Methodenartikel

Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

DOI:

10.3791/67802

⸱

25 april 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, TU Dortmund University, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we het protocol om de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen te bestuderen met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul in confocale microscopiemodus.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een protocol voor het uitvoeren van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul met behulp van confocale microscopie om de lokale flexibiliteit en dynamiek van het desoxyribonucleïnezuur (DNA)-bindende forkhead (FKH) domein van de FoxP1-transcriptiefactor te onderzoeken. FoxP1 dimeriseert via een driedimensionaal domein-swapping (3D-DS) mechanisme, waarbij een ongeordend tussenproduct wordt gevormd met of zonder DNA. Aangezien 3D-DS een intrinsiek ongeordend gebied betreft, is het begrijpen van het gedrag ervan cruciaal voor het ophelderen van de structurele en functionele eigenschappen van FoxP1. Met behulp van een enkelvoudig cysteïne-gelabeld FoxP1 hebben we single-molecule fluorescentie anisotropie (smFA) experimenten uitgevoerd, waarbij we dynamische anisotropie Photon Distribution Analysis (daPDA) en tijdopgeloste anisotropie Burst Variance Analysis (traBVA) benaderingen toepasten om lokale flexibiliteit en dynamiek te onderzoeken. Dit protocol biedt een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding voor smFA-metingen, waarbij de nadruk ligt op tijdopgeloste analyses, variantie en kansverdelingstechnieken om structurele dynamiek over verschillende tijdschalen vast te leggen. Deze benadering stelde ons in staat om dynamiek en heterogeniteit te relateren aan FoxP1-dimerisatie en DNA-binding, waarbij het complexe actiemechanisme dat deze transcriptiefactor kenmerkt, wordt benadrukt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De functionele activiteit van biomoleculen hangt af van hun moleculaire flexibiliteit en structurele dynamica 1,2,3. Van nature ondergaan biomoleculen constante thermische fluctuaties, variërend van snelle bewegingen tot conformationele veranderingen op de lange termijn die hun functie beïnvloeden (Figuur 1)4. In biomoleculen dragen lokale bewegingen van de ruggengraat bij aan grootschalige wereldwijde bewegingen, waaronder scharnierbuiging in enzymen en significante conformationele veranderingen in motoreiwitten. Structuurbepalingsmethoden zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR)5, röntgenkristallografie6 en cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM)7 hebben meerdere conformaties in verschillende biomoleculen aan het licht gebracht. Desalniettemin is het verband tussen de lokale fluctuaties en grote conformationele dynamieken van biomoleculen en hun rol in functie grotendeels onontgonnen. Het relateren van dynamiek en structuur kan een uitdaging zijn, vooral voor intrinsiek ongeordende eiwitten (IDP's)8,9,10. In tegenstelling tot gestructureerde eiwitten behouden IDP's geen stabiele tertiaire structuur. In plaats daarvan ondergaan ze uitgebreide conformatieveranderingen met vergelijkbare vrije energieniveaus, waardoor een breed scala aan biologische activiteiten mogelijk is11,12.

Er zijn verschillende experimentele benaderingen gebruikt om de conformationele dynamiek van eiwitten te onderzoeken door hun moleculaire flexibiliteit te onderzoeken 1,13,14,15,16. Onder deze onderscheidt NMR zich door zijn vermogen om resolutie op atomair niveau te bieden over verschillende tijdschalen, van tientallen picoseconden tot enkele uren12. Het bepalen van macromoleculaire flexibiliteit blijft echter een uitdaging vanwege de hoge vrijheidsgraden en voor grote eiwitten; NMR is dus vaak beperkt tot het bestuderen van biomoleculen van ongeveer 100 kDa17.

Gezien de structurele complexiteit van zeer dynamische eiwitten zoals IDP's, zijn er aanvullende methodologische ontwikkelingen ontwikkeld om de lokale en langeafstandsconformatieruimte te verkennen om hun functie te begrijpen11. Single-molecule multiparameter Fluorescence Spectroscopy (smMFS)18,19,20,21,22 biedt uitgebreide informatie over biomoleculen en biedt cruciale inzichten in hun functie, conformationele dynamiek, bindingstoestanden en stoichiometrie. Het interpreteren van de enorme hoeveelheid structurele gegevens die uit biomoleculen zijn verkregen, is echter een uitdaging, en factoren zoals moleculaire dynamica, fluorofoorgedrag en het complexe gedrag van moleculen kunnen de gegevensanalyse verder bemoeilijken 23,24,25,26,27,28.

We gebruiken single-molecule fluorescentie anisotropie (smFA) als een robuuste methode voor het beoordelen van de lokale en globale dynamiek langs de ruggengraat van biomoleculen (Figuur 1A). Fluorescentie-anisotropie, voor het eerst beschreven door Perrin29 en geïntroduceerd door Weber 30,31 als een bioanalytisch hulpmiddel32, werd later aangepast voor studies met één molecuul met de komst van tijdopgeloste fluorescentietechnieken en de toename van de gevoeligheid van detectoren 33,34,35,36,37. smFA bestrijkt een breed scala aan tijdschalen - van picoseconden tot enkele uren - en vormt een aanvulling op de gegevens die zijn verkregen uit Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) -experimenten met één molecuul38.

smFA kan in verschillende formaten worden gevisualiseerd om kritische informatie over biomoleculaire dynamica te extraheren (Figuur 1B). Tijdopgelost fluorescentie-anisotropieverval zijn eendimensionale histogrammen die dynamiek vastleggen op de tijdschaal van picoseconde tot nanoseconde39,40. Tweedimensionale histogrammen met één molecuul, die de fluorescentielevensduur correleren met anisotropie voor individuele moleculen, kunnen heterogeniteit van de anisotropietoestand onthullen en visuele inzichten verschaffen in de potentiële dynamiek binnen de observatietijd in confocale experimenten (~ms)41,42. Voor het bestuderen van de dynamiek van sub-milliseconden kan dynamische anisotropie fotonverdelingsanalyse (daPDA) worden gebruikt, terwijl tijdopgeloste anisotropie Burst Variance Analysis (traBVA) een robuuste methode biedt voor het bevestigen van specifieke dynamica rond milliseconden43 (Figuur 1B).

Deze methoden vormen een aanvulling op meer traditionele hulpmiddelen, zoals polarisatie-opgeloste fluorescentiecorrelatiespectroscopie (pFCS), die een breder spectrum heeft 44,45,46,47. Over het algemeen vergemakkelijken meerdere gegevensanalysetools voor smFA het identificeren van lokale en wereldwijde conformatieveranderingen, op voorwaarde dat de juiste kalibratie wordt overwogen.

Hier passen we smFA toe om de DNA-binding van de menselijke FoxP1-transcriptiefactor 48,49,50,51 te bestuderen. Dit eiwit neemt domeingeruild dimeer aan vanwege de intrinsiek ongeordende aard van de polypeptideketen, die met name wordt beïnvloed afhankelijk van de quaternaire toestand van het eiwit en de aanwezigheid van DNA. We genereerden verschillende single-cysteïnemutanten om te labelen met BODIPY-FL, voerden smFA-experimenten uit en gebruikten daPDA en trBVAa. Deze benadering stelde ons in staat om dynamiek en heterogeniteit te relateren aan FoxP1-dimerisatie en de DNA-binding, waarbij het complexe werkingsmechanisme dat deze transcriptiefactor kenmerkt, werd benadrukt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het selecteren van de juiste fluorofoor is essentieel voor smFA-experimenten. Biomoleculen kunnen op plaatsspecifieke posities worden gelabeld door aminozuren in eiwitten of nucleotidebasen in nucleïnezuren met fluorescerende markers te wijzigen, afhankelijk van de beschikbare reactieve groepen. Van de organische kleurstoffen52 zijn de families Alexa Fluor, Cy, BODIPY en Janelia Farms de meest populaire keuzes voor smFA, dankzij hun lange fluorescentielevensduur, fotostabiliteit en hoge kwantumopbrengsten. BODIPY-FL heeft vaak de voorkeur vanwege zijn verlengde fluorescentielevensduur, superieure kwantumopbrengst en korte verbindingslinker. Bovendien worden alternatieve fluoroforen vaak gebruikt bij het screenen van geneesmiddelen, waarbij bulktechnieken de voorkeur hebben53. Chimere fluorescerende eiwitten kunnen ook worden gebruikt voor experimenten met anisotropie en beeldvorming van levende cellen, hoewel er een beperking is van een lager dynamisch bereik.

1. Voorbereiding van de buffer

NOTITIE: Draag handschoenen, een oogbeschermingsbril en een laboratoriumjas tijdens laboratoriumexperimenten.

  1. Standaard buffer (20 mM 4- (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur [HEPES], pH 7,8, 150 mM NaCl): Los 2,38 g HEPES, 4,38 g NaCl op in 400 ml ultrazuiver water, stel de pH in op 7,8 en breng het uiteindelijke volume op 500 ml.
  2. Lysisbuffer (20 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF], 10 μg/ml DNAse): Los 2,38 g HEPES, 4,38 g NaCl en 8,71 mg PMSF en een eindconcentratie van 10 μg/ml DNAse op in 400 ml ultrazuiver water, pas de pH aan op 7,8 en maak het uiteindelijke volume op 500 ml.
  3. Evenwichtsbuffer (50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS], 150 mM NaCl en 10 mM imidazool; pH 7,4): Los 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl en 0,34 g imidazool op in 400 ml ultrazuiver water, stel de pH in op 7,4 en breng het uiteindelijke volume op 500 ml.
  4. Wasbuffer (50 mM PBS, 150 mM NaCl en 30 mM imidazool; pH 7,4): Los 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl en 1,02 g imidazool op in 400 ml ultrazuiver water, stel de pH in op 7,4 en breng het uiteindelijke volume op 500 ml.
  5. Elutiebuffer (50 mM PBS, 150 mM NaCl en 250 mM imidazool; pH 7,4): Los 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl en 8,5 g imidazool op in 400 ml ultrazuiver water, stel de pH in op 7,4 en breng het uiteindelijke volume op 500 ml.
  6. PBS-buffer (50 mM natriumfosfaat gebufferde zoutoplossing, 150 mM NaCl, pH 7,4). Los 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4 en 4,38 g NaCl op in 400 ml ultrazuiver water, stel de pH in op 7,4 en breng het uiteindelijke volume op 500 ml.
  7. Steriliseer alle buffers door de oplossing te filtreren met behulp van filters met een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar de buffers bij kamertemperatuur (RT).
  8. Filter de standaardbuffer met behulp van een koolstoffilter voor acquisitie van één molecuul.

2. Fluorescerende sondes

  1. BODIPY-FL: Los een injectieflacon van 5 mg met BODIPY-FL op door een eindvolume van 1,29 ml vers geopend dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen om de uiteindelijke concentratie van 10 mM BODIPY-FL te verkrijgen.
  2. Rhodamine 110: Los 3,67 mg Rhodamine 110 op door een laatste hoeveelheid van 1 ml vers geopende DMSO toe te voegen om de uiteindelijke concentratie van 10 ml Rhodamine 110 te verkrijgen.
    OPMERKING: Fluorescerende sondes moeten worden vermeden bij blootstelling aan licht. Gebruik altijd een lichtgevoelige tube (amberkleurig) en wikkel deze in met aluminiumfolie. Als DMSO al is geopend, moet het in de exsiccator worden bewaard om de houdbaarheid te verlengen.
  3. Bereid kleine hoeveelheden van de voorbereide fluorescerende sonde voor en bewaar deze bij -20 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Vermijd vries-dooicycli om de etiketteringsefficiëntie te verbeteren.

3. Kalibratie metingen

  1. Voer multiparameter-fluorescentiedetectie-experimenten (MFD) uit op een zelfgebouwde polarisatie-opgeloste opstelling met 4 detectiekanalen en 2 gepulseerde lasers (blauw 485 nm en rood 640 nm)54. Gebruik voor anisotropiemetingen echter de blauwe laser en twee detectorkanalen.
  2. Schakel de detectorkanalen (parallel en loodrecht) en het blauwe laservermogen in.
  3. Zorg ervoor dat het laservermogen is ingesteld op 60 μW en open het tijdgecorreleerde bedieningspaneel van de software voor het tellen van enkele fotonen (TCSPC)36 .
  4. Meng 1 μl 100 nM Rhodamine 110 en 49 μL gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 2 nM Rhodamine 110. Voeg 50 μL 2 nM Rhodamine 110 toe aan het midden van het dekglas voor kalibratiemetingen.
  5. Voeg vervolgens een druppel onderdompelingsvloeistof (olie of water, maar zorg ervoor dat dezelfde brekingsindex wordt gedeeld) toe aan de objectieflens van de microscoop om het oplossend vermogen van de microscoop te vergroten.
  6. Plaats het dekglas op de objectieflens en zorg ervoor dat de waterdruppel zich in het midden van het microscoopobjectief bevindt.
  7. Pas het beeldvlak aan zodat het zich in de oplossing en boven het glasoppervlak bevindt.
  8. Pas de knop aan om het tweede heldere brandpunt te vinden en draai naar anderhalve punt. Richt de laser op het grensvlak van het glas en de vloeistof.
  9. Maximaliseer het aantal gedetecteerde fotonen door de positie van het gaatje (70 μm) aan te passen terwijl u de snelheid van het aantal fotonen bewaakt.
  10. Open de software in het moduspaneel met tijdgecodeerde tijdresolutie (TTTR of T3) en klik op de knop Start . Noteer de telsnelheid gedurende 120 s en sla het Rhodamine 110.ptu-bestandsformaat op met behulp van de acquisitiesoftware. Deze acquisitietijd zou voldoende moeten zijn gezien de concentratie (2 nM).
  11. Voeg voor achtergrondmetingen 50 μL gedestilleerd water toe aan het midden van het afdekglas en herhaal de stappen 3.5-3.10. Noteer echter de fotontelling gedurende 300 s en sla het water.ptu-bestand op.
  12. Voeg voor andere achtergrondmetingen 50 μL standaardbuffer toe aan het midden van het afdekglas en herhaal stap 3.5-3.10. Noteer de fotontelling gedurende 300 s en sla het standaard buffer.ptu-bestand op. Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van burst-integratie fluorescentielevensduur (BIFL) analysesoftware.

4. Kalibratie en gegevensanalyse

  1. Open de BIFL-software en klik op bevestig de installatie vanuit het automatische venster. Klik vervolgens op parameters uit bestand ophalen en vervolgens op OK.
  2. Om de meting te analyseren, klikt u op de gegevenspadmatrix en selecteert u deze.
  3. Laad vervolgens het bestand watermeting water.ptu voor arrays zoals Groene scatter. Selecteer op dezelfde manier het standaard buffer.ptu-bestand voor Groene achtergrond. Voor Groen dik, selecteer Rhodamine 110.ptu.
  4. Klik onder de selectieparameters voor één molecuul op Volgende en vervolgens op Aanpassen om een nieuw pop-upvenster weer te geven. Klik op de drempelwaarde om de aankomsttijd tussen fotonen te wijzigen en selecteer de gebeurtenistijd van een enkel molecuul voor de gemiddelde aankomsttijd tussen fotonen (dt). Klik vervolgens op min. # om het minimale aantal fotonen per enkele molecuulgebeurtenis te selecteren en sluit vervolgens het pop-upvenster door op Return te klikken. Klik vervolgens op OK.
  5. Klik vervolgens op Parameters voor kleuraanpassing om de initiële fluorescentielevensduur voor groen aan te passen, kleuren die worden gegenereerd met parameters voor fluorescentieverval. Pas de waarden voor Prompt en Delay aan door de waarden van Van en Tot te wijzigen. Sluit vervolgens het pop-upvenster door op Retourneren te klikken. Klik vervolgens op OK.
  6. Klik op Opslaan om de ASCII-bestanden te verwerken en op te slaan in een geselecteerde map. Verwerk vervolgens de gegevens voor in de tijd opgelost fluorescentie-anisotropieverval met behulp van ChiSurf22, Photon Distribution Analysis55,56 of Burst Variance Analysis57,58.
    OPMERKING: Voorbeeldgegevens en stapsgewijze beschrijvingen voor het gebruik van ChiSurf, PDA en BVA zijn beschikbaar op respectievelijk github.com/Fluorescence-Tools/chisurf, github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib, www.mpc.hhu.de/en/software/mfd-fcs-and-mfis en github.com/SMB-Lab/feda_tools. De experimentele gegevens zijn beschikbaar bij Zenodo (10.5281/zenodo.13371503).

5. FoxP1 eiwit preparaat

  1. Recombinante FoxP1 bacteriële overexpressie
    1. Voer transformatie uit in E. coli C41-bacteriecellen na snel veranderende, plaatsgerichte polymerasekettingreactie (PCR)-mutagenese.
    2. Bereid LB-media en autoclaaf voor om het te steriliseren.
    3. Pre-inoculeer een enkele E. coli C41-kolonie door toe te voegen aan 5 ml LB-medium dat 5 μl (100 μg/ml) ampicilline bevat. Laat een nacht bij 37 °C broeden op een broedmachineschudder.
    4. Inoculeer de volgende dag grootschalige bacteriecultuur door 's nachts pre-inoculum toe te voegen aan 500 ml LB-media met vooraf toegevoegd antibioticum met een verhouding van 1:500.
    5. Bewaak de groei van de cultuur door de absorptie van de cultuur bij 600 nm te meten.
    6. Wanneer de optische dichtheid tussen ~0,5-0,7 ligt, induceer dan de eiwitexpressie door een eindconcentratie van 0,5 mM isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen en houd de cultuur een nacht op 15 °C op een incubatorschudder.
    7. Na het bereiken van een optische dichtheid (600 nm) in het bereik van 1,4-1,6, oogst u de bacteriecellen door centrifugatie bij 3000 g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de pellet tot gebruik bij -20 °C.
  2. Recombinante FoxP1 zuivering
    1. Lyse E. coli C41-cellen door lysisbuffer toe te voegen met behulp van lysismethoden zoals sonicatie, vloeistofhomogenisatie, Franse pers, enz.
    2. Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten bij 14000 g bij 4 °C.
    3. Was voor zijn 6-gelabelde eiwitten de Ni2+-NTA-affiniteitskolom en breng deze in evenwicht met NiSO4 met behulp van snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC).
    4. Laad het His6-tagged FoxP1-eiwit in de gebalanceerde Ni2+-NTA-affiniteitskolom.
    5. Eluteer het FoxP1-eiwit uit de Ni2+-NTA-kolom met behulp van een lineaire gradiënt van de elutiebuffer.
    6. Nadat het eiwit is geëlueerd, voert u dialyse uit voor bufferuitwisseling. Voeg eiwit toe aan een evenwichtsbuffer zonder imidazool en dialyseer een nacht met behulp van een magnetische roerder bij 4 °C.
      OPMERKING: Als het eiwit op een andere manier wordt gezuiverd, voer dan de bufferuitwisseling dienovereenkomstig uit.
    7. Om de His6-tag te verwijderen, voegt u tabak etch virus (TEV) protease (1:100 verhouding van TEV:FoxP1) toe aan de dialyse 's nachts.
      OPMERKING: Zijn6-tag digestie kan ook worden uitgevoerd door on-column TEV protease digestie toe te voegen. Deze stap zou de opbrengst van het eiwit van belang verbeteren.
    8. Herhaal de volgende dag de stappen van 5.2.3-5.2.5. Elimineer deze keer echter het eiwit in de wasbuffer in plaats van in de elutiebuffer.
    9. Concentreer het eiwit tot een geschikt volume door PBS-buffer toe te voegen en kwantificeer het eiwit met behulp van absorptie bij 280 nm, rekening houdend met de extinctiecoëfficiënt van het eiwit.
  3. Recombinante FoxP1-etikettering
    1. Incubeer 50-100 μM FoxP1-eiwit met een 10-voudige molaire overmaat van ofwel Dithiothreitol (DTT) of tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) met een eindvolume van 500 μL bij RT gedurende 30 minuten.
    2. Voer buffervervanging uit met behulp van PD 10 ontziltingskolommen. Plaats de PD10-kolom in een centrifugebuis van 50 ml met behulp van een kolomadapter.
    3. Breng de PD10-kolom in evenwicht door 5 ml PBS-buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1000 × g . Herhaal deze stap 3 keer.
    4. Bewaar de PD10-kolom in een verse buis van 50 ml en voeg 2 ml PBS-buffer toe aan de kolom. Voeg vervolgens 500 μL FoxP1-eiwit uit stap 1 toe aan de kolom. Elueer het eiwit door 1000 × g gedurende 2 minuten te centrifugeren en verzamel het eiwit.
    5. Concentreer het eiwit door het toe te voegen aan ultracentrifugaalfilters (10 kDa MWCO), centrifugeer gedurende 10 minuten bij 7500 × g en vang het elute op.
    6. Meet de eiwitconcentratie, voeg BODIPY met 30% equivalent cysteïneconcentratie toe aan het eiwit en plaats het 2 uur op een rotator bij 4 °C.
    7. Voer bufferuitwisseling uit en concentreer het eiwit zoals besproken in de stappen 5.3.2-5.3.5.
    8. Controleer de eiwitconcentratie met behulp van een spectrofotometer of een colorimetrische test, zoals de Bradford- of Lowry-methode, en de concentratie van de kleurstof door absorptie bij 500 nm.
    9. Meet de mate van etikettering met behulp van de volgende formule:
      (AKleurstof/εKleurstof)/(molecuulgewicht van eiwit/milligram eiwit per milliliter) = mol kleurstof/mol eiwit
      Waarbij ADye en εDye respectievelijk de absorptiewaarde van de kleurstof en de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof bij de maximale absorptiegolflengte zijn,59. Bij meting bij 280 nm moet de werkelijke absorptie van het eiwit worden gecorrigeerd met de volgende formule:
      Eeneiwit = A280-(Eenkleurstof· CF280)
      Waarbij CF280 de correctiefactor is voor de gespecificeerde kleurstof, rekening houdend met de intrinsieke absorptiecottie bij 280 nm59.
      OPMERKING: Hoewel we ons concentreren op de expressie en zuivering van een cysteïne-gemodificeerd eiwit, moet er zorgvuldig worden nagedacht over de strategische introductie van cysteïneresiduen in het eiwit.

6. De voorbereiding van de de kamergrootte van de microscoopsteekproef

  1. Voeg 495 μL ultrazuiver water en 5 μL (0,01% v/v eindconcentratie) Tween-20 (niet-ionische oppervlakteactieve stof) toe aan de opening van een kamerdia en meng. Incubeer meer dan 30 minuten bij RT.
  2. Was de kamer twee keer voorzichtig met ultrazuiver water en droog hem af.
    OPMERKING: De kamer is klaar voor gebruik voor het experiment.

7. Experiment met fluorescentie-anisotropie met één molecuul

  1. Kalibreer eerst het smFA-instrument. Bepaal de responsfunctie van het instrument, hetzij door het verstrooid licht van Raman te meten, hetzij door de fluorescentie te meten van een kleurstof met een korte levensduur en een geschikt emissiespectrum (bijv. erytrosine of malachietgroen) dat bovendien wordt gedoofd door een verzadigde kaliumjodide, KI-oplossing.
  2. Om te corrigeren voor achtergrondfluorescentie, voert u metingen uit van een bufferoplossing. Kalibreer de relatieve gevoeligheid van de parallelle en loodrechte detectoren (G-factor) door gegevens te verkrijgen van een snel roterende kleurstof. Hier werd 2 nM Rhodamine 110 gebruikt om de detectoren60 te kalibreren.
  3. Voor smFA-experimenten met monomeer FoxP1 voegt u 100 pM BODIPY-gelabeld FoxP1 en 100 nM niet-gelabeld FoxP1 toe aan 500 μL standaardbuffer (20 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7,8) in een kamerglaasje.
  4. Voor titratietest met DNA en monomeer FoxP1 voegt u 400 nM DNA toe aan een 100 pM BODIPY-gelabelde/100 nM niet-gelabelde eiwitmix en incubeert u gedurende 10 minuten bij RT.
  5. Voor smFA-experimenten op dimeer FoxP1, voeg 500 nM niet-gelabelde FoxP1 toe aan een 100 pM BODIPY-gelabelde FoxP1 in de standaardbuffer. Incubeer vervolgens 30 minuten bij 37 °C.
  6. Voor titratiebepaling met DNA en dimeer FoxP1 voegt u 2000 nM DNA toe aan een 100 pM BODIPY-gelabelde/500 nM niet-gelabelde eiwitmix en incubeert u gedurende 10 minuten bij RT.
  7. Start de metingen en controleer in de BIFL-software of het aantal bursts in een record van 30 s tussen de 60-90 ligt. Als het monster meer geconcentreerd is, verdun het dan totdat het die waarde bereikt. Deze stap zorgt voor omstandigheden met één molecuul.
  8. Begin met smFA bij elke meting voor monomeer FoxP1 of dimeer FoxP1 in afwezigheid of aanwezigheid van DNA gedurende ten minste 4 uur.
  9. Analyseer de smFA-metingen zoals besproken in sectie 4.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie-anisotropie komt voort uit de relatieve oriëntatie van de absorptie van de fluorofoor en de emissiedipoolmomenten. Wanneer fluoroforen worden blootgesteld aan gepolariseerd licht, worden fluoroforen met absorptieovergangsmomenten die zijn uitgelijnd met de elektrische veldvector van het invallende licht bij voorkeur geëxciteerd (fotoselectie). Bijgevolg raakt de populatie in geëxciteerde toestand gedeeltelijk georiënteerd, waarbij een aanzienlijk deel van de geëxciteerde moleculen hun overgangsmomenten hebben uitgelijnd met de elektrische veldvector van het gepolariseerde opwindende licht61. Fluoroforen roteren als gevolg van hun Brownse beweging. Het emissieovergangsmoment roteert dus ook, wat resulteert in tijdsafhankelijkheid van fluorescentie-anisotropie. Dit effect kan worden gebruikt om de rotatiebewegingen van fluorescerende moleculen te meten, bindingsgebeurtenissen te detecteren, de omgeving van de fluorofoor te karakteriseren en moleculaire dynamiek vast te leggen.

Experimenten met één molecuul zijn uniek in staat om de heterogeniteit van het monster te bepalen. Door gebruik te maken van gevoeligheid voor één molecuul en fluorescentie-anisotropie wordt een andere dimensionaliteit toegevoegd aan multiparameterfluorescentiespectroscopie. In een typische confocale microscoop met één molecuul (Figuur 2)20,21 kan fluorescentie-anisotropie worden bepaald via intensiteit of tijdopgelost wanneer gepulseerde lasers worden gebruikt.

Om de depolariserende effecten van het objectief met hoge numerieke apertuur in een confocale microscoop62 te beschouwen, wordt de juiste vorm van de in de tijd opgeloste anisotropie 35,63 gegeven door

figure-results-1(1)

waarbij figure-results-2 en figure-results-3 zijn de in de tijd opgeloste fluorescentie-intensiteit in het y-de detectiekanaal na excitatie bij de golflengte x, voor de parallelle en loodrechte polarisatie l1 en l2 en zijn factoren die de vermenging tussen de parallelle en loodrechte signalen beschrijven als gevolg van het objectief met hoge numerieke apertuur (NA) dat bij deze metingen wordt gebruikt35,62, 64. okt. Verschillen in detectie-efficiëntie van het parallelle, figure-results-4, en loodrechte detectiekanaal, figure-results-5, voor de kleurstof worden gecorrigeerd met de verhouding van de detectie-efficiëntie, figure-results-6. De GUV wordt ook wel de G-factor genoemd.

De in de tijd opgeloste fluorescentie-anisotropie kan worden gemodelleerd met behulp van een multi-exponentieel verval om rekening te houden met het feit dat de fluorofoor aan een groter biomolecuul is gehecht als

figure-results-7,     (2)

waarbij r0 fluorofoorafhankelijke fundamentele anisotropie is (typisch r0 = 0,38), r∞ de resterende anisotropie is, en ρ1 en ρ2 respectievelijk snelle (lokale bewegingen van de fluorofoor) en langzame (globale beweging van het macromolecuul) rotatiecorrelatietijden zijn.

Bij anisotropiemetingen met één molecuul (Figuur 2) worden de aankomsttijden van fotonen geregistreerd om individuele zenders te identificeren met behulp van burst-geïntegreerde fluorescentielevensduur (BIFL)-analyse33,35. De aankomsttijden tussen fotonen (Δt) worden afgevlakt met behulp van een lopend gemiddelde en vervolgens uitgezet om de visualisatie te vergemakkelijken. Het histogram van deze tijden is voorzien van een halve Gaussiaanse om het gemiddelde en de standaarddeviatie van fotonen afkomstig van de achtergrond te bepalen. Een willekeurige drempel, ingesteld op veelvouden van de standaarddeviatie, wordt gebruikt om individuele gebeurtenissen uit te filteren en tegelijkertijd de eerste en laatste fotonen in elke burst te identificeren. Fotonen in elke burst worden vervolgens geïntegreerd voor verdere analyse, waaronder het berekenen van tijdopgeloste en op intensiteit gebaseerde steady-state fluorescentie-anisotropie met behulp van vergelijkingen 1 en 2 of via een maximale waarschijnlijkheidsschatter35. Vanwege het beperkte aantal fotonen in gebeurtenissen met één molecuul, houdt de maximale waarschijnlijkheidsschatter slechts rekening met een enkele exponentiële component en zal deze niet verder worden besproken.

In een tweedimensionaal histogram van gebeurtenissen met één molecuul kunnen de gemiddelde fluorescentielevensduur (τ) en anisotropie (rxy) in verband worden gebracht door Perrin's vergelijking29,61 voor het verkrijgen van (ρ) als gemiddelde rotatietijd.

figure-results-8(3)

Specifieke ρ-waarden kunnen met grotere zekerheid worden verkregen door "sub-ensemble" (se) analyse waarbij de fotonen van verschillende uitbarstingen worden geïntegreerd in een gecombineerd tijdopgelost fluorescentie-anisotropieverval dat kan worden geanalyseerd door de parameters van vergelijking 2 te optimaliseren voor het experimentele verval (seTRFA). Tijdopgeloste anisotropie kan heterogeniteit en dynamiek oplossen die verband houden met rotatiebewegingen (lokaal en globaal) van de biomoleculen binnen de emissie van fluorescentie die optreedt binnen het ns-tijdsbestek.

Om dynamiek binnen gebeurtenissen met één molecuul (op de submillisecondeschaal) te detecteren, introduceerden we tijdopgeloste anisotropie Burst Variance Analysis (traBVA)57. In traBVA is voor een fotonuitbarsting die Mi opeenvolgende fotonsegmenten bevat, de overtollige anisotropievariantie (s2) voor uitbarstingen

figure-results-9.     (4)

Voor een enkele anisotrope toestand komt de variantie σ2 uitsluitend voort uit opnameruis65 (sn: √N, waarbij N het aantal fotonen is)

figure-results-10(5)

waarbij m het aantal fotonen in een burst is. Om extra variantie in de anisotropie te identificeren, kunnen we dus de overmatige anisotropievariantie (S2) als gevolg van conformationele heterogeniteit definiëren als het verschil tussen vergelijking 4 en 5.

figure-results-11(6)

Om de dynamiek vast te leggen die optreedt bij de waarneming van individuele moleculen en om de variantiebenadering in overweging te nemen, kan dynamische anisotropie Photon Distribution Analysis (daPDA)55,56 worden gebruikt. In daPDA wordt de fluorescentie-intensiteit gemodelleerd door een voorwaardelijke waarschijnlijkheid (figure-results-12) te volgen, uitgedrukt als een binomiale verdeling.

figure-results-13(7)

Samen met een schatting van de achtergrondtelling die volgt op een Poisson-verdeling

figure-results-14(8)

Waar figure-results-15 is het gemiddelde aantal achtergrondfotonen per ingesteld tijdvenster. De parallelle en loodrechte achtergrondtellingen, figure-results-16 en figure-results-17, kunnen worden gemeten met behulp van buffermonsters als referentie. De experimenteel bepaalde fluorescentie-anisotropie wordt geoptimaliseerd door een cijfer van verdienste χ2 te minimaliseren met een fluorescentie-intensiteitsverdeling per polarisatiekanaal die kinetische veranderingen kan omvatten.

De verstrekte analyseroutines en gegevensrepresentaties bieden een alomvattende benadering voor het interpreteren van de verzamelde gegevens. Hoewel dit protocol zich voornamelijk richt op confocale metingen, die beperkt zijn tot het vastleggen van anisotropieveranderingen van nanoseconden tot milliseconden, is het mogelijk om een Total Internal Reflection-microscoop te gebruiken om fluorescentie-anisotropie over langere tijdschalen te volgen, waardoor tijdreeksanalyse mogelijk is66. Voor confocale metingen met één molecuul benadrukken we het gebruik van multidimensionale histogrammen die een unieke vingerafdruk van het waargenomen ensemble creëren. In de tijd opgelost fluorescentieverval, gereconstrueerd uit geselecteerde populaties, kan de evolutie van fluorescentie-anisotropie op nanosecondeschaal volgen (Figuur 3). Fotonverdelingsanalyse55,56 en burst-variantieanalyse (BVA)57,58 kunnen ook dynamiek vastleggen op tussenliggende tijdschalen tussen in de tijd opgelost verval en multidimensionale histogrammen. Hoewel dit protocol geen betrekking heeft op het gebruik van polarisatiefluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS), met of zonder gepulseerde excitatie67,68, die de tijdschalen van nanoseconde tot milliseconde kan overbruggen, kunnen dezelfde gegevens worden gebruikt om FCS69 te berekenen, hoewel dit buiten het bestek van het gepresenteerde protocol valt. Als dergelijke experimenten worden uitgevoerd, wordt een langere meettijd van het monster aanbevolen.

Deze benadering is toegepast op een complex systeem zoals de menselijke FoxP-eiwitten, wat waardevolle inzichten oplevert in de bewegingen die betrokken zijn bij hun werkingsmechanisme. FoxP-eiwitten zijn transcriptiefactoren die betrokken zijn bij verschillende fysiologische aspecten, zoals de ontwikkeling van hersenen en longen; Belangrijk is dat verschillende mutaties zijn erkend die de functie van deze eiwitten aantasten70,71. Met behulp van het DNA-bindende domein van FoxP1 als model, genereerden we verschillende single-cysteïne-mutanten om een BODIPY-FL-kleurstof te introduceren als tracker voor bewegingen (Figuur 4A). In feite hebben we het effect van dimerisatie en de DNA-binding geëvalueerd als belangrijke structurele regulatoren van dit eiwit. Met behulp van de smFA-benadering hebben we 2D-smFA-plots gegenereerd en traBVA en daPDA gemaakt voor elke mutant in monomere en dimere omstandigheden. We laten een voorbeeld zien van een van de bestudeerde mutanten (Figuur 4). Het anisotropiegedrag is bij alle mutanten vergelijkbaar in termen van het bepalen van hoge en lage rotatiecorrelatietijden en, daarom, vermoedelijke, ongeordende en gevouwen ensembles. Toch is het ook zeer heterogeen in alle mutanten in termen van de breuk en kinetiek van elk ensemble, wat verschillende veranderingen in de overgang van orde naar wanorde aantoont die worden beïnvloed door de dimerisatie en de DNA-binding, en toont de beschrijving met hoge resolutie van de structurele dynamiek langs de keten (Figuur 5).

figure-results-18
Figuur 1: Dynamisch bereik van biomoleculen en fluorescentie-anisotropiemethoden. (A) De anisotropie van kleine fluoroforen die op verschillende posities langs de ruggengraat van het biomolecuul van belang zijn vastgemaakt, informeert de lokale structurele dynamiek. (B) Tijdschalen onderzocht op basis van fluorescentie-intensiteitsverval (tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie, FA) en histogrammen van één molecuul van confocale microscoopgegevens met één molecuul. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-19
Figuur 2: Registratie en verwerking van anisotropiegegevens van fluorescentie met één molecuul. (A) Vrij diffuse moleculen worden geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop met één molecuul die is uitgerust met een enkele lineair gepolariseerde excitatielaser (blauw in ons geval). Fluorescentie-emissie (groen in ons geval) wordt gedetecteerd door twee detectoren nadat een bundelpolarisator het signaal in twee polarisaties heeft gesplitst (parallel, figure-results-20, en loodrecht, figure-results-21, op de excitatiebron). (B) Elk gedetecteerd foton wordt gekenmerkt door drie parameters: microtijd, macrotijd en kanaaltype. De gegevens worden opgeslagen in een Time-Tagged Time-Resolved (TTTR) formaat72. (C) Bursts van individuele moleculen worden geselecteerd en verwerkt om fluorescentieparameters te extraheren, inclusief fluorescentie-anisotropie voor elk waargenomen molecuul. (D) Gegevens worden op meerdere manieren weergegeven, waaronder tweedimensionale grafieken van fluorescentie-anisotropie versus fluorescentielevensduur en in de tijd opgelost anisotropieverval. Deze representaties maken zowel visuele als kwantitatieve bepaling van fluorescentielevensduur, rotatiecorrelatietijden en systeemheterogeniteit mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-22
Figuur 3: Representatieve gegevens voor FoxP1 domain-swapped dimeer. (A) Correlatie van de fluorescentie-anisotropie (r-spreiding) tegen de gemiddelde fluorescentielevensduur per molecuul als een contourgrafiek. Overlay van een enkele Perrin-vergelijking voor twee rotatiecomponenten als representatief voor het ensemblegemiddelde van het molecuul, rekening houdend met ρ1 en ρ2 van respectievelijk 0,2 ns en 8,5 ns. (B) Sub-ensemble tijdopgeloste fluorescentieverval wordt gebruikt om de tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van het monster te berekenen. Fit met vergelijking 2 loste de lokale en globale componenten van fluorescentie-anisotropie op. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-23
Figuur 4: Sub-milliseconde FoxP1-dynamiek gemonitord met behulp van single-molecule fluorescentie-anisotropie (smFA). (A) Een cartoonweergave van de monomere FoxP1-structuur. (B) Een tweedimensionaal histogram illustreert dynamische heterogeniteit en onthult twee verschillende rotatiecorrelatietijden die worden geïdentificeerd door middel van in de tijd opgeloste fluorescentie-anisotropie. Tijdopgeloste anisotropie Burst Variance Analysis (traBVA) onthult een kleine subset van gebeurtenissen met overmatige variantie (Eq. 6) die grote anisotropie vertonen. Kwantitatieve dynamische anisotropieanalyse met behulp van Photon Distribution Analysis (PDA) extraheert verder de wisselkoersen voor dit proces. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-24
Figuur 5: Screening van de lokale en globale bewegingen van FoxP1 tijdens dimerisatie. (A) Een cartoonweergave vergelijkt de monomere FoxP1 met zijn dimeervorm. (B) De gemiddelde overschrijding van de variantie per locatie onder monomere en dimere omstandigheden wordt weergegeven, waarbij een grotere overschrijding wijst op meer significante veranderingen in anisotropie. (C) Dynamische anisotropieanalyse met behulp van Photon Distribution Analysis (PDA) helpt bij het bepalen van populatiefracties (hoge anisotropie in donkere kleuren en lage anisotropie in lichte kleur) in afwezigheid (groen) en aanwezigheid (geel) van DNA. In deze benadering werden percentages (niet weergegeven) geschat voor overgangen tussen lokaal en wereldwijd gedrag, waaruit blijkt dat FoxP1 een gedeeltelijke ontvouwing ondergaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor experimenten met fluorescentie-anisotropie met één molecuul is het van cruciaal belang om de fotofysische eigenschappen van de gekozen fluorofoor zorgvuldig te overwegen. Deze eigenschappen omvatten de emissiegolflengte, die moet worden uitgelijnd met het detectiesysteem, en de excitatiegolflengte, die compatibel moet zijn met de beschikbare gepulseerde lasers. Om het dynamisch bereik te optimaliseren, moet de fluorofoor een lange fluorescentielevensduur hebben ten opzichte van de rotatiediffusietijd van het molecuul. Dit is van cruciaal belang voor het volgen van de rotatiedynamiek en de koppeling/oriëntatie van de dipool van de fluorofoor ten opzichte van het biomolecuul van belang. Bovendien zijn helderheid, fotostabiliteit en kwantumopbrengst essentieel voor het produceren van sterke signalen met een stabiele signaal-ruisverhouding. Om deze redenen is BODIPY-FL in verschillende onderzoeken gekozen als fluorofoor 39,40,42.

Het screenen van de dynamiek van de ruggengraat van biomoleculen vereist vaak eiwitlabeling, meestal bereikt door plaatsspecifieke labeling. Dit wordt meestal gedaan door een residu in te brengen voor gerichte chemische modificatie. De meest gebruikelijke benadering is het introduceren van cysteïnen op interessante posities, waar hun thiolzijketens selectief kunnen worden gemodificeerd met reagentia zoals maleimiden of jodoacetamiden. Minder vaak worden benzylzuurhalogeniden en broommethylketonen gebruikt om thioetherbindingen te vormen. Andere aminozuurzijketens kunnen ook het doelwit zijn, maar hun overvloed aan eiwitten wordt minder vaak gebruikt. Alternatieve benaderingen, zoals onnatuurlijke aminozuren, kunnen echter ook worden gebruikt73. De juiste locatiekeuze voor etikettering is cruciaal om interferentie met het bestudeerde biomolecuul tot een minimum te beperken, en de juiste controles moeten aanwezig zijn. Als het gelabelde molecuul bijvoorbeeld wordt gebruikt in bindingstesten, moeten complementaire labelvrije methoden verifiëren dat de fluoroforen geen invloed hebben op de bindingsaffiniteit.

Na het identificeren van het juiste monster en het implementeren van de optimale labelstrategie, is de volgende stap ervoor te zorgen dat de confocale microscoop correct is uitgelijnd en gekalibreerd voor experimenten met één molecuul. In het protocol staat beschreven hoe de benodigde factor voor verdere analyse moet worden bepaald. Zodra het instrument is gekalibreerd, is de volgende stap het meten van het monster en het verwerken van de gegevens om zoveel mogelijk informatie uit de gedetecteerde fotonen te halen. De belangrijkste parameters, zoals microtijd, macrotijd en kanaaltype, zoals weergegeven in figuur 2, kunnen worden gebruikt voor verdere analyse en visualisatie met behulp van typische TCSPC-elektronica.

Recente ontwikkelingen in single-molecule fluorescentiespectroscopie kunnen op grote schaal worden gebruikt om structurele informatie van de heterogene ensembles van biomoleculen te bestuderen. Er zijn echter relatief weinig studies die gebruikmaken van de inzichten van fluorescentie-anisotropie, en er is een compleet eiwitmodel nodig om de structurele dynamiek van biomoleculen af te leiden. Daarom is het ontrafelen van de dynamiek van interdomein en eiwit-eiwit interacties van verschillende transcriptiefactoren een uitdaging.

Concluderend bieden experimenten met fluorescentie-anisotropie met één molecuul aanvullende informatie over de lokale en globale bewegingen van de biomoleculaire ruggengraat, die van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van de functie ervan.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben met de inhoud van dit artikel.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door FONDECYT-beurzen 11200729 en FONDEQUIP-EQM200202 aan E.M., NIH R15CA280699 R01GM151334 en NSF CAREER MCB 1749778 awards aan HS. NK erkende de steun van het Clemson University Postdoctoral fellowship-programma.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488ThermoFisher ScienctificA20100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC901008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010
Ampicillin sodium saltMillipore SigmaA0166-5Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166
BODIP FL Maleimide (BODIPY FL N-(2-Aminoethyl))Maleimide)ThermoFisher ScienctificB10250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250
Disposable PD 10 Desalting ColumnsMillipore SigmaGE17-0851-01https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101
DithiothreitolMillipore Sigma10197777001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScienctificD12345https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345
DNAseMillipore Sigma10104159001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001
E. coli C41 bacterial cells Invitrogen
Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, 5 mL columnBio-Rad12004037https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037
HEPESMillipore Sigma7365-45-9https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375
ImidazoleMillipore Sigma288-32-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513
IPTGMillipore SigmaI6758-1Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758
MCE Membrane Filter, 0.22 µm Pore SizeMillipore SigmaGSWP02500https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500
NaClMillipore Sigma7647-14-5https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemThermoFisher Scienctific154534https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent CellsMillipore SigmaCMC0017-20X40ULhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017
PMSFMillipore Sigma329-98-6https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830
Rhodamine 110ThermoFisher Scienctific419075000https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000
Sodium phosphate dibasicMillipore Sigma7558-79-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264
Sodium phosphate monobasic dihydrateMillipore Sigma13472-35-0https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505
TCEP, Hydrochloride, Reagent GradeMillipore Sigma580567-5GMhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567
Tween 20Millipore Sigma11332465001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, A. Thermodynamic fluctuations in protein molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (8), 2740-2741 (1976).
  2. Volozhin, S. I. Inguinal hernia in cryptorchism. Khirurgiia (Mosk). 450 (7), 69-71 (1975).
  3. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838-844 (2007).
  4. Karplus, M., Mccammon, J. A. The internal dynamics of globular-proteins. CRC Crit Rev Biochem. 9 (4), 293-349 (1981).
  5. Ishima, R., Torchia, D. A. Protein dynamics from nmr. Nat Struct Biol. 7 (9), 740-743 (2000).
  6. Fernandez, F. J., Querol-Garcia, J., Navas-Yuste, S., Martino, F., Vega, M. C. X-ray crystallography for macromolecular complexes. Adv Exp Med Biol. 3234, 125-140 (2024).
  7. Bai, X. C., Mcmullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  8. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically unstructured proteins: Re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. 293 (2), 321-331 (1999).
  9. Tompa, P. Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. 27 (10), 527-533 (2002).
  10. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (3), 197-208 (2005).
  11. Csermely, P., Palotai, R., Nussinov, R. Induced fit, conformational selection and independent dynamic segments: An extended view of binding events. Trends Biochem Sci. 35 (10), 539-546 (2010).
  12. Camacho-Zarco, A. R., et al. NMR provides unique insight into the functional dynamics and interactions of intrinsically disordered proteins. Chem Rev. 122 (10), 9331-9356 (2022).
  13. Drenth, J. Principles of Protein X-Ray Crystallography. , Springer, Verlag. New York, NY. (2007).
  14. Loeb, H. Systematic diagnosis of chronic diarrhea in infants and small children. Kinderarztl Prax. 44 (1), 36-41 (1976).
  15. Ellaway, J. I. J., et al. Identifying protein conformational states in the protein data bank: Toward unlocking the potential of integrative dynamics studies. Struct Dyn. 11 (3), 034701(2024).
  16. Berjanskii, M. V., Wishart, D. S. A simple method to predict protein flexibility using secondary chemical shifts. J Am Chem Soc. 127 (43), 14970-14971 (2005).
  17. Puthenveetil, R., Vinogradova, O. Solution NMR: A powerful tool for structural and functional studies of membrane proteins in reconstituted environments. J Biol Chem. 294 (44), 15914-15931 (2019).
  18. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule fret measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  19. Weidtkamp-Peters, S., et al. Multiparameter fluorescence image spectroscopy to study molecular interactions. Photochem Photobiol Sci. 8 (4), 470-480 (2009).
  20. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. M. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  21. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for fret-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  22. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. aM. Combining graphical and analytical methods with molecular simulations to analyze time-resolved fret measurements of labeled macromolecules accurately. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  23. Hamilton, G. L., Sanabria, H. Multiparameter Fluorescence Spectroscopy of Single Molecules. Spectroscopy and Dynamics of Single Molecules. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  24. Kolimi, N., et al. Out-of-equilibrium biophysical chemistry: The case for multidimensional, integrated single-molecule approaches. J Phys Chem B. 125 (37), 10404-10418 (2021).
  25. Felekyan, S., Sanabria, H., Kalinin, S., Kuhnemuth, R., Seidel, C. A. Analyzing forster resonance energy transfer with fluctuation algorithms. Methods Enzymol. 519, 39-85 (2013).
  26. Medina, E. D. R. L., Sanabria, H. Unraveling protein's structural dynamics: From configurational dynamics to ensemble switching guides functional mesoscale assemblies. Curr Opin Struct Biol. 66, 129-138 (2021).
  27. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (37), E5389-E5398 (2016).
  28. Gomes, G. W., et al. Conformational ensembles of an intrinsically disordered protein consistent with NMR, SAXS, and single-molecule fret. J Am Chem Soc. 142 (37), 15697-15710 (2020).
  29. Perrin, F. Polarisation de la lumière de fluorescence. Vie moyenne des molécules dans l'etat excité. J phys radium. 7 (12), 390-401 (1926).
  30. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. I. Theory and experimental method. Biochem J. 51 (2), 145-155 (1952).
  31. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. II. Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochem J. 51 (2), 155-167 (1952).
  32. Jameson, D. M., Ross, J. A. Fluorescence polarization/anisotropy in diagnostics and imaging. Chem Rev. 110 (5), 2685-2708 (2010).
  33. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Gunther, R., Seidel, C. A. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  34. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. aM. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  35. Schaffer, J., et al. Identification of single molecules in aqueous solution by time-resolved fluorescence anisotropy. Journal of Physical Chemistry A. 103 (3), 331-336 (1999).
  36. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  37. Gradinaru, C. C., Marushchak, D. O., Samim, M., Krull, U. J. Fluorescence anisotropy: From single molecules to live cells. Analyst. 135 (3), 452-459 (2010).
  38. Mazal, H., Haran, G. Single-molecule fret methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).
  39. Tsytlonok, M., et al. Specific conformational dynamics and expansion underpin a multi-step mechanism for specific binding of p27 with cdk2/cyclin a. J Mol Biol. 432 (9), 2998-3017 (2020).
  40. Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by cdk2/cyclin a-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nat Commun. 10 (1), 1676(2019).
  41. Cruz, P., et al. Domain tethering impacts dimerization and DNA-mediated allostery in the human transcription factor foxp1. J Chem Phys. 158 (19), (2023).
  42. Kolimi, N., et al. DNA controls the dimerization of the human foxp1 forkhead domain. Cell Rep Phys Sci. 5 (3), 101854(2024).
  43. Yanez Orozco, I. S., et al. Identifying weak interdomain interactions that stabilize the supertertiary structure of the n-terminal tandem PDZ domains of PSD-95. Nat Commun. 9 (1), 3724(2018).
  44. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  45. Rigler, R., Elson, E. S. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Theory and Applications. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2012).
  46. Aragon, S. R., Pecora, R. Fluorescence correlation spectroscopy as a probe of molecular-dynamics. J Chem Phys. 64 (4), 1791-1803 (1976).
  47. Mockel, C., et al. Integrated NMR, fluorescence, and molecular dynamics benchmark study of protein mechanics and hydrodynamics. J Phys Chem B. 123 (7), 1453-1480 (2019).
  48. Shu, W., Yang, H., Zhang, L., Lu, M. M., Morrisey, E. E. Characterization of a new subfamily of winged-helix/forkhead (Fox) genes that are expressed in the lung and act as transcriptional repressors. J Biol Chem. 276 (29), 27488-27497 (2001).
  49. Co, M., Anderson, A. G., Konopka, G. Foxp transcription factors in vertebrate brain development, function, and disorders. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (5), e375(2020).
  50. Takahashi, H., Takahashi, K., Liu, F. -C. FOXP Genes, Neural Development, Speech and Language Disorders. Forkhead Transcription Factors: Vital Elements in Biology and Medicine. , Springer. New York, NY. (2009).
  51. Wang, B., Lin, D., Li, C., Tucker, P. Multiple domains define the expression and regulatory properties of foxp1 forkhead transcriptional repressors. J Biol Chem. 278 (27), 24259-24268 (2003).
  52. Leake, M. C., Quinn, S. D. A guide to small fluorescent probes for single-molecule biophysics. Chem Phys Rev. 4 (1), 011302(2023).
  53. Zhang, H., Wu, Q., Berezin, M. Y. Fluorescence anisotropy (polarization): From drug screening to precision medicine. Expert Opin Drug Discov. 10 (11), 1145-1161 (2015).
  54. Ma, J., et al. High precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination. J Vis Exp. (123), e55623(2017).
  55. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. J Phys Chem B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  56. Mcgeer, P. L., Mcgeer, E. G. Enzymes associated with the metabolism of catecholamines, acetylcholine and gaba in human controls and patients with parkinson's disease and huntington's chorea. J Neurochem. 26 (1), 65-76 (1976).
  57. Terterov, I., Nettels, D., Makarov, D. E., Hofmann, H. Time-resolved burst variance analysis. Biophys Rep (N Y). 3 (3), 100116(2023).
  58. Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule fret experiments with burst variance analysis. Biophys J. 100 (6), 1568-1577 (2011).
  59. Haugland, R. P. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Molecular Probes. , (2005).
  60. Medina, E., et al. Intrinsically disordered regions of the DNA-binding domain of human foxp1 facilitate domain swapping. J Mol Biol. 432 (19), 5411-5429 (2020).
  61. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York, NY. (2007).
  62. Koshioka, M., Sasaki, K., Masuhara, H. Time-dependent fluorescence depolarization analysis in three-dimensional microspectroscopy. Appl Spectrosc. 49 (2), 224-228 (1995).
  63. Kudryavtsev, V., et al. Combining mfd and pie for accurate single-pair forster resonance energy transfer measurements. Chemphyschem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  64. Van Zanten, T. S., Greeshma, P. S., Mayor, S. Quantitative fluorescence emission anisotropy microscopy for implementing homo-fluorescence resonance energy transfer measurements in living cells. Mol Biol Cell. 34 (6), tp1(2023).
  65. Laine, R. F., Jacquemet, G., Krull, A. Imaging in focus: An introduction to denoising bioimages in the era of deep learning. Int J Biochem Cell Biol. 140, 106077(2021).
  66. Strohl, F., Wong, H. H. W., Holt, C. E., Kaminski, C. F. Total internal reflection fluorescence anisotropy imaging microscopy: Setup, calibration, and data processing for protein polymerization measurements in living cells. Methods Appl Fluoresc. 6 (1), 014004(2017).
  67. Loman, A., Gregor, I., Stutz, C., Mund, M., Enderlein, J. Measuring rotational diffusion of macromolecules by fluorescence correlation spectroscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (5), 627-636 (2010).
  68. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem Phys Lett. 353 (5-6), 439-445 (2002).
  69. Peulen, T. -O., et al. Tttrlib: Modular software for integrating fluorescence spectroscopy, imaging, and molecular modeling. arXiv. , (2024).
  70. Le Fevre, A. K., et al. Foxp1 mutations cause intellectual disability and a recognizable phenotype. Am J Med Genet A. 161A (12), 3166-3175 (2013).
  71. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in foxp1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87 (5), 671-678 (2010).
  72. Wahl, M., Orthaus-Müller, S. Time tagged time-resolved fluorescence data collection in life sciences. , https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2014).
  73. Lemke, E. A. Site-specific labeling of proteins for single-molecule fret measurements using genetically encoded ketone functionalities. Methods Mol Biol. 751, 3-15 (2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van enkelvoudige moleculenconfocale microscopieFoxP1 dimerisatieDNA bindingsdynamiekburst variantieanalysefotonverdelingsanalyseeiwitmarkeringstructurele dynamiektijdopgeloste metingen

Gerelateerde artikelen