Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67791

⸱

7 februari 2025

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 3UAB Nathan Shock Center

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Samenvatting

Immunokleuring van de hersenen van Drosophila melanogaster is essentieel voor het onderzoeken van de mechanismen achter complex gedrag, neurale circuits en eiwitexpressiepatronen. Traditionele methoden brengen vaak uitdagingen met zich mee, zoals het uitvoeren van complexe dissectie, het behouden van de weefselintegriteit en het visualiseren van specifieke expressiepatronen tijdens beeldvorming met hoge resolutie. We presenteren een geoptimaliseerd protocol dat cryosectie combineert met fluorescentiekleuring en immunokleuring. Deze methode verbetert het behoud van weefsel en de helderheid van het signaal en vermindert de noodzaak van moeizame dissectie voor Drosophila-beeldvorming van de hersenen. De methode omvat snelle dissectie, optimale fixatie, cryoprotectie en cryosectie, gevolgd door fluorescerende kleuring en immunokleuring. Het protocol vermindert weefselbeschadiging aanzienlijk, verbetert de penetratie van antilichamen en levert scherpe, goed gedefinieerde beelden op. We tonen de effectiviteit van deze aanpak aan door specifieke neurale populaties en synaptische eiwitten met hoge getrouwheid te visualiseren. Deze veelzijdige methode maakt de analyse mogelijk van verschillende eiwitmarkers in het volwassen brein over meerdere z-vlakken en kan worden aangepast voor andere weefsels en modelorganismen. Het protocol biedt een betrouwbaar en efficiënt hulpmiddel voor onderzoekers die hoogwaardige immunohistochemie uitvoeren in Drosophila-neurobiologische studies. De gedetailleerde visualisatie van deze methode vergemakkelijkt een uitgebreide analyse van neuroanatomie, pathologie en eiwitlokalisatie, waardoor het bijzonder waardevol is voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Inleiding

Complex gedrag, variërend van sociale interacties1, zintuiglijke waarneming en verwerking2, leren3 tot beweging4, worden aangestuurd door de hersenen. Neurologische aandoeningen komen ook steeds vaker voor en zullen naar verwachting met de tijd toenemen 5,6. Het is van cruciaal belang om te bestuderen hoe de hersenen werken bij zowel gezondheid als ziekte. Het centrale dogma van de moleculaire biologie suggereert dat een van de belangrijkste functies van biologischeeenheden eiwitten 7 zijn, en zowel hoeveel als waar ze tot expressie komen, zijn van cruciaal belang om te begrijpen hoe de hersenen werken.

Drosophila melanogaster, algemeen bekend als de fruitvlieg, is een zeer waardevol model voor het bestuderen van de hersenfunctie onder veroudering en pathofysiologische omstandigheden8. De beschikbaarheid van geavanceerde genetische hulpmiddelen in Drosophila stelt onderzoekers in staat om de functie van bijna elk eiwitte onderzoeken 9, met uitgebreide genetische bibliotheken voor bijna elk gen die gemakkelijk toegankelijk zijn10. In combinatie met zijn korte levensduur en hoge voortplantingssnelheid maken deze eigenschappen Drosophila tot een uitzonderlijk model voor hersenonderzoek11. Dit heeft geleid tot belangrijke prestaties, waaronder het ontwikkelen van een complete hersenkaart van de vlieg12, en heeft zelfs bijgedragen aan een Nobelprijs voor het ophelderen van de neuronale mechanismen van circadiane ritmes en moleculaire klokken 13,14,15. Als gevolg hiervan blijft Drosophila een krachtig en veelzijdig systeem, dat ons begrip van de hersenfunctie bevordert en ongekende inzichten biedt in neurologische processen.

Immunohistochemie en immunofluorescentie zijn fundamentele hulpmiddelen om eiwitexpressie in situ te bestuderen.In tegenstelling tot technieken zoals Western Blot, die alleen semikwantitatieve analyse mogelijk maakt en meestal wordt uitgevoerd in bulkweefsel16, of gecompliceerde en dure technieken zoals massaspectrometrie om eiwitniveau17 te meten, is immunohistochemie relatief eenvoudig en maakt het zowel de kwantificering van eiwitexpressie als het meten van de lokalisatie van een eiwit in een weefsel of cel mogelijk. Belangrijk is dat fluorescerende immunohistochemie ook kan worden gemultiplext om meerdere eiwitten te meten om specifieke celtypen en weefsels te identificeren of om meerdere vragen in hetzelfde weefsel te beantwoorden. Bovendien kan weefselfixatie vergelijkingen mogelijk maken tussen verschillende experimentele omstandigheden, genotypen, leeftijden en circadiane tijdstippen. Fluorescerende immunohistochemie kan echter een uitdaging zijn en veel factoren kunnen de beeldkwaliteit beïnvloeden. Dit geoptimaliseerde cryosectie- en immunokleuringsprotocol voor Drosophila-hersenen heeft tot doel de beeldvorming met hoge resolutie te verbeteren door weefselbehoud, antilichaampenetratie en visualisatie van neurale populaties en eiwitmarkers te verbeteren. Ontwikkeld om uitdagingen in traditionele methoden aan te pakken, zoals complexe dissectie, weefselbeschadiging en beperkte beeldvormingsresolutie in verband met reeksen van het hele brein18. Dit protocol combineert cryosectie met fluorescentiekleuring om structurele integriteit en scherpe beeldvorming over meerdere z-vlakken te garanderen. Vergeleken met preparaten op de hele stapel minimaliseert deze methode vervorming, vergemakkelijkt het een diepere diffusie van antilichamen en biedt het duidelijke neuroanatomische en eiwitlokalisatieanalyses18. Zijn veelzijdigheid maakt aanpassing aan andere weefsels en modelorganismen mogelijk en biedt een betrouwbaar en efficiënt hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek19,20. Het kan worden aangepast om naar bijna elk eiwit te kijken en worden toegepast om elke aandoening, ziekte of model te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van apparatuur

  1. Zorg ervoor dat de cryostaat is ingeschakeld en is ingesteld op -20 °C. Schakel de glijbaanverwarmer of een kleine couveuse in en zorg ervoor dat deze op 37 °C is ingesteld.
    OPMERKING: In dit stadium kunnen gelabelde dia's op de verwarmer of broedmachine worden geplaatst en voor onbepaalde tijd worden gelaten totdat ze in secties worden geplaatst.

2. Bereiding van oplossingen

  1. Bereid 50 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, uit 10x PBS-voorraad. Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde in PBS met een eindvolume van 10 ml.
  2. Bereid een reinigingsoplossing van 70% ethanol in water in een spuitfles. Bereid een blokkerende oplossing (3% runderserumalbumine (BSA) in Tris-gebufferde zoutoplossing uit 20x bouillon). Bereid een primaire antilichaamoplossing (verdunning is afhankelijk van het experiment). Hier wordt een verdunning van 1:250 van ApoE Mouse Antibody in 3% BSA in TBS gebruikt.
  3. Bereid een secundaire antilichaamoplossing (verdunning is afhankelijk van het experiment). Hier wordt een verdunning van 1:500 van Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary in 3% BSA bij TBS gebruikt.
  4. Bereid fluorescerende vlekoplossing (verdunning is afhankelijk van het experiment). Hier wordt een 5 μg/ml oplossing van Nijlrood in PBS bereid.
    OPMERKING: Alle oplossingen, met name fluorescerende stoffen, moeten gekoeld worden bewaard en in een donkere gekoelde container worden bewaard. Ze moeten ook vlak voor gebruik op kamertemperatuur worden gebracht.

3. Afname van weefsel

  1. Na het verkrijgen van vliegen in verouderingsflesjes, opent u de klep op de CO2 -mat en dumpt u de vliegen snel op de mat om ontsnapping te voorkomen. Wacht tot de vliegen grotendeels bewusteloos raken en stoppen met bewegen. Plaats vliegen onder de SZ61-microscoop door de mat onder de objectieflens te verplaatsen. Pas de vergroting en focus zo aan dat de vliegen duidelijk zichtbaar zijn en comfortabel kunnen worden onthoofd.
    OPMERKING: De vliegen die voor dit voorbeeld worden gebruikt, zijn ELAV/+ en ELAV>ApoE4
  2. Steek een veerschaar tussen de thorax en de kop, knijp stevig in en onthoofd 5 tot 10 vliegenkoppen per experimentele groep. Breng ongebruikte vliegen terug naar hun ouder wordende flesje.
    OPMERKING: Als er bezorgdheid bestaat over de penetratie van het fixeermiddel, kan een kleine incisie worden gemaakt op de achterkant van het hoofd om een verhoogde penetratie van het fixeermiddel mogelijk te maken in stap 4.1.
  3. Plaats met een borstel voorzichtig de koppen in gelabelde tubes van 1,5 ml op ijs totdat de groepen ELAV/+ en ELAV>ApoE4 zijn verzameld.

4. Fixatie van heel weefsel

  1. Verwijder de buisjes van ijs en pipetteer 100 μL 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing in elke buis, zorg ervoor dat alle koppen in de oplossing worden ondergedompeld. Als de koppen aan de wanden van de buis blijven plakken en contact met de oplossing vermijden, gebruik dan een borstel om ze voorzichtig naar beneden te duwen of tik lichtjes tegen een horizontaal oppervlak om goed contact te garanderen.
  2. Plaats op een orbitale schudder op een gemiddelde stand gedurende 15 minuten. Gooi na 15 minuten de paraformaldehyde-oplossing weg en vervang deze gedurende 10 minuten door 1x PBS, zorg ervoor dat alle koppen in de oplossing zijn ondergedompeld.
  3. Gooi de vorige oplossing elke keer weg en was de tissue 2x met PBS gedurende 10 minuten elk, voor een totaal van 3 wasbeurten.
  4. Breng na de laatste wasbeurt de koppen over naar een 10% sucrose in PBS-oplossing en zorg ervoor dat de koppen in de buis worden ondergedompeld. Laat deze een nacht staan voor een optimale verzadiging.
    OPMERKING: Als beeldvorming op dezelfde dag gewenst is, kan de sucrose-infusie worden verminderd; De effecten van cryoprotectieve middelen zullen echter ook evenredig worden verminderd.

5. Voorbereiding van de mal

  1. Vul een gelabelde mal voor ongeveer 50% met een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding, zodat deze zich naar alle 4 de hoeken van de mal kan verspreiden.
  2. Plaats met een borstel de koppen voorzichtig op het oppervlak van de OCT in de vorm. Wanneer u meerdere experimentele groepen in dezelfde mal plaatst, zorg er dan voor dat deze groepen in de mal worden gescheiden om verwarring te voorkomen.
    OPMERKING: Het is belangrijk om verdunning van de OCT-verbinding door verontreiniging met de eerdere sucrose-oplossing via de borstel te voorkomen. Bovendien kan plaatsing diep in de OCT met behulp van de borstel veel luchtbellen rond de koppen veroorzaken. Vermijd deze fouten om later doorsnijdingsproblemen te voorkomen.
  3. Duw met de punt van de tang langzaam elke kop naar de bodem van de mal met de ogen naar de bodem gericht. Deze oriëntatie is geselecteerd voor een snede door het coronale vlak.
  4. Vermijd het doorboren of pletten van de koppen tegen de bodem van de mal tijdens dit proces. Lijn alle koppen in de X-, Y- en Z-dimensies uit, zodat elke sectie alle onderwerpen tegelijk bevat. Zorg voor langzame onderdompeling om de vorming van luchtbellen te verminderen.
  5. Zodra alle koppen goed zijn uitgelijnd, plaatst u de mallen voorzichtig direct in -20 °C om te bevriezen.
    OPMERKING: Als wordt opgemerkt dat de uitlijning van de koppen aanzienlijk afwijkt tijdens het snijden, overweeg dan het gebruik van droogijs of vloeibare stikstof voor het eerste snelle bevriezen van de vorm.
  6. Zodra de vorm grotendeels bevroren is, vul je de rest met OCT en laat je het bevriezen voordat je het voor langere tijd opbergt bij -80 °C.

6. Cryosecties van mallen

OPMERKING: Het is over het algemeen raadzaam om een blanco vorm voor te bereiden en te snijden voordat u experimentele groepsvormen snijdt. Dit maakt het mogelijk om de juiste functionaliteit van het wiel, het mes en het anti-rolglas te garanderen onmiddellijk voordat het weefsel wordt gesneden.

  1. Bevestig de boorkop aan de mal door een royale hoeveelheid OCT op de mal aan te brengen en het bit erop te plaatsen en plat te drukken. Laat dit volledig bevriezen in de cryostaat, meestal binnen 5 minuten.
  2. Maak het bit en het OCT-blok los van de mal en plaats het in de boorkop, waarbij u ervoor zorgt dat de mal van boven naar beneden goed georiënteerd blijft. Draai de boorkopsleutel vast totdat het bit goed vastzit.
  3. Lijn het blok uit met het zaagblad met behulp van de instelknoppen en diepteregelaars van de boorkop.
  4. Stel de sectiebreedte in op 20 μm. Snijd elk plakje met langzame maar consistente bewegingen, zodat het anti-rolglas elk plakje kan opvangen. Leg secties vast met behulp van de verwarmde dia's door de dia aan te raken tegen de dichtstbijzijnde rand van de sectie en de sectie op de dia te laten stijgen. Er kunnen maximaal acht secties op een dia van standaardformaat (25 mm x 75 mm x 1 mm) worden geplaatst wanneer deze op de juiste afstand van elkaar wordt geplaatst.
    OPMERKING: Er is een kwestie van keuze te maken bij het kiezen van welke secties te verzamelen. Als gevolg van de inbeddingsoriëntatie zullen eerdere secties van de voorkant zijn en latere secties van de achterste delen van het hoofd. Als de interesse dus meer in het ene gebied ligt dan in het andere, kan de sectieselectie dienovereenkomstig worden aangepast. Als alternatief kunnen alle secties op meerdere objectglaasjes worden verzameld totdat er geen weefsel meer over is.
  5. Laat de glaasjes minimaal 30 minuten maar niet langer dan 1 uur bij kamertemperatuur drogen.

7. Kleuring en IHC

OPMERKING: Voor dit protocol zal de methode IHC beschrijven met behulp van een ongeconjugeerd primair antilichaam. Fluorchroom geconjugeerde antilichamen of andere fluorescentiekleuringen die in een enkele fase kunnen worden uitgevoerd, moeten samen met het secundaire antilichaam worden gebruikt als beide samen moeten worden gebruikt.

  1. Verwijder onmiddellijk na de droogperiode OCT aan de randen van de objectglaasje met een scheermesje, zodat er ruimte overblijft voor een hydrofobe rand. Teken een hydrofobe rand op elke dia met behulp van de stift. Laat dit 5 minuten drogen.
  2. Was alle objectglaasjes 3 keer gedurende 5 minuten met PBS door voorzichtig op het objectglaasje te pipetteren, vermijd indien mogelijk pipetteren direct op het tissue.
    OPMERKING: De pipet van 1000 μL is hier het nuttigst. Een objectglaasje van standaardformaat met tissue moet volledig bedekt zijn met 750 μl van een oplossing. Schuifrekken en emmers kunnen ook worden gebruikt.
  3. Nadat de objectglaasjes zijn gewassen, pipetteert u 3% BSA in TBS-blokkeringsoplossing op de objectglaasjes. Laat 30 minuten incuberen.
  4. Gooi de blokkeeroplossing weg en pipetteer de primaire antilichaamoplossing op de objectglaasjes. In dit geval een verdunning van 1:250 van SC-13521 ApoE in 3% BSA in TBS. Laat het antilichaam een nacht incuberen bij 4 °C of gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik natte tissuedoekjes of papieren handdoeken om te voorkomen dat de oplossing 's nachts uitdroogt.
  5. Gooi het primaire antilichaam weg en was met behulp van de pipet 3 keer gedurende 5 minuten met PBS.
  6. Voeg de secundaire antilichaamoplossing toe. In dit geval een verdunning van 1:500 van AF 750 Goat Anti-Mouse naast een concentratie van 5 μg/ml Nijlrood, alles in 3% BSA in TBS. Laat dit 1 uur incuberen bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: We incuberen tegelijkertijd een fluorescerende kleuring en een secundair antilichaam in dezelfde buffer, 3% BSA in TBS. Dit heeft de voorkeur zolang er geen conflicten bekend zijn tussen de twee reagentia. Als er conflicten bestaan, broed dan apart uit en voer nog eens 3 wasbeurten uit tussen de incubaties.
  7. Was de dia's 3 keer met PBS gedurende 5 minuten elk. Laat na de laatste wasbeurt een kleine hoeveelheid PBS op de dia liggen.

8. Montage en voorbereiding voor beeldvorming

  1. Voeg met behulp van een pipet van 1000 μl 3-5 druppels uithardende montagemedia met DAPI (0,9 μg/ml) gelijkmatig toe over het objectglaasje en vermijd direct druppelen op het weefsel.
  2. Plaats het dekglaasje op de dia en vermijd de vorming van luchtbellen.
    OPMERKING: Het gebruik van een tang kan hierbij helpen door het dekglaasje dicht bij het oppervlak van de dia te laten glijden voordat het uiteindelijk wordt losgelaten.
  3. Ga voorzichtig om met pas gemonteerde dia's en bewaar ze plat tot ze volledig droog zijn. Sluit dia's af met nagellak als langdurige opslag wordt verwacht.
  4. Maak zo snel mogelijk foto's om fluorescerend verval te voorkomen.

9. Beeldacquisitie

OPMERKING: Voor het vastleggen van foto's wordt het gebruik van Olympus Cell Sense Dimensions-software gedetailleerd beschreven.

  1. Inspecteer vóór het maken van de beeldvorming objectglaasjes en veeg ze af met 70% ethanol in wateroplossing. Als dia's onmiddellijk na de montage worden afgebeeld, wees dan extra voorzichtig bij het schoonmaken om te voorkomen dat het dekglaasje wordt verstoord. Laat de oppervlakken van het glaasje en het dekglaasje 5 minuten drogen voordat u het beeldmateriaal maakt.
  2. Selecteer elk gewenst kanaal om vast te leggen, in dit geval de kanalen voor DAPI, Nile Red en AF 750.
    1. Selecteer de gewenste vergroting zoals hieronder beschreven. De keuze van de vergroting is afhankelijk van het experiment; Gebruik hier een vergroting van 10x.
      OPMERKING: Alle vergrotingen zijn bruikbaar, inclusief lenzen op oliebasis. Breng desgewenst onderdompelingsolie aan op het oppervlak van de dia.
    2. Kalibreer voor elk kanaal de juiste belichtingstijden op basis van de helderste fluorescerende onderwerpen in een experiment. Vermijd overbelichting bij het genereren van een zo helder mogelijk beeld.
      OPMERKING: Over het algemeen zijn de twee belangrijkste determinanten van een slechte procesopname overbelichting, wat resulteert in verlies van definitie, en te veel achtergrondsignaal, dat moeilijk te scheiden is van het echte signaal. Bovendien moeten de belichtingen onafhankelijk worden ingesteld voor elke unieke vergroting die wordt gebruikt.
    3. Selecteer de map die u wilt opslaan en geef de samengevoegde afbeeldingen een naam in het menu. Na het vastleggen bevinden alle afbeeldingen zich in deze map en dragen ze de naam die hier is gedefinieerd.
    4. Leg foto's vast door eerst scherp te stellen op een onderwerp in het kanaal dat het beste brandpunt biedt en begin vervolgens met verzamelen. Handhaaf de procedure om op elk onderwerp in hetzelfde kanaal te focussen voor consistentie in het hele experiment.
    5. Leg alle experimentele groepen vast die worden gebruikt voor latere vergelijkingen op dezelfde dag om fluorescerend verval tussen vergeleken groepen te voorkomen.

10. Kwantificering

OPMERKING: Kwantificering kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende software. Hier wordt verwezen naar het gebruik van Olympus CellSense Dimensions.

  1. Bekijk na de collectie de afbeeldingen. Verwijder secties met onvolkomenheden of doorsnede-artefacten uit de kwantificeringsmap. Selecteer afbeeldingen die het doel van kwantificering weerspiegelen. Voorbeelden van onvolkomenheden zijn luchtbellen, gescheurde delen, overlappend weefsel en stof of vuil.
    1. Om de juiste afbeeldingen te selecteren, moet u ervoor zorgen dat alle afbeeldingen met hersenweefsel worden gebruikt voor kwantificering om de algehele expressie in de hersenen weer te geven. U kunt ook afbeeldingen gebruiken die alleen de voor-, midden- of achterhersenen weerspiegelen om inzicht te geven in verschillen in expressie in deze gebieden.
  2. Bepaal binnen de menu's tellen en meten de parameters die van belang zijn en hun grenzen voor de kwantificering van afbeeldingen.
    1. Voor kwantificering van ApoE-expressie door vergelijking van gemiddelde intensiteitswaarden, selecteert u drempelwaarden zodat alle pixels voor dat kanaal worden beschouwd (0-oneindig). Geef daarnaast een overzicht van interessegebieden met behulp van de beschikbare tekengereedschappen.
  3. Voer de telling uit en meet in een batch voor alle bestanden of afzonderlijk op elke afbeelding.
    1. Noteer voor batchverwerking de instellingen en uitvoering van de kwantificering en selecteer vervolgens de map om de kwantificering uit te voeren. Verwerking in een batch is toegankelijk via het tabblad Macrobeheer en versnelt de workflow aanzienlijk.
  4. Exporteer de gegevenstabel naar een werkblad om te plotten. Gebruik hiervoor het menu Resultaten tellen en meten terwijl u automatisch een tabel opent of exporteert wanneer u in een batch presteert. Deze gegevenstabellen bevatten alle geselecteerde parameters die in stap 10.2 zijn gekozen.
  5. Voor statistische analyse en plotten kunt u gegevens uitzetten met behulp van een spreadsheet rechtstreeks of via andere software. Bekendheid met de gekozen software is de sleutel tot het genereren van een nauwkeurige weergave van de experimentele resultaten. Hier werden absolute intensiteitswaarden van ApoE-expressie in de hersenen van de mutant genormaliseerd naar de controle en vervolgens uitgezet met behulp van GraphPad Prism.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hierboven beschreven methode maakt fluorescentiebeeldvorming van volwassen vliegenhersenen mogelijk, betrouwbaar en zonder vervelende dissectie. Eenvoudig geïllustreerd in figuur 1, is de methode eenvoudig en kan deze snel worden uitgevoerd als alle monsters, apparatuur en materialen direct beschikbaar zijn. Als alternatief kunnen monsters worden bewaard voor gebruik vele weken later door gebruik te maken van -80 °C tijden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier presenteren we een protocol voor nauwkeurige fluorescerende beeldvorming van gecryossectioneerde Drosophila-koppen . Dit is een eenvoudige aanpak die een aantal belangrijke positieve punten heeft. De methoden zijn namelijk eenvoudig genoeg dat iedereen met een basisopleiding in laboratoriumveiligheid zou kunnen volgen, ze zijn aanpasbaar om de expressie te meten van elk eiwit waarvoor hoogwaardige antilichamen bestaan, en ze maken het mogelijk om nauwkeurig te meten hoeveel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de leden van het Melkani-lab voor hun hulp met waardevolle feedback voor het ontwikkelen van het protocol. Vliegkolven, Elav-Gal4 (BL#458) en UAS-ApoE4 (BL#76607) werden verkregen van Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, VS). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) AG065992 en RF1NS133378 aan G.C.M. Dit werk wordt ook ondersteund door UAB Startup-fondsen 3123226 en 3123227 aan G.C.M.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1000 uL PipetteEppendorf3123000063
1000 uL Pipette TipsOlympus Plastics23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)FisherJ62036.K7ph=7.4
200 Proof EthanolDecon Laboratories64-17-5
20X Tris Buffered SalineThermo ScientificJ60877.K2pH=7.4
AF750 Goat Anti-Mouse Secondary AntibodyAlexa FluorA21037
Anti-Roll GlassIMEBAR-14047742497
ApoE Mouse Primary AntibodySanta CruzSC13521
Bovine Serum AlbuminFisher9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mLFisher05-408-129
Charged SlidesGlobe Scientific1415-15
Cryosectioning MoldsFisher2363553
CryostatLeicaCM 3050 S
Cryostat BladesC.L. SturkeyDT554N50
Distilled Water
Dry Ice??????
Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Fly PadTritech ResearchMINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with DapiVectashieldH-1800
KimwipesKimtech34120
MicroscopeOlympusSZ61
Nile Red SigmaN3013
Optimal Cutting Temperature CompoundFisher4585
Orbital ShakerOHAUSSHLD0415DG
Paraformaldehyde 20%Electron Microscopy Sciences15713
Razor BladesGravey#40475
Spring ScissorsFine Science Tools15000-10
SucroseFisherS5-500

Referenties

  1. Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
  2. Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Neurosci. 22, 657-673 (2021).
  3. Roozendaal, B., McEwen, B. S., Chattarji, S. Stress, memory and the amygdala. Nat Rev Neurosci. 10, 423-433 (2009).
  4. Arber, S., Costa, R. M. Networking brainstem and basal ganglia circuits for movement. Nat Rev Neurosci. 23, 342-360 (2022).
  5. GBD 2019 Dementia Forecasting Collaborators. Estimation of the global prevalence of dementia in 2019 and forecasted prevalence in 2050: an analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Public Health. 7, e105-e125 (2022).
  6. Huang, Y., Li, Y., Pan, H., Han, L. Global, regional, and national burden of neurological disorders in 204 countries and territories worldwide. J Glob Health. 13, 04160(2023).
  7. Crick, F. Central dogma of molecular biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  8. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, 235-244 (2016).
  9. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the Fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201, 815-842 (2015).
  10. Larkin, A., et al. FlyBase: updates to the Drosophila melanogaster knowledge base. Nucleic Acids Res. 49, D899-D907 (2021).
  11. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. Int J Mol Sci. 10, 407-440 (2009).
  12. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379, eadd9330(2023).
  13. Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312, 752-754 (1984).
  14. Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39, 369-376 (1984).
  15. Huang, R. C. The discoveries of molecular mechanisms for the circadian rhythm: The 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biomed J. 41, 5-8 (2018).
  16. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4, 429-434 (2012).
  17. Ong, S. E., Foster, L. J., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 (2003).
  18. Behnke, J. A., Ye, C., Moberg, K. H., Zheng, J. Q. A protocol to detect neurodegeneration in Drosophila melanogaster whole-brain mounts using advanced microscopy. STAR Protoc. 2, 100689(2021).
  19. Moraes, R. C. M., et al. Apolipoprotein E induces lipid accumulation through Dgat2 that is prevented with time-restricted feeding in Drosophila. Genes. 15 (11), 1376(2024).
  20. Roth, J. R., et al. Rapamycin reduces neuronal mutant huntingtin aggregation and ameliorates locomotor performance in Drosophila. Front Aging Neurosci. 15, 1223911(2023).
  21. Currier, T. A., Pang, M. M., Clandinin, T. R. Visual processing in the fly, from photoreceptors to behavior. Genetics. 224, (2023).
  22. McKellar, C. E., Siwanowicz, I., Dickson, B. J., Simpson, J. H. Controlling motor neurons of every muscle for fly proboscis reaching. Elife. 9, (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Immunokleuring van het Drosophila breinProtocol voor cryosectiePreservatie van breinweefselBeeldvorming van neurale circuitsProte nelokalisatieAntilichaampenetratieOCT inbeddingConfocale beeldvormingNeuroanatomische analyse
Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.