Methodenartikel

Steekwondmuismodel voor het bestuderen van bloedingen en ontstekingen bij traumatisch hersenletsel

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67797

⸱

21 februari 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

In dit artikel

Samenvatting

Vereenvoudigde modellen voor traumatisch hersenletsel (TBI) hebben de ontwikkeling van therapeutische benaderingen vergemakkelijkt. Dit protocol schetst de aanmaak van een niersteekwond muiscortex met behulp van naalden, waardoor bloedingen en ontstekingen kunnen worden geanalyseerd. Het steekwond TBI-muismodel biedt het voordeel dat het kan worden uitgevoerd zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is.

Samenvatting

Traumatisch hersenletsel (TBI) is het gevolg van fysieke schade, vaak veroorzaakt door ongevallen of sportgerelateerde incidenten. De oorzaken van TBI zijn divers, waaronder hersenschudding, hersenkneuzingen, hematomen en schedelbreuken. Om deze verschillende oorzaken te repliceren, zijn verschillende TBI-muismodellen ontwikkeld met behulp van verschillende protocollen. Lichamelijk hersenletsel leidt tot zowel primair als secundair hersenletsel, wat het verlies van neuronen verergert. Primair letsel treedt onmiddellijk na de schade op, vaak als gevolg van een bloeding, en veroorzaakt vervolgens secundair letsel, waaronder ontsteking rond de laesie. Het ontwikkelen van een TBI-model dat geschikt is voor het beoordelen van de uitbreiding van bloedingen en de ernst van de ontsteking is daarom cruciaal. Dit protocol introduceert een methode voor het nabootsen van penetrerend hersenletsel, het zogenaamde steekwond-TBI-muismodel, om mechanismen van bloeding, ontsteking en neuronaal verlies geassocieerd met TBI-pathologie te bestuderen. Dit model is gemaakt door de schedel en hersenen met naalden te doorboren en is eenvoudig uit te voeren zonder dat er gespecialiseerde experimentele apparatuur nodig is. Bovendien heeft de lichte verwonding die met een naald aan de hersenschors van de muis is toegebracht, geen invloed op het gedrag van het dier na de operatie. Deze functie stelt onderzoekers in staat om de gelokaliseerde effecten van hersenletsel te bestuderen zonder zich zorgen te hoeven maken over bredere gedragsgevolgen. Voorbeeldgegevens van door een steek gewonde hersenschorsingen van muizen tonen de effectiviteit van het model aan bij het beoordelen van bloedlekkage in het parenchym, gliale activering en inflammatoire cytokineproductie. Bovendien vergemakkelijkt dit protocol de evaluatie van bloedstollingsmiddelen en ontstekingsremmende stoffen, wat helpt bij de ontwikkeling van therapeutische middelen voor TBI.

Inleiding

Traumatisch hersenletsel (TBI) wordt veroorzaakt door fysieke schade, vaak als gevolg van ongevallen, waaronder verkeersongevallen en valongevallen. TBI wordt ingedeeld in twee soorten: penetrerend hersenletsel, dat optreedt wanneer een scherp voorwerp zowel de schedel als de hersenen perforeert, en gesloten hersenletsel, dat wordt veroorzaakt door gewelddadig schudden van de hersenen binnenin zonder een breuk in de schedel1.

De oorzaken van TBI zijn zeer divers, waaronder hersenschudding, hersenkneuzingen, hematomen en schedelbreuken; daarom zijn TBI-muismodellen ontwikkeld met behulp van verschillende protocollen om deze verschillende oorzaken te repliceren. Een repetitief hersenschudding TBI-model omvat bijvoorbeeld hersenschudding, waarbij muizen meerdere keren vastzitten met behulp van een elektromagnetisch gestuurde rubberen impactor2. Bovendien wordt in het TBI-model met gewichtsval een sterke externe kracht op het hoofd uitgeoefend door een gestandaardiseerd apparaat voor het afvallen van gewicht, waardoor focaal stomp letsel ontstaat met een intacte schedel3. Verder wordt het TBI-model met steekwond bereid door de schedel en hersenen te doorboren met een naald4 (Figuur 1A). Aangezien er verschillende TBI-modellen zijn ontwikkeld, is het belangrijk om een model te kiezen op basis van de specifieke pathologie die moet worden geobserveerd.

Hersenletsel veroorzaakt door fysieke schade leidt tot primair en secundair hersenletsel, wat het neuronale verlies verder verergert. Primair letsel treedt onmiddellijk na de schade op als gevolg van de afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB), bloeding en hematoom. Daarom is het minimaliseren van bloedingen en hematoomuitbreiding cruciaal, omdat deze factoren de ernst van TBI-symptomen kunnen verergeren. Secundair letsel wordt veroorzaakt door intraparenchymale bloedcomponenten, die vervolgens leiden tot ontsteking rond de laesie5. De prognose na hersenletsel is afhankelijk van de ontstekingsdynamiek; Daarom is het van cruciaal belang om zowel primaire als secundaire verwondingen snel te verminderen voor een gunstige prognose 6,7,8.

De BBB is samengesteld uit pericyten, nauwe verbindingen tussen endotheelcellen en de uiteinden van astrocyten, die samenwerken om het lekken van stoffen uit de bloedvaten in gezonde hersenen te beperken9. In het gepresenteerde steekwondsysteem is de BBB fysiek verstoord. Veelgebruikte methoden voor het evalueren van de BBB-integriteit zijn onder meer kleuring voor immunoglobuline G (IgG) en het beoordelen van de lekkage van fluorescentietracers, zoals Evans blue en dextran10,11. IgG-kleuring labelt bloedcomponenten die uit de laesieplaats lekken en zich in de hersenen afzetten. Naarmate de BBB herstelt, neemt het lekken van bloedcomponenten in de hersenen af en worden deze afzettingen geleidelijk afgebroken. Daarom wordt IgG-kleuring gebruikt om de mate van BBB-herstel na hersenletsel te beoordelen. Bovendien weerspiegelt de mate van lekkage van intraveneus toegediende tracer in het hersenparenchym het herstel van BBB. Deze methode zorgt voor een duidelijkere evaluatie van de BBB-dynamiek, aangezien tracerlekkage direct de overgang van bloedcomponenten van de bloedbaan naar het hersenparenchym aangeeft. Bovendien leidt het minimaliseren van de bloeding tot een mildere primaire verwonding, die wordt ondersteund door snelle bloedstolling en tijdige fibrinolyse. Daarom is het kwantificeren van de expressie van bloedstollings- en fibrinolyseregulatoren een effectieve manier om dit proces te analyseren. Wat betreft het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan coagulatie, wordt bloeding na hersenletsel gestopt door fibrinevorming. Vervolgens wordt de fibrinerijke trombus afgebroken door weefselplasminogeenactivator (tPA) en urokinaseplasminogeenactivator (uPA). In het steekwond-TBI-muismodel piekt de fibrinevorming 1 dag na het letsel en neemt daarna af10. Het herstelniveau van de BBB kan dus worden voorspeld door bloedcomponenten en tracerextravasatie in het hersenparenchym te kwantificeren, evenals de expressie van bloedstollingsfactoren.

Kwantificeringsmethoden voor ontsteking in het secundaire letselproces omvatten gliale activering en inflammatoire cytokine-expressie. Langdurige ontsteking wordt voornamelijk veroorzaakt door overmatige accumulatie van microglia en astrocyten rond de plaats van de laesie. In een TBI-model met steekwond stimuleren steekwonden bijvoorbeeld de reactivering van gliacellen rond de laesie om het celresten en de bloedcomponenten te verwijderen. Deze gliale reactivering piekt meestal 3 dagen na de steekwond12,13. Naast hun fagocytosefunctie scheiden gereactiveerde gliacellen overmatige inflammatoire cytokines af, wat resulteert in neuronaal verlies rond de laesie14. Er is gemeld dat de verzwakking van gliaontsteking bijdraagt aan een gunstige prognose na hersenletsel12,14. Het bepalen van het ontstekingsniveau is nuttig voor het evalueren van de ernst en prognose. Daarom is het essentieel om een TBI-model te ontwikkelen dat geschikt is voor het beoordelen van de uitbreiding van bloedingen en de ernst van ontstekingen. Deze studie introduceert een muismodel met steekwond dat penetrerend hersenletsel nabootst, met als doel de mechanismen van bloeding, ontsteking en neuronaal verlies bij TBI-pathologie te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle protocollen voor dierenverzorging zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Ochanomizu University, Japan, en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn opgesteld door het ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Cultuur in Japan. Zes weken oude volwassen C57BL/6J vrouwelijke muizen (20-25 g) werden gebruikt. Alle muizen kregen ad libitum toegang tot voedsel en water in een schone omgeving. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Steekwondoperatie aan de hersenschors

  1. Bereiding van reagentia
    OPMERKING: Het anesthesieprotocol is vergelijkbaar met het eerder beschreven15. Als de dierenkliniek een specifieke verdoving aanbeveelt, volg dan hun instructies op. Het is eerder bevestigd dat pentobarbital-natrium effectief is voor steekwondchirurgie in de hersenschors 4,13,16,17.
    1. Combinatie-anestheticum MMB: Los 1,875 ml 1 mg/ml medetomidine, 2,0 ml 5 mg/ml midazolam en 2,5 ml 5 mg/ml butorfanoltartraat op in 18,625 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een totaal volume van 25 ml te creëren. Dit mengsel heeft een concentratie van 75 mg/l medetomidine, 400 mg/l midazolam en 500 mg/l butorfanoltartraatmengsel. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 8 weken voor gebruik.
    2. Anesthesie-antagonist: Los 150 μl 5 mg/ml atipamezolhydrochloride op in 9,85 ml PBS om een totaal volume van 10 ml te creëren, met een concentratie van 75 mg/l atipamezolhydrochloride. Bewaren bij 4 °C, beschermd tegen licht, tot 8 weken voor gebruik.
  2. Chirurgische ingreep
    1. Anesthesie bij muizen: Verdoof de muizen tijdelijk met een in isofluraaninhalatieoplossing gedrenkt papier totdat ze in slaap vallen. Injecteer vervolgens 10 μL/g combinatie-anestheticum MMB intraperitoneaal met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 27 G x 3/4". Bevestig na 3-5 minuten de effectiviteit van de anesthesie door een teenknijp uit te voeren en de oprichtreflex te controleren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u er goed op let dat u geen overdosis anesthesie geeft bij het gebruik van isofluraan inhalatieoplossing.
    2. Leg de muis op de buikzijde in een papieren handdoek. Controleer na de overdracht opnieuw of de muis nog steeds verdoofd is met een teenknijper.
    3. Scheer de vacht op de huid van het achterhoofdsgebied. Steriliseer de vacht op de achterkant van het hoofd van de muis met 70% ethanol met behulp van een wattenstaafje. Pak de huid van het achterhoofd vast met een stompe tang en maak een incisie van 1,0-1,5 mm breed om het achterhoofdsbeen bloot te leggen zonder de schedel of enig orgaan te beschadigen. Open voorzichtig en langzaam de incisie om de grens tussen de hersenschors en het cerebellum door de schedel te observeren (Figuur 1B).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen schade optreedt aan de schedel of hersenen voor de niet-gewonde muis.
    4. Craniotomie bij muizen: Maak een klein gaatje in de rechterhersenhelft van het achterhoofdsbeen met behulp van een naald van 19 G x 1•1/2". Draai de naald voorzichtig om een inbrengpunt te maken voor steekwondnaalden en zorg ervoor dat u het hersenparenchym niet beschadigt. Het gat moet zich op het middelpunt van de interaurale lijn van de rechterhersenhelft tussen lambda en rand bevinden (Figuur 1B). Dit gat dient als richtlijn voor het inbrengen van de steekwondnaald in de volgende stap.
    5. Steekwond: Steek een naald van 27 G x 3/4" in vanaf het inbrengpunt en steek de hersenschors langs de rostrocaudale as (Figuur 1B,C). De naald wordt ingebracht totdat deze de voorkant van de schedel raakt en vervolgens voorzichtig teruggetrokken. De juiste diepte is er een waar de naald door het oppervlak van de hersenschors kan worden gezien. De linkerkant van de hersenschors wordt gebruikt als de onbeschadigde controle.
    6. Hecht de huidincisie met behulp van een nylon 3-0 hechtdraad met een 1/2 ronde naald.
    7. Dien 10 μl/g van de anesthesie-antagonist intraperitoneaal toe als het combinatie-anestheticum MMB. De muis moet binnen 8-16 uur na de injectie met anesthesie-antagonist kunnen lopen.

2. Beoordeling van bloeding en herstel van BBB-afbraak

  1. Immuno-enzymatische kleuring van een door een steek gewonde hersensectie voor IgG-lekkage bij muizen
    OPMERKING: Hier werden op dia's gemonteerde bevroren hersensecties gebruikt. Vrij zwevende bevroren hersensecties zijn ook geschikt voor dit protocol.
    1. Anesthesie bij muizen: Induceer anesthesie door de muis in de buurt van een met isofluraaninhalatieoplossing doordrenkt papier te plaatsen totdat hij in slaap valt. Dien vervolgens onmiddellijk 100 μL/kg combinatie-anestheticum MMB intraperitoneaal toe. Bevestig het effect van anesthesie met een teenknijp- en oprichtreflex.
    2. Plaats de muis op zijn rug en speld beide armen en voeten op het dissectiebord.
    3. Thoracotomie bij de muis: Pak de buikhuid vast met een stompe tang en maak een incisie van 1,0-1,5 cm door de huid en het buikvlies om de ribbenkast bloot te leggen. Open de ribbenkast voorzichtig met een schaar en vermijd schade aan het hart om het bloot te stellen voor hartperfusie.
    4. Hartperfusiefixatie: Bereid een peristaltische perfusiepomp voor en bevestig aan het ene uiteinde een buis met een naald van 19 G x 1•1/2". Vul de slang met PBS door de pomp voor gebruik aan te zetten. Steek vervolgens, terwijl de pomp draait, de naaldpunt in de linkerventrikel en zet deze vast met een tang. Maak een incisie van 0,5-1,0 mm in het rechter atrium. Verdrink de muis18 met een snelheid van 4-6 ml/min gedurende 5 minuten met ten minste 20 ml PBS om het bloed te verwijderen.
    5. Stop de pomp en breng de buis over naar een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Start de pomp opnieuw op met een snelheid van 4-6 ml/min gedurende 5 minuten met ten minste 20 ml 4% PFA in PBS voor fixatie18.
      OPMERKING: Als de pomp niet beschikbaar is, is het ook mogelijk om een spuit van 50 ml met een naald van 19 G x 1•1/2" te gebruiken voor perfusie.
    6. Hersendissectie: Plaats de muis op zijn buikzijde op het dissectiebord en leg de schedel bloot door een incisie te maken door de middellijn van de huid van het achterhoofdsgebied tot de neus. Stel de hersenen voorzichtig volledig bloot door de schedel met een schaar te verwijderen en zorg ervoor dat u de hersenen niet beschadigt. Til de hersenen op met een gebogen tang en breng deze over naar een buis van 15 ml gevuld met 10 ml 4% PFA in PBS.
    7. Incubeer de ontlede hersenen een nacht in de 4% PFA in PBS bij 4 °C voor volledige fixatie. Hierna incubeer je de hersenen een nacht in 10 ml 15% sucrose in PBS en breng je het over naar 10 ml 30% sucrose in PBS voor een extra dag op een wipschudder. Deze geleidelijke sucrosevervanging helpt weefselbeschadiging door ijs te voorkomen wanneer de hersenen later in een vriezer worden bewaard.
    8. Inbedding van de hersenen: Veranker de hersenen coronaal in een inbeddingsmedium in een weefselinbeddingsvorm en vries vervolgens in met behulp van 2-methylbutaan met droogijs19.
    9. Bevroren hersensecties: Monteer met behulp van een cryostaat seriële coronale secties (20 μm dik) van het ingebedde brein op een positief geladen diaglas. De hersensecties worden een nacht volledig aan de lucht gedroogd bij kamertemperatuur en bewaard in een vriezer van -80 °C.
    10. Voorbereiding van de blokkeerbuffer: Meng 10% serum voor pasgeboren kalveren, 30 mg/ml runderalbumine, 10 mg/ml glycine en 0,4% Triton X-100 in TBS om de blokkerende buffer te creëren. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken voor gebruik.
    11. Muis IgG-kleuring: Nadat de steekgewonde hersenschorssecties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan de lucht zijn gedroogd, fixeert u ze gedurende 30 minuten met 500 μL 4% PFA per glaasje. Was vervolgens de sectie met PBS (500 μL/glaasje) gedurende 5 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 500 μL/glaasje) van elk 5 minuten.
      OPMERKING: Voer alle procedures uit in een vochtinbrengende doos om te voorkomen dat de buffers verdampen.
    12. Blus de endogene enzymactiviteit in secties met 10% methanol en 3% waterstofperoxide in TBS gedurende 5 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 500 μL/dia) gedurende elk 5 minuten.
    13. Voer de blokkering uit met behulp van een blokkeerbuffer (500 μl/objectglaasje) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding van het antilichaam te voorkomen. Incubeer de coupes vervolgens met een biotine-geconjugeerd IgG-antilichaam van de muis (1:300 verdunning met de blokkeerbuffer, 300 μL/dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    14. Bereid tijdens de incubatie met het IgG-antilichaam van de muis het mengsel van 1 μl reagens A en 1 μl reagens B uit de peroxidasesysteemkit op basis van avidine/biotine in 300 μl van de blokkeerbuffer. Incubeer dit mengsel 30 minuten op kamertemperatuur voor gebruik. Nadat de incubatie van IgG-antilichamen bij de muis is voltooid, wast u de secties drie keer gedurende 5 minuten met TBS. Incubeer vervolgens de secties met het bereide mengsel van reagens A en B (300 μl/objectglaasje) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    15. Was de secties met 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 gedurende 5 min, driemaal, in de loop van 1 uur. Ontwikkel vervolgens kleur met behulp van 0,05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) in 0,05% waterstofperoxide toegevoegd 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 μL/dia) gedurende 5 minuten tot 1 uur (Figuur 2A). Observeer onder een microscoop op kleurverandering voordat u de reactie stopt.
    16. Was de secties drie keer met 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 gedurende 5 minuten en laat de secties 15 minuten aan de lucht drogen. Dehydrateer de secties vervolgens door ze twee keer 2 minuten onder te dompelen in 95% ethanol, gevolgd door twee keer 2 minuten 100% ethanol. Spoel de secties twee keer 5 minuten in xyleen. Dek de secties af met een niet in water oplosbaar montagemedium en laat ze drogen.
    17. Analyse van de IgG-kleuringsintensiteit van de muis: Maak beelden van de secties met behulp van een microscoop met een 20x objectief.
    18. Kwantificeer met behulp van ImageJ-software de kleuringsintensiteit door de gemiddelde grijswaarden te meten in vijf willekeurig geselecteerde velden (8 × 8 μm2 voor elk) van immuno-enzymatisch gekleurde gebieden in elke sectie. Normaliseer de kleurintensiteit met behulp van de gemiddelde grijswaarde van elke contralateraal; Er is geen gewond gebied als achtergrondcorrectie. Bereken het gemiddelde van de genormaliseerde gemiddelde grijswaarden uit de vijf velden om de gemiddelde grijswaarde van de IgG-kleuring van de muis voor elke sectie te bepalen.
  2. Beoordeling van Evans blauwlekkage in het hersenparenchym
    OPMERKING: Het Evans blue-protocol is vergelijkbaar met de eerder beschreven methode11. Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld dextran werkt ook voor herstel van BBB-afbraak10.
    1. Evans blauwe injectie: Dien 2% Evans blauw in PBS (3 ml/kg) toe aan de steekgewonde muis via de staartader 1 uur voor dissectie.
    2. Verse hersenextractie: 1 uur na toediening van Evans blue, doordrenk de muis met PBS zoals beschreven in stap 2.1.1-2.1.4. Ontleed en snijd vervolgens de verse hersenen coronaal in secties van 1 mm dik met behulp van een hersensnijder. Selecteer vier plakjes en knip hersenstukken uit (elk 1 mm2 vierkant) die het steekwondgebied of intacte gebieden in de niet-gewonden hersenschors bevatten, volgens het ruitjespapier (Figuur 1D).
    3. Evans blauwe kwantificering: Verzamel de vier hersenstukken in een buis van 1,5 ml en homogeniseer ze met 200 μL trichloorazijnzuur met behulp van een weefselvermaler. Centrifugeer het homogenaat bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 20 min. Verzamel vervolgens het bovenstaande met een pipet en verdun het met 600 μL ethanol. Bereid een standaardcurve van Evans-blauw voor, variërend van 0-1,0 ng/ml, om de concentratie te kwantificeren. Meet de fluorescentie-intensiteit bij 680 nm met een excitatiegolflengte van 620 nm met behulp van een plaatlezer.

3. Beoordeling van het ontstekingsniveau in de hersenen na een steekwond

  1. Immuno-enzymatische kleuring van steekgewonde hersensectie voor gliacellen
    1. Voorbereiding van de hersensecties: Maak de op de hersensecties gemonteerde diabril zoals beschreven in de stappen 2.1.1-2.1.9.
    2. Glia-kleuring: Nadat de steekgewonde hersenschorssecties gedurende 1 uur aan de lucht zijn gedroogd, fixeert u de secties opnieuw met 4% PFA (500 μL/dia) gedurende 30 min. Was vervolgens de secties met PBS (500 μL/glaasje) gedurende 5 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met TBS (500 μL/glaasje) van elk 5 minuten.
    3. Blus de endogene enzymactiviteit in secties met 10% methanol en 3% waterstofperoxide in TBS gedurende 5 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 500 μL/dia) gedurende elk 5 minuten.
    4. Voer de blokkering uit met behulp van een blokkeerbuffer (500 μl/objectglaasje) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding van het antilichaam te voorkomen.
    5. Incubeer de secties een nacht met het primaire antilichaam (300 μL/objectglaasje). Gebruik de volgende verdunningen voor het primaire antilichaam: 1:3.000 verdunning voor Iba1 en 1:1.000 verdunning voor GFAP, verdund in de blokkerende buffer.
    6. Was de sectie drie keer met TBS gedurende elk 5 minuten. Incubeer vervolgens met het biotine-geconjugeerde secundaire antilichaam (1:300 verdunning met de blokkeerbuffer, 300 μL/dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    7. Bereid tijdens de incubatie met het secundaire antilichaam het mengsel van 1 μl reagens A en 1 μl reagens B uit de peroxidasesysteemkit op basis van avidine/biotine in 300 μl van de blokkeerbuffer. Incubeer het mengsel vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik.
    8. Nadat de incubatie van secundaire antilichamen is voltooid, wast u de secties drie keer met TBS gedurende elk 5 minuten en incubeert u de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met het bereide mengsel van reagens A en B (300 μl/diagonaal) met het bereide mengsel van reagens A en B.
    9. Was de secties met 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 gedurende 5 min, driemaal, in de loop van 1 uur. Ontwikkel vervolgens kleur met behulp van 0,05% DAB in 0,05% waterstofperoxide toegevoegd 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 μL/dia) gedurende 30 minuten tot 3 uur. Observeer onder een microscoop op kleurverandering voordat u de reactie stopt.
    10. Was de secties drie keer met 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 gedurende 5 minuten en laat de secties 15 minuten aan de lucht drogen. Dehydrateer daarna de secties door ze twee keer 2 minuten onder te dompelen in 95% ethanol, gevolgd door twee keer 100% ethanol gedurende 2 minuten. Spoel de secties twee keer 5 minuten in xyleen. Dek de secties af met een niet in water oplosbaar montagemedium en laat ze drogen. Leg de sectiebeelden vast met behulp van de microscoop met een objectief van 20x.
  2. Immunofluorescerende kleuring van door steekwonden gewonde hersensectie voor gliacellen
    1. Voorbereiding van de hersensecties: Maak de op de hersensecties gemonteerde diabril zoals beschreven in de stappen 2.1.1-2.1.9.
    2. Glia-kleuring: Nadat de steekgewonde hersenschorssecties gedurende 1 uur aan de lucht zijn gedroogd, fixeert u de secties opnieuw met 4% PFA (500 μL/dia) gedurende 30 min. Was vervolgens de secties met PBS (500 μL/glaasje) gedurende 5 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met TBS (500 μL/glaasje) van elk 5 minuten. Voer de blokkering uit met behulp van een blokkeerbuffer (500 μl/objectglaasje) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding van het antilichaam te voorkomen.
    3. Incubeer de secties een nacht met het primaire antilichaam (300 μL/objectglaasje). Gebruik de volgende verdunningen voor het primaire antilichaam: 1:3.000 verdunning voor Iba1 en 1:1.000 verdunning voor GFAP, verdund in blokkeerbuffer.
    4. Was de sectie drie keer met TBS gedurende elk 5 minuten. Incubeer vervolgens met het fluorescerend-geconjugeerde secundaire antilichaam (1:300 verdunning met de blokkeerbuffer, 300 μL/dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    5. Was de secties drie keer met TBS gedurende 5 minuten en incubeer de secties met 0.4 μg/ml DAPI-oplossing in TBS (500 μL/dia) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Was de secties 5 minuten met TBS (500 μL/dia) en gedurende 5 minuten met gedestilleerd water (500 μL/dia). Nadat u de secties 15 minuten aan de lucht hebt gedroogd, plakt u ze af met een montagemedium op waterbasis en laat u ze drogen. Leg de sectiebeelden vast met behulp van een confocale microscoop met een 20x objectief.
  3. Real-time qPCR voor gliacelmarkers en inflammatoire cytokines
    OPMERKING: De primersequenties 16,20,21,22 die in het gepresenteerde protocol worden gebruikt, worden vermeld in tabel 1.
    1. Preparaat van vers hersenweefsel: Doordrenk de muis met PBS zoals beschreven in de stappen 2.1.1-2.1.4. Extraheer en snijd vervolgens de verse hersenen coronaal in 1 mm dikke secties met behulp van een hersensnijder. Selecteer vier plakjes en knip hersenstukken uit (1 mm2 vierkant, elk) die het steekwondgebied of intacte gebieden aan de contralaterale kant van de hersenschors omvatten, volgens het ruitjespapier. Bepaal het gebied dat moet worden weggesneden, inclusief de laesie in het midden (Figuur 1D).
    2. RNA-extractie: Verzamel de vier hersenstukken in een buisje van 1,5 ml en homogeniseer ze met 1 ml TRIzol-reagens door te pipetteren. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 200 μL chloroform toe, vortex goed en incubeer nog 2 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het mengsel 15 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C. Breng de bovenste, doorzichtige laag voorzichtig over in een nieuwe tube van 1,5 ml, vermijd witte neerslag, die DNA en eiwitten bevat.
    3. Voeg 500 μL isopropanol toe aan de verzamelde bovenlaag, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verwijdert u het bovenstaande en voegt u 1 ml 70% ethanol toe om de RNA-pellet te wassen. Centrifugeer bij 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het bovenstaande volledig en laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen. Los de RNA-pellet op in 15 μL RNasevrij water en denatureer het RNA gedurende 10 minuten bij 55°C.
    4. Meet de RNA-concentratie met behulp van een microvolumespectrofotometer. Bewaar het RNA onmiddellijk bij -80 °C.
    5. cDNA-synthese: Gebruik voor cDNA-synthese een in de handel verkrijgbare DNA-synthesekit. Bereid in totaal 10 μL reactiebuffer voor in een buis van 1,5 μL voor elk monster, inclusief 2 μL 5 x RT Buffer, 0,5 μL RT Enzyme Mix, 0,5 μL Primer Mix, 1 μg RNA en nucleasevrij water. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten voor de omgekeerde transcriptiereactie en bij 98 °C gedurende 5 minuten voor de enzyminactiveringsreactie. Voeg vervolgens 90 μL nucleasevrij water toe aan de buffer en meng goed. Bewaar de cDNA-oplossing bij -20°C.
    6. Kwantificering van RNA-expressie: Gebruik voor real-time qPCR-analyse een in de handel verkrijgbare qPCR-mastermixkit. Bereid de Mix-oplossing voor elk monster door 5 μL KOD SYBR qPCR Mix, 0,4 μL 5 μM forward primer, 0,4 μL 5 μM reverse primer en 0,2 μL 50 x ROX te combineren in 2 μL nucleasevrij water.
    7. Maak een mengsel van 2 μL cDNA-oplossing en 8 μL Mix-oplossing in een buis met 8 strips, meng goed en draai naar beneden.
    8. Start de PCR-reactie met de volgende cyclusomstandigheden: 98 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40 cycli van 98°C gedurende 10 s, 60°C gedurende 10 s en 68°C gedurende 30 s. Voer de stap Smelt-/Dissociatiecurve-analyse uit met behulp van een real-time qPCR-machine.
    9. mRNA-expressieanalyse: Analyseer het mRNA-expressieniveau met behulp van de 2-Delta-Delta-Ct-methode, die wordt uitgevoerd door normalisatie met een huishoudgen, Gapdh, en vervolgens met dat van de contralaterale zijde23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om het herstel van BBB-afbraak te analyseren, werd het bloedingsniveau in de door steekwonden gewonde hersenschorsingen beoordeeld door het extravasatieniveau van serum IgG te meten 1, 3, 5 en 7 dagen na hersenletsel. De IgG-kleuringsbeelden van de muis toonden bloedlekkage en afzetting in de hersenschors na hersenletsel. Dit was na meer dan 7 dagen verminderd, omdat de BBB zich herstelde en het IgG-eiwit werd afgebroken (Figuur 2B). IgG-extravasatieniveaus ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier werd een protocol geïntroduceerd voor het maken van een TBI-muismodel met behulp van naalden. Dit protocol maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van het herstel van de afbraak van de BBB en ontsteking na hersenletsel met behulp van histologische en moleculair biologische benaderingen. Alternatieve protocollen, zoals het repetitieve hersenschudding TBI-model en het TBI-model voor gewichtsafname, kunnen ook worden gebruikt om BBB-afbraak en ontsteking te analyseren. Deze modell...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Ayana Hamano, Minori Yamashita, Misaki Endo, Hirono Kobayashi en Nito Nakahira voor hun hulp met de immunohistochemie en real-time qPCR. Dit werk werd ondersteund door de JSPS KAKENHI 19K16122, Takeda Science Foundation, Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, The Mitsubishi Foundation, Brain Science Foundation en The Uehara Memorial Foundation to K.H.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
19 G x 1•1/2" naaldTERUMONN-1938R 
27 G x 3/4" naaldTERUMONN-2719S
anti-GFAP antilichaamSigma-AldrichG9269
anti-Iba1 antilichaamWako019-19741
Atipamezole HydrochlorideNippon Zenyaku KogyoProductnaam: Antisedan
Biotine-geconjugeerd muis IgG antilichaamVector LaboratoriesBA-9200
Biotine-geconjugeerd konijn IgG antilichaamVector LaboratoriesBA-1000
RundereiwitalbumineNacalai tesque01860-07
Brain SlicerVisikolBSLM-2
Butorphanol TartrateMeiji Animal HealthProductnaam: Vetorphale 5 mg
Confocale microscoopZeissLSM700
Cryostat LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans blauwWako056-04061
Fluorescent-geconjugeerd konijn IgG antilichaamInvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02Op water gebaseerd montagemiddel
Isofluraane inhalatievloeistofViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR master mix kit
MedetomideNippon Zenyaku KogyoProductnaam: Domitor
MicroscoopOlympusFSX100
Microvolume spectrofotometerThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01Op water onoplosbaar montagemiddel
NieuwgeboortekalfserumGibco16010159
O.C.T. compoundSakura Finetek Japan45833Inbeddingsmedium
Peel-A-Way, Afgesneden 22 mm Vierkante TopTed Pella27118Weefsel inbedding mal
Peristaltiek perfusiepompATTOSJ-1211
Plate readerFisher ScientificCytation 3
Real-time qPCR machineThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101cDNA synthesekit
Superfrost Plus Slide GlasFisher Scientific12-550-15Positief geladen schuifglas
Hechtdraad met naald AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagensInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Standard KitVector LaboratoriesPK-4000Avidine/biotine gebaseerd peroxidase systeem kit

Referenties

  1. Narayan, R. K., et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma. 19 (5), 503-557 (2002).
  2. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (7), 551-567 (2011).
  3. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  4. Ikeshima-Kataoka, H., Shen, J. S., Eto, Y., Saito, S., Yuasa, S. Alteration of inflammatory cytokine production in the injured central nervous system of tenascin-deficient mice. In Vivo. 22 (4), 409-413 (2008).
  5. Zhou, Y., Wang, Y., Wang, J., Anne Stetler, R., Yang, Q. W. Inflammation in intracerebral hemorrhage: From mechanisms to clinical translation. Prog Neurobiol. 115, 25-44 (2014).
  6. Hijazi, N., et al. Endogenous plasminogen activators mediate progressive intracerebral hemorrhage after traumatic brain injury in mice. Blood. 125 (16), 2558-2567 (2015).
  7. Kataoka, K., et al. Roles of urokinase-type plasminogen activator in a brain stab-wound. Brain Res. 887 (1), 187-190 (2000).
  8. Wang, Y., et al. Early posttraumatic csf1r inhibition via plx3397 leads to time- and sex-dependent effects on inflammation and neuronal maintenance after traumatic brain injury in mice. Brain Behav Immun. 106, 49-66 (2022).
  9. Kaplan, L., Chow, B. W., Gu, C. Neuronal regulation of the blood-brain barrier and neurovascular coupling. Nat Rev Neurosci. 21 (8), 416-432 (2020).
  10. Endo, M., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid regulates blood coagulation and fibrinolysis system for repair after brain injury. Brain Res. 1818, 148511(2023).
  11. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).
  12. Hashimoto, K., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid suppresses inflammation via regulation of microglial polarization in the stab-wounded mouse cerebral cortex. Sci Rep. 8 (1), 9715(2018).
  13. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Yasui, M. Aquaporin 4-dependent expression of glial fibrillary acidic protein and tenascin-c in activated astrocytes in stab-wound mouse brain and in primary culture. J Neurosci Res. 93 (1), 121-129 (2015).
  14. Nakashima, M., et al. The neuroprotective function of 2-carba-cyclic phosphatidic acid: Implications for tenascin-c via astrocytes in traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 361, 577749(2021).
  15. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  16. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Abe, T., Yasui, M. Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer, osteopontin. Mol Cell Neurosci. 56, 65-75 (2013).
  17. Ikeshima-Kataoka, H., Yasui, M. Correlation between astrocyte activity and recovery from blood-brain barrier breakdown caused by brain injury. Neuroreport. 27 (12), 894-900 (2016).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  19. Botta, S., Chemiakine, A., Gennarino, V. A. Dual antibody strategy for high-resolution imaging of murine Purkinje cells and their dendrites across multiple layers. STAR Protoc. 3 (2), 101427(2022).
  20. Amin, D. N., et al. Identification of stage biomarkers for human African trypanosomiasis. Am J Trop Med Hyg. 82 (6), 983-990 (2010).
  21. Jiang, J., et al. Therapeutic window for cyclooxygenase-2 related anti-inflammatory therapy after status epilepticus. Neurobiol Dis. 76, 126-136 (2015).
  22. Wei, J., et al. Microglia activation: One of the checkpoints in the CNS inflammation caused by angiostrongylus cantonensis infection in rodent model. Parasitol Res. 114 (9), 3247-3254 (2015).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Hazy, A., et al. Divergent age-dependent peripheral immune transcriptomic profile following traumatic brain injury. Sci Rep. 9 (1), 8564(2019).
  25. Xia, Y., et al. Osthole confers neuroprotection against cortical stab-wound injury and attenuates secondary brain injury. J Neuroinflammation. 12, 155(2015).
  26. Cieri, M. B., Villarreal, A., Gomez-Cuautle, D. D., Mailing, I., Ramos, A. J. Progression of reactive gliosis and astroglial phenotypic changes following stab-wound-induced traumatic brain injury in mice. J Neurochem. 167 (2), 183-203 (2023).
  27. Barreda-Manso, M. A., Yanguas-Casas, N., Nieto-Sampedro, M., Romero-Ramirez, L. Neuroprotection and blood-brain barrier restoration by salubrinal after a cortical stab injury. J Cell Physiol. 232 (6), 1501-1510 (2017).
  28. Rapp, P. E., et al. Patient characterization protocols for psychophysiological studies of traumatic brain injury and post-TBI psychiatric disorders. Front Neurol. 4, 91(2013).
  29. Brody, D. L., Benetatos, J., Bennett, R. E., Klemenhagen, K. C., Mac Donald, C. L. The pathophysiology of repetitive concussive traumatic brain injury in experimental models; new developments and open questions. Mol Cell Neurosci. 66 (Pt B), 91-98 (2015).
  30. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  31. Chen, C., et al. A novel simple traumatic brain injury mouse model. Chin Neurosurg J. 8 (1), 8(2022).
  32. Machado, C. A., et al. Weight-drop model as a valuable tool to study potential neurobiological processes underlying behavioral and cognitive changes secondary to mild traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 385, 578242(2023).
  33. Hashimoto, K., Ikeda, N., Nakashima, M., Ikeshima-Kataoka, H., Miyamoto, Y. Vitronectin regulates the fibrinolytic system during the repair of cerebral cortex in stab-wounded mice. J Neurotrauma. 34 (22), 3183-3191 (2017).
  34. Unterberg, A. W., Stover, J., Kress, B., Kiening, K. L. Edema and brain trauma. Neuroscience. 129 (4), 1021-1029 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SteekwondmodelMuis TBI modelHemorragiebeoordelingOntstekingsanalyseLetsel aan de cerebrale cortexGliale activatieMicrogliaresponsCytokine expressieHersenparenchym

Gerelateerde artikelen