlijnende flenslager te bereiken. Gebruik de stelschroeven in het onderdeel om de spindel te vergrendelen en twee schroeven (M3x8) om de behuizing van de extrudermotor aan de bovenkant van de extruderbasis te bevestigen.
    8. Gebruik twee andere schroeven (M3x40) en M3-moeren om de flenshouder van de spuitcilinder aan het onderste deel van de extruderbasis te bevestigen, om de flens van de spuitcilinder te vergrendelen (invoegrichting van boven naar beneden). Gebruik twee andere schroeven (M3x30) en M3-moeren om de zuigerhouder van de spuit aan de bovenste gaten van het duwblok te bevestigen (invoegrichting van onder naar boven) om de plunjerflens te vergrendelen.
    9. Steek twee schroeven (M4x80) in twee veren en laat ze door de gaten gaan die aanwezig zijn in het onderste deel van de extruderbasis en het spuitblok. Draai de moeren vast en laat ruimte over voor de spuit om te voorkomen dat het spuitblok wegglijdt.
      OPMERKING: Schroeven moeten van achteren naar voren gaan.
  3. Monteer de X-as (Figuur 2).
    1. Plaats vier lineaire kogellagers (LM8UU x 24 mm) in de X_Left_Block en X_Right_Block delen in de bovenste en onderste gaten, twee voor elk. Bevestig ook twee riemblokken bovenop de X rechter en X linker blokken met schroeven (M2x10) en laat ruimte over voor de riem.
    2. Plaats twee kogellagers (5 x 16 x 5 mm) in de centrale gaten van X_Right_Block, één aan elke kant. Plaats een katrol (boring 5 mm) in de binnenholte van X_Right_Block en verbind de twee kogellagers met een stang van 5 mm (35 mm lengte) en laat deze door de poelie gaan.
      NOTITIE: Gebruik een langere stang voor de montage voor een betere hantering. Nadat u de stukken op hun plaats hebt geplaatst, snijdt u de staaf op de gewenste lengte.
    3. Bevestig een eindschakelaar aan de X_motor_housing met twee schroeven (M3x8). Plaats de NEMA 17-motor in het motorhuis en gebruik vier schroeven (M3x8) om het X_block_1 deksel aan het motorhuis en de motor te bevestigen.
    4. Bevestig een katrol (boring 5 mm) aan de motor en vergrendel deze met stelschroeven en schroef vervolgens het gemonteerde onderdeel in stap 1.3.3 in elkaar tot X_block_1 met vier schroeven (M5x8). Bevestig ook een eindschakelaar aan de onderkant van X_Left_Block met twee schroeven (M3x8).
      OPMERKING: De buitendiameter van de poelies in de stappen 1.3.2 en 1.3.4 moet hetzelfde zijn.
    5. Plaats twee lineaire kogellagers (LM8UU x 45 mm) in de gaten aan de boven- en onderkant van de X_slider.
    6. Verbind de gemonteerde onderdelen in stap 1.3.2 en 1.3.4 met twee staven van 8 mm (200 mm lengte) en laat ze in stap 1.3.5 door het gemonteerde onderdeel gaan.
      NOTITIE: Snijd de staven van de gewenste lengte voordat u ze in elkaar zet.
    7. Vergrendel één riemuiteinde aan de X_slider_belt_connection met behulp van het riemblok en twee schroeven (M2x8). Leid de riem rond de poelie in het geassembleerde onderdeel 1.3.4, vervolgens rond de poelie in het geassembleerde onderdeel 1.3.2 en bevestig het andere riemuiteinde aan de X_slider_belt verbinding met behulp van het tweede riemblok en twee andere schroeven (M2x8). Zorg ervoor dat de riem goed strak zit om de juiste beweging te verkrijgen.
      NOTITIE: Tijdens deze stap moet de X_slider naar het ene uiteinde van de X-asstructuur worden verplaatst om interferentie te voorkomen.
    8. Schroef de X_slider_belt_connection met één schroef (M6x20) op de X_slider.
    9. Sluit de extruder aan op de X_slider en bevestig deze met vier schroeven (M5x10).
  4. Monteer de Y-as (Figuur 3).
    1. Plaats de bevestigingsbeugel op het achterste bioprintergedeelte met behulp van vier schroeven (M3x10) en vier moeren.
      OPMERKING: De positie van de bevestigingsbeugel kan worden aangepast om de juiste spanning van de riem te verkrijgen en het inbrengen van de stappenmotor mogelijk te maken.
    2. Plaats de stappenmotor in de bevestigingsbeugel en schroef deze vast met vier schroeven (M3x8). Plaats vervolgens een poelie (boring 5 mm) op de krukas en zet deze vast met stelschroeven.
      NOTITIE: De poelie kan aan de krukas worden bevestigd voordat de motor in de bevestigingsbeugel wordt geplaatst om interferentie tussen componenten te voorkomen.
    3. Zoek twee poelies (8 mm binnendiameter) op de voorste 8 mm staaf en vergrendel ze op de twee stangen (2,5 cm ver van het uiteinde). Herhaal deze handeling voor de achterste stang en voeg nog een poelie toe, 5 cm ver van het rechteruiteinde.
    4. Bevestig 12 zelfinstellende flenslagers (8 mm diameter) aan de binnenkant van de bovenste delen van de bioprinter.
    5. Verbind de twee voorste bioprinteronderdelen en de twee achterste bioprinteronderdelen (richting links/rechts) met behulp van de gemonteerde staven in stap 1.4.3 en vergrendel ze op de zelfuitlijnende flenslagers (diameter 8 mm). Zet de twee gemonteerde onderdelen op alle kruispunten vast met schroeven (M3x8).
      NOTITIE: Plaats bij het positioneren van de achterste stang een gesloten riem die de poelie op de stappenmotor verbindt met de binnenste poelie op de stang.
      NOTITIE: Zet de stappenmotor vast door de moeren vast te draaien om ervoor te zorgen dat de motor niet beweegt en de riem goed wordt gespannen.
    6. Verbind de twee gemonteerde onderdelen in stap 1.4.5 met behulp van vier staven van 8 mm. Laat de stangen door de lineaire kogellagers gaan die aanwezig zijn in het geassembleerde onderdeel 1.3 en vergrendel ze op de zelfuitlijnende flenslagers (8 mm diameter). Zet de twee gemonteerde onderdelen op alle kruispunten vast met schroeven (M3x8).
    7. Bevestig een open riemuiteinde aan het bovenste deel van de X_block_1 met behulp van het riemblok en herhaal deze handeling voor de X_block_2. Leid de riem om de achterste poelies aan de linkerkant, vervolgens om de voorste poelie en bevestig het andere riemuiteinde weer aan de X_block_1 met een ander riemblok. Herhaal deze handeling voor de tweede riem.
      NOTITIE: De riemen moeten goed worden aangespannen om de juiste beweging te verkrijgen en van dezelfde lengte om buigen of interferentie in Y-bewegingen te voorkomen.
  5. Monteer de Z-as (Figuur 4).
    1. Schroef de onderste behuizingsdelen van de bioprinter (M4x8) aan elkaar.
    2. Bevestig een zelfuitlijnend flenslager (diameter 8 mm) aan de vloer van de onderkant van het gemonteerde onderdeel in stap 1.5.2.
    3. Bevestig twee flensvormige lineaire kogellagers (LMH8UU) aan de externe gaten in de Z_slider en één spindelmoer in het centrale gat met schroeven (M3x8).
    4. Bevestig een eindschakelaar aan de Z_plane linkerkant met twee schroeven (M3x8).
    5. Bevestig de stappenmotor aan een stijve askoppeling. Bevestig een stappenmotor aan de Z_block met vier schroeven (M3x20) en een draadstang aan de starre askoppeling. Zorg ervoor dat elk blok goed vastzit met de stelschroeven.
    6. Sluit het gemonteerde onderdeel in stap 1.5.5 aan op de basis van de bioprinter met behulp van twee staven van 8 mm. Laat ze in stap 1.5.3 door het gemonteerde onderdeel gaan.
    7. Bevestig de Z_block aan de achterwand met behulp van twee schroeven (M5x8).
    8. Sluit Z_plane aan op Z_slider met behulp van vier schroeven (M3x25). Steek ze van boven naar beneden in de Z_plane gaten, passeer de veer tussen Z_plane en Z_slider en zet ze vast met moeren. Pas de veerspanning aan om het vliegtuig waterpas te zetten.
    9. Bevestig vier verstelbare voetjes onder de bioprinterstructuur in de specifieke holte. Zet de bioprinter waterpas door de voetjes aan te passen.
    10. Sluit het gemonteerde onderdeel aan op het gemonteerde onderdeel in stap 1.4.6 met acht schroeven (M4x12).
    11. Bevestig twee scharnieren aan de voorkant van de structuur op de specifieke locaties en een magneet aan het rechterdeel op de betreffende plek met schroeven (M2x8). Schroef de algehele structuur op transparante plexiglasplaten van 2 mm om de openingen af te sluiten.
      NOTITIE: Schroef het plexiglaspaneel aan de voorkant op de scharnieren en plaats een andere schroef in overeenstemming met de magneet om een voordeur te verkrijgen.
  6. Geef het geheel weer (Figuur 5A).
    1. Laat de draden, aangesloten op het scherm, door het onderste gat gaan en bevestig het scherm met vier schroeven (M3x3) aan de schermbehuizing.
      OPMERKING: Deze passage moet worden gedaan zonder het deksel van de LCD-knop. Het kan zich op de vooraf geïnstalleerde knop bevinden na de bevestiging aan de schermbehuizing.
    2. Sluit de behuizing met het deksel af met behulp van vier schroeven (M2x6).
    3. Plaats de SD-kaart in de linkersleuf.
    4. Laat de draden door het gat aan de bovenkant van de structuur gaan. Schroef het geassembleerde onderdeel aan de bovenkant van de bioprinter vast met twee schroeven (M3x8).
      NOTITIE: Alle draden (motoren, eindschakelaars en display) lopen dicht bij de muur en komen uit het gat linksonder. Ze worden bevestigd met kabelklemmen om interferentie met de mechanische onderdelen te voorkomen.
  7. Elektronica assemblage (Figuur 5B)
    1. Bevestig de aansluiting aan het buitenste deel van de elektronische behuizing met twee schroeven (M3x10).
    2. Bevestig het moederbord aan de binnenkant van de elektronische behuizing met vier schroeven (M3x10).
    3. Bevestig het onderste deel van de voeding aan het binnenste deel van de elektronische behuizing met vier schroeven (M3x8).
    4. Leid de draden door het ronde gat op het deksel en sluit ze aan op het moederbord. Sluit de elektronische behuizing met het deksel met vier schroeven (M3x10).
      OPMERKING: Het is mogelijk om de elektronicabehuizing aan te sluiten op de bioprinterstructuur of om deze op het bureau te laten staan in het geval van kleine werkruimtes.
      Figuur 6 toont alle elektronische kabelverbindingen. Ze kunnen iets afwijken, afhankelijk van het 3D-printermoederbord dat in gebruik is.

2. Software-instelling en gcode-generatieproces

  1. Voorbereiding van de instellingen van de slicing-software
    1. Open de slicing-software.
      OPMERKING: Instructies kunnen verschillen afhankelijk van de gebruikte software of de versie.
    2. Log in op het platform.
    3. Ga naar de opties Instellingen . Selecteer de printer en vervolgens Een printer zonder netwerk toevoegen. Selecteer aangepaste FFF-printer en typ in het vak Printernaam de naam voor de printer. Klik op Toevoegen.
      OPMERKING: Als het de eerste software-installatie is, wordt het paneel Printer toevoegen automatisch geopend nadat u zich hebt aangemeld.
    4. Wijzig in het venster Machine-instellingen de standaardinstellingen x, y, z in 176, 120, 45 mm.
    5. Schakel de optie Verwarmd bed uit als deze nog niet is uitgeschakeld.
    6. Voeg in de deelvensters Beginnende g-code en Eindigende g-code de tekstregels in die worden gerapporteerd in de bestanden met de titel 'JoVE_Starting_G-code.txt' en 'JoVE_Ending_G-code.txt' in Aanvullend Bestand 2.
      1. Wijzig de waarde 150 in regel 'M92 E150' in het startbestand met de g-code volgens het toe te passen debiet. Schat de juiste waarde met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-1
        Waarbij Q het gewenste debiet [μL/min] is.
        OPMERKING: Deze formule is experimenteel verkregen met het beschreven systeem. Het kan anders zijn als er wijzigingen zijn in de mechanische of elektrische componenten. Een mogelijk alternatief zou kunnen zijn om de waarde vast te stellen op basis van het gebruikte systeem en een aangepaste MATLAB-code te maken om het gewenste gcode-bestand te genereren.
    7. Wijzig de waarde voor de compatibele materiaaldiameter in het Extruder 1-paneel in 1,75 en sluit vervolgens.
    8. Ga naar Marketplace, selecteer de Z Offset Setting-plug-in en installeer deze. Aan het einde van het proces start u de software opnieuw op om deze af te ronden. Zodra het opnieuw wordt geopend, selecteert u Instellingen | Drukker | Printers beheren op de werkbalk. Klik in het venster Voorkeuren op Instellingen en activeer alle opties door de optie Alles controleren te selecteren en te sluiten.
    9. Configureer de instellingen door op de afdrukinstellingen (derde knop) te klikken in het fasemenu , dat het configuratiepaneel bevat. Voer het vulpercentage in het huidige afdrukprofiel in het configuratiepaneel in. Selecteer de knop Aangepast om de huidige afdrukinstellingen en het profiel Fine te wijzigen in het vervolgkeuzemenu. Stel de afdruksnelheid in op 10 mm/s.
  2. gcode voorbereiding
    1. Download de *. STL-ontwerpbestand, getiteld 'JoVE_Square', uit aanvullend bestand 2 van dit document.
    2. Lading. STL-bestand in de slicing-software.
    3. Zoek het stuk op het vlakke oppervlak en ga naar de coördinaten 65, 42.5, 0 (X, Y, Z) mm. Maak twee kopieën door op de knop te klikken. STL-bestandsnaam in de objectenlijst en selecteer de optie vermenigvuldigen geselecteerd. Verplaats ze naar de volgende coördinaten: 16, 42,5, 0 mm en -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      OPMERKING: Het is niet mogelijk om de afdrukopdracht automatisch te definiëren, tenzij deze rechtstreeks handmatig in het uiteindelijke gcode-bestand wordt gewijzigd. Coördinaten worden gedefinieerd voor een plaat met 6 multiwells.
    4. Ga naar de Afdrukinstellingen in het fasemenu. Zet in de sectie Muren 0 als Aantal muurlijnen. Zet 0 als Boven-/onderdiktewaarde in het gedeelte Boven-/onderlaag. Voer in het deelvenster Vulling de volgende waarden in: Vulpatroon: Raster, Afstand vullijn: 5 mm, Richtingen vullijn: [0].
      OPMERKING: Het is mogelijk om de reissnelheid te verlagen in het gedeelte Afdruksnelheid om de nauwkeurigheid van de X-as te verbeteren.
    5. Schakel intrekken uit in de sectie Reizen en afdrukkoeling in de sectie Koeling .
    6. Selecteer in de sectie Hechting van bouwplaat de optie Geen als het hechtingstype van de bouwplaat, terwijl u in de sectie Speciale modi de optie Eén voor één selecteert als de afdrukvolgorde.
    7. Klik op de Slice-knop om de g-code te genereren.
    8. Open het g-code-bestand met de Kladblok-applicatie en verwijder de regels "M104 S200", "M105" en "M109 S200" in regel 12 na de zin "; Gegenereerd met Cura_SteamEngine 4.9.0".
    9. Voeg "G1 Z25" toe voor de volgende regel "; GAAS: JoVE_Square_rev. STL(6)" en splitste de volgende in tweeën: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 en (2) G1 Z0.3.
      OPMERKING: X- en Y-coördinaten zijn slechts voorbeelden.
    10. Wijzig de Z-waarde in Z25 in elke regel na "; TIME_ELAPSED" commentaar op elke laatste laaginstructie van elk stuk.
      OPMERKING: Voor het afdrukken van slechts één stuk is stap 2.3.10 niet vereist.

3. Zwellings-/degradatietest

  1. Voorbereidende stappen
    1. Neem een steriele glazen spuit van 1 ml (TLL-aansluiting) en een steriel conisch mondstuk van 25 G. Zet ze in elkaar en zet de gemonteerde spuit in de koelkast.
    2. Zet de pipetpunten en de SBMe-matrixflacon de dag voor het experiment een nacht in de koelkast.
    3. Print drie PLA-rasters (Φ = 20 mm) met een cirkelvormige porie van 1 mm x 1 mm en een verticale pilaar aan de zijkant om ze vast te pakken.
  2. Printconstructies
    1. Haal de geassembleerde spuit en de injectieflacon met SBMe-matrix uit de koelkast. Zuig 500 μL van de SBMe-matrix op en plaats deze gedurende 15 minuten in de incubator om geleerling mogelijk te maken.
    2. Neem de spuit uit de couveuse en plaats deze in de printkop van de bioprinter. Zorg ervoor dat de zuiger van de spuit goed in contact is met het duwblok.
    3. Zet de bevestigingsplunjer van de spuit en de flens van de spuitcilinder vast met de zuigerhouders van de spuit en de cilinder van de spuit met de spuitklem.
    4. Kalibreer het systeem met behulp van de Auto-home-instelling in het bioprintermenu om automatisch de oorsprong van assen te detecteren.
    5. Verplaats de extruder met de opdracht Assen verplaatsen totdat de punt van de naald het PLA-raster raakt om Z0 handmatig te definiëren.
    6. Begin met printen door het g-code-bestand te selecteren dat je wilt printen in het bioprintermenu.
    7. Plaats de multiwellplaat 2 minuten in de broedmachine om de SBMe na de extrusie te laten bezinken.
    8. Neem de multiwell-plaat en doe 2 ml celkweekmedium in de drie putjes met de gebioprinte roosters. Plaats de multiwellplaat in de broedmachine.
    9. Neem op elk tijdstip (t0, 1 uur, 2 uur, 3 uur, 4 uur, 1, 3, 7, 10 en 14 dagen) elk rooster van de plaat en droog het af met schoon papier om het overtollige medium en gewicht op een weegschaal te verwijderen. Plaats het rooster terug in de plaat en vervolgens in de broedmachine om het experiment voort te zetten. Schat de zwellingsverhouding en degradatiesnelheid met behulp van de volgende formules:
      figure-protocol-2
      Waarbij Wt het gewicht is van de constructen op elk tijdstip en Wt0 het gewicht van de gedroogde constructen.
      figure-protocol-3
      Waarbij Wi het gewicht is aan het einde van de zwellingstest.

4. Bioprinting van SBMe-constructies

  1. Voorbereidende stappen
    1. Neem een steriele glazen spuit van 1 ml (TLL-aansluiting) en een steriel conisch mondstuk van 25 G en monteer ze onder de bioveiligheidskast. Doe ze in een steriele doos in de koelkast.
    2. Zet de pipetpunten en de injectieflacon met SBMe-matrix de dag voor het experiment een nacht in de koelkast (4 °C op ijs).
    3. Voeg 20 μL trypanblauw toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml.
    4. Zet de centrifuge op 345 × g, 4 °C en laat afkoelen (~3-4 uur).
    5. Doe 5 ml water in een centrifugebuis van 15 ml als balans voor de centrifuge.
    6. Warme fosfaatbufferoplossing (PBS) en media in een waterbad.
      OPMERKING: Celkweekmedium is gemaakt van volledig Dulbecco gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% Foetaal Runderserum (FBS), Penicilline-Streptomycine en L-glutamine.
    7. Plaats de bioprinter onder de biologische veiligheidskast. Steriliseer 20 minuten onder UV-licht.
      OPMERKING: Om de goede werking van de bioprinter te garanderen, voert u de Auto-home-functie uit en controleert u de juiste bewegingen van elke as en de werking van eindschakelaars.
  2. Bioink preparaat
    1. Neem de kolf in de couveuse met in de handel verkrijgbare prostaatkankercellen van muizen en plaats deze onder de bioveiligheidskast.
    2. Verwijder het celkweekmedium uit de kolf.
      OPMERKING: De in dit protocol gerapporteerde volumes zijn van toepassing op T25-celcultuurkolven.
    3. Was de cellen eenmaal met 2 ml PBS en zuig het vervolgens op.
    4. Voeg 500 μL trypsine toe en plaats de kolf gedurende 5 minuten in de incubator om de cellen van de plaat te laten loskomen.
    5. Controleer de cellen op trypsinisatie en tik zo nodig voorzichtig op de bodem van de kolf.
    6. Voeg 4,5 ml medium toe aan de kolf. Was de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle losgeraakte cellen in het celkweekmedium drijven.
    7. Zuig het medium op en voeg het toe aan een centrifugebuis van 15 ml.
    8. Neem een aliquot van 20 μL en meng deze met de trypan blue aliquot. Doe vervolgens 10 μL van dit mengsel in de celtelkamer om de levende cellen te tellen met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-4
      waarbij f de verdunningsfactor is voor trypan blue suspensie (verhouding 1:1); V is het volume van de celsuspensie [ml].
    9. Centrifugeer de resterende celsuspensie gedurende 5 minuten (345 × g, 4 °C).
    10. Verwijder het bovenstaande en resuspenseer in de koude SBMe-matrix bij de gewenste celdichtheid (106 cellen/ml)
    11. Zuig 800 μL van de matrixsuspensie met cellen op met de koude spuit.
    12. Verwijder de luchtbellen die mogelijk in de spuit vastzitten en doe deze in een steriele doos. Plaats het vervolgens 15 minuten in de broedmachine om het te laten geleren.
  3. Bioprintproces
    1. Neem de spuit uit de couveuse en plaats deze in de printkop van de bioprinter. Zorg ervoor dat de zuiger van de spuit goed in contact is met het duwblok.
      OPMERKING: Het model en het volume moeten hetzelfde zijn als de spuit die voor het experiment is gebruikt.
    2. Zet de bevestigingsplunjer van de spuit en de flens van de spuitcilinder vast met de zuigerhouders van de spuit en de cilinder van de spuit met de spuitklem.
    3. Gebruik M4-moeren aan de onderkant van de extruder om de veerdruk aan te passen en de spuit op zijn plaats te vergrendelen.
      OPMERKING: De stappen 4.3.1 tot en met 4.3.4 worden weergegeven in afbeelding 7.
    4. Kalibreer het systeem met behulp van de Auto-home-instelling in het bioprintermenu om automatisch de oorsprong van assen te detecteren.
      OPMERKING: Deze passage zorgt altijd voor de juiste initiële instellingen, onafhankelijk van het type ondersteuning dat we gebruiken voor het afdrukken.
    5. Plaats een 6-multiwell plaat op het drukvlak.
    6. Verplaats de extruder met behulp van de opdracht Assen verplaatsen totdat de punt van de naald de bodem van het putje raakt om Z0 handmatig te definiëren.
    7. Selecteer het gcode-bestand in de menuoptie van het bioprintermenu en begin met afdrukken. In elk putje wordt een vierkant raster van zes lagen (2,6 cm zijde) geprint.
    8. Gebruik na het bioprintproces een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat het printproces succesvol is verlopen en plaats de multiwell-plaat 2 minuten in de broedmachine om de SBMe na extrusie te laten bezinken.
    9. Doe 2 ml celkweekmedium in elk putje.
      OPMERKING: Het volume moet de constructies volledig bedekken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit artikel presenteren we een protocol voor bioprinting-constructies gemaakt van SBMe met behulp van een goedkope, op maat gemaakte, volumetrische bioprinter. Wij zorgen voor een uitgebreide beschrijving en 3D-printen*. STL-bestanden om het systeem te bouwen en we demonstreren het potentiële gebruik ervan in kankeronderzoek door enkel- en meerlaagse structuren te printen. Elk 3D-geprint onderdeel is vóór de montage op de juiste manier ontdaan van de draagstructuur of ongewenste print...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In translationeel onderzoek zijn SBM'en bijzonder waardevol in verschillende onderzoeksgebieden, van weefselmanipulatie tot het testen van geneesmiddelen 2,3. Ze zijn met name fundamenteel geworden in kankeronderzoek, omdat ze mechanische en biochemische kenmerken van de micro-omgeving van de tumor repliceren, waardoor modellen kunnen worden ontwikkeld die tumorgroei, metastase en behandelingsreacties beter weerspiegelen. SBMe is...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Accelerator Award n° A26815 getiteld: "Single-cell cancer evolution in the clinic", gefinancierd door een partnerschap tussen Cancer Research UK en Fondazione AIRC (n° 22790) en door de Europese Unie - Next Generation EU, Mission 4, Component 1, CUP D53D23003310006.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12-multiwell plateSigma-AldrichCLS351143
3D FDM printerFlashforgeAdventurer 5M Pro
3D printer MotherboardGEETECHGT2560 REV A+
6-multiwell plateSigma-AldrichM8687
AC socketHiLetgohttps://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket
-Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__
mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3%
95%C3%91&crid=2TRIBP34VJ61A
&dib=eyJ2IjoiMSJ9.zW6_VmeiudR
I4yMpjJqJm7OdeoctTKW2mrEzml
BAyJVa1hkM4PiJT3pLY0mXdxm1
AZQxa2_f5J4q4d5v3vUeqLkjJ6BM
kWHAoeEfbEQJNuZaQ3NjmUlqWy
_1AfQpnRp4VqJ2m3bkWsChztCa
Ok-ZdQJlobGxJaMKg7WbV352
Hyo.0tEw2GYoPQJ4SdNYXO1XM
Jrl2yXMvRey55Hj7GhISkk&dib_
tag=se&keywords=AC+socket+HiLetgo&nsdOpt
OutParam=true&qid=1734702097&sprefix=ac+
socket+hiletgo%2Caps%2C173&sr=8-1		15 A 250 V
Adjustable feetEXIN DEHCENhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&psc=1		Height 27-40 mm
Ball bearing 4 mmQUARKZMAN684ZZDimensions 4 x 9 x 4 mm
Ball bearing 5 mmXiKe625-2RSDimensions 5 x 16 x 5 mm
Belt closedTurmberg3Dhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&psc=1		Width 6 mm
Belt openFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&th=1		Width 6 mm
Bioprinting nozzleFisher Scientific17780789Corning Standard Conical Bioprinting Nozzles
Bürker Cell Counting chamberGLASWARENFABRIK KARL HECHT40443001
CentrifugeEppendorf5702 R
Centrifuge tubeSigma-AldrichCLS43147015 mL
Centrifuge tubeSigma-AldrichEP00301200861.5 mL
DisplaySigma-AldrichBR718905
DMEM Gibco Thermofisher11965092
FBSSigma-AldrichF7524
Flanged linear ball bearingSourcing maphttps://www.amazon.it/gp/product/
B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&psc=1		LMF8UU
Glass syringeFisher Scientific11520062Hamilton GasTight 1 mL (TLL terminal)
HingesYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
IncubatorFisher Scientific15481374Eppendorf Galaxy 48 R CO2 Incubator, 48 L, Stainless Steel
Inverted microscopeNikonEclipse Ti2-U
Jumper wiresIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
-54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/
B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_
mcx_views_0_image?pd_rd_w=cb2r
J&content-id=amzn1.sym.57a351cf-
ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209%3
Aamzn1.symc.ca948091-a64d-450e-
86d7-c161ca33337b&pf_rd_p=57a3
51cf-ba07-47e8-b302-aa2aa1a3f209
&pf_rd_r=YHY9RFYZJK7PYAY2RXX
D&pd_rd_wg=7WkXB&pd_rd_r=8239
66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f&
pd_rd_i=B07Q12B6K5&th=1
LCD unit

Referenties

  1. Patel, T., et al. Multicellular tumor spheroids: A convenient in vitro model for translational cancer research. Life Sci. 358, 123184(2024).
  2. Tanaka, M., et al. Emerging translational research in neurological and psychiatric diseases: From in vitro to in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (21), 15739(2023).
  3. De Maria Marchiano, R., et al. Translational research in the era of precision medicine: Where we are and where we Will Go. J Pers Med. 11 (3), 216(2021).
  4. Knowlton, S., et al. Bioprinting for cancer research. Trends Biotechnol. 33 (9), 504-513 (2015).
  5. McGranahan, N., et al. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  6. Van Zundert, I., et al. From 2D to 3D cancer cell models-The enigmas of drug delivery research. Nanomaterials. 10 (11), 2236(2020).
  7. Hoarau-Véchot, J., et al. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. Int J Mol Sci. 19 (1), 181(2018).
  8. Yamada, K. M., et al. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Manduca, N., et al. 3D cancer models: One step closer to in vitro human studies. Front Immunol. 14, 1175503(2023).
  10. Wang, L., et al. The 3D revolution in cancer discovery. Cancer Discov. 14 (4), 625-629 (2024).
  11. Benton, G., et al. Multiple uses of basement membrane-like matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with cancer cells. Int J Cancer. 128 (8), 1751-1757 (2011).
  12. Benton, G., et al. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  13. Rawal, P., et al. Prospects for 3D bioprinting of organoids. Bio-Design Manuf. 4 (3), 627-640 (2021).
  14. Hou, S., et al. Advanced development of primary pancreatic organoid tumor models for high-throughput phenotypic drug screening. SLAS Discov Adv Sci Drug Discov. 23 (6), 574-584 (2018).
  15. Kane, K. I. W., et al. Determination of the rheological properties of Matrigel for optimum seeding conditions in microfluidic cell cultures. AIP Adv. 8 (12), 125332(2018).
  16. De Stefano, P., et al. Bioprinting of Matrigel scaffolds for cancer research. Polymers. 13 (12), 2026(2021).
  17. Hatzikiriakos, S. G., et al. Role of slip and fracture in the oscillating flow of HDPE in a capillary. J Rheol. 36 (5), 845-884 (1992).
  18. Kalika, D. S., et al. Wall slip and extrudate distortion in linear low-density polyethylene. J Rheol. 31 (8), 815-834 (1987).
  19. Molenaar, J., et al. Modeling polymer melt-flow instabilities. J Rheol. 38 (1), 99-109 (1994).
  20. Valot, L., et al. Chemical insights into bioinks for 3D printing. Chem Soc Rev. 48 (15), 4049-4086 (2019).
  21. Sundaramurthi, D., et al. 3D bioprinting technology for regenerative medicine applications. Int J Bioprinting. 2 (2), 9-26 (2016).
  22. Maloney, E., et al. Immersion bioprinting of tumor organoids in multi-well plates for increasing chemotherapy screening throughput. Micromachines. 11 (2), 208(2020).
  23. Snyder, J. E., et al. Bioprinting cell-laden Matrigel for radioprotection study of liver by pro-drug conversion in a dual-tissue microfluidic chip. Biofabrication. 3 (3), 034112(2011).
  24. Patil, L. S., et al. Toward measuring the mechanical stresses exerted by branching embryonic airway epithelial explants in 3D matrices of Matrigel. Ann Biomed Eng. 50 (9), 1143-1157 (2022).
  25. Lai, V. K., et al. Swelling of collagen-hyaluronic acid co-gels: An in vitro residual stress model. Ann Biomed Eng. 44 (10), 2984-2993 (2016).
  26. Lam, N. T., et al. Fabrication of a Matrigel-collagen semi-interpenetrating scaffold for use in dynamic valve interstitial cell culture. Biomed Mater. 12 (4), 045013(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Volumetrisch bioprinten3D celkweekorgano de modellenvalidatie van bioprinterscelviabiliteitprintbaarheid van rasterskankeronderzoekweefseltechnologie
Ontwerp en validatie van een volumetrische extrusie bioprinter voor het bioprinten van oplosbaar basaalmembraanextract voor translationeel onderzoek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.