Hier presenteren we een protocol voor het vervaardigen van gekanaliseerde agarpads met behulp van PDMS-mallen gemaakt van vinylplaten. De kanalen stellen gebruikers in staat om Caenorhabditis elegans fijn te oriënteren om het beeldcontrast te verbeteren en de vergelijking van structuren te vergemakkelijken. Deze mogelijkheden zijn vooral nuttig in neuroregeneratiestudies.
Methodenartikel
Fijnafstelling van de oriëntatie van Caenorhabditis elegans op gekanaliseerde agarpads voor beeldvorming van neuroregeneratie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Caenorhabditis elegans is een modelorganisme dat veel wordt gebruikt voor het bestuderen van biologische processen. De transparantie en het kleine formaat maken het ideaal voor het afbeelden van weefsels, cellen en subcellulaire structuren. Traditionele platte agarpads voor het afbeelden van C. elegans beperken de controle over de oriëntatie van het dier, waardoor het zicht voornamelijk wordt beperkt tot zijperspectieven. Deze beperking bemoeilijkt de visualisatie van dorsaal-ventrale structuren en vermindert de helderheid van het beeld, vooral bij oudere dieren met verhoogde pigmentatie en grotere diameters. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we gekanaliseerde agarosepads ontwikkeld die een nauwkeurige controle van de oriëntatie van het dier mogelijk maken. Deze kanalen stellen onderzoekers in staat om C. elegans in gespecificeerde posities te roteren en te fixeren, waardoor de gelijktijdige beeldvorming van meerdere structuren wordt vergemakkelijkt en de beeldresolutie wordt verbeterd door doelcellen dichter bij het microscoopdoel te brengen. Dit is met name handig voor het in beeld brengen van geregenereerde neuronale vezels na een operatie, die kunnen groeien in richtingen die moeilijk vast te leggen zijn met traditionele platte agarpads. Deze methode is toegankelijk, omdat het vervaardigen van gekanaliseerde agarpads dezelfde tijd en materialen vereist als platte pads, waardoor het voor de meeste laboratoria een praktische optie is.
Inleiding
De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een veel gebruikt modelorganisme voor het bestuderen van biologische processen zoals ontwikkeling en gedrag vanwege zijn sterk geconserveerde genetica met tegenhangers van zoogdieren1. Onderzoekers kweken C. elegans op een plaat met nematodengroeimedium (NGM) in een streng gecontroleerde omgeving die experimentele omstandigheden standaardiseert en een nauwkeurigere toeschrijving van resultaten aan experimentele variabelen mogelijk maakt. Het dier is transparant, waardoor weefsels, cellen en subcellulaire structuren duidelijk in beeld kunnen worden gebracht. C. elegans zijn klein, de volwassen dieren zijn ~1 mm lang en 80 μm in diameter, waardoor meerdere dieren op een enkele diabevestiging kunnen worden geplaatst voor beeldvorming1. Hun kleine formaat maakt het ook mogelijk om met een enkel beeld het hele organisme vast te leggen en tegelijkertijd individuele cellen op te lossen, wat cruciaal is voor het visualiseren van de regeneratie van neuronvezels. Synergetisch voor deze voordelen voor microscopie, maken de snelle ontwikkeling, stereotiepe anatomie en gemakkelijke genetica van C. elegans grootschalige studies mogelijk1.
De typische procedure voor beeldvorming van cellen in C. elegans is tientallen jaren geleden vastgesteld en is grotendeels ongewijzigd gebleven. Onderzoekers gebruiken platte agar-pads op dia's om de dieren te monteren en te immobiliseren voor visualisatie van hun cellen2. Een dekglaasje bovenop het kussen houdt de dieren op hun plaats en beschermt de lens van de microscoop. Belangrijk is dat het dekglaasje een hoge brekingsindex heeft die de numerieke opening van opgevangen licht vergroot en de beeldresolutie verbetert. Bovendien vermindert het dekglaasje vervorming in de lichttransmissie. Zo verbetert een dekglaasje de visualisatie van doelcellen en -structuren.
Bij gebruik met een dekglaasje beperken platte agarpads echter vaak de oriëntatie van het dier. C. elegans buigen langs hun dorsaal-ventrale (DV) richting, zodat ze een laterale oriëntatie aannemen op een plat agarkussen. Maar zelfs na het immobiliseren, rechttrekken en voordraaien naar een DV-oriëntatie, zorgt de plaatsing van het dekglaasje ervoor dat bijna alle dieren weer in een zijaanzicht komen (Figuur 1). We denken dat deze heroriëntatie optreedt omdat het dekglaasje de uitstekende C. elegans vulva opzij duwt. Jongere dieren zonder vulva zijn meer willekeurig georiënteerd. Deze beperkte controle over de oriëntatie is om ten minste twee redenen problematisch. Ten eerste is het mogelijk dat twee structuren niet in één gezichtsveld worden geplaatst (bijv. bilateraal), wat hun vergelijking bemoeilijkt. Ten tweede is het instellen van de oriëntatie belangrijk voor het optimaliseren van de beeldkwaliteit, aangezien interessante structuren over het algemeen het beste in beeld kunnen worden gebracht wanneer ze zich dicht bij het doel bevinden. Dit komt omdat objectieven een beperkte diepte binnen het monster in beeld brengen (d.w.z. werkafstand) en omdat het licht van diepere locaties meer verstrooiing en absorptie ervaart.
Voor C. elegans is de beperkte controle over de oriëntatie over het algemeen ernstiger bij oudere dieren. Dieren van L1 tot L4 leeftijd hebben een kleinere diameter, waardoor een groter deel van de worm zichtbaar is. Deze larven hebben ook minder pigmentatie, wat resulteert in een verminderde absorptie van zichtbaar licht en verstrooiing van fotonen, wat de helderheid en resolutie van het beeld verbetert. Omgekeerd hebben volwassen dieren een grotere diameter en meer pigmentatie, wat een uitdaging vormt voor beeldvorming in diepere z-vlakken, aangezien het dekglaasje de initiële oriëntatie beïnvloedt.
In 2008 hebben we een strategie geïntroduceerd met behulp van agarpads met kanalen om deze uitdagingen te overwinnen door de oriëntatie van dieren te behouden 3,4. Zoals hieronder beschreven, roteren gebruikers geïmmobiliseerde dieren in de kanalen naar een gewenste oriëntatie door anatomische oriëntatiepunten op te merken. De kanalen houden dieren vast in holtes tussen verhoogde agar-oppervlakken, waardoor de kracht op het dier tijdens het plaatsen van het dekglaasje wordt geminimaliseerd en rotatie van het dier wordt geëlimineerd. Omdat de fabricage van gekanaliseerde pads en gewone platte pads bijna dezelfde procedure volgt en dezelfde tijd vergt, is onze techniek zeer toegankelijk. Veel laboratoria gebruiken onze techniek om C. elegans te immobiliseren voor het bestuderen van anatomische kenmerken, het observeren van ontwikkeling en het analyseren van neuronale bijdragen aan gedrag 5,6,7,8. In het volgende gedeelte wordt het hele proces beschreven voor het maken van gekanaliseerde agar, te beginnen met een vinylplaat die met een heet mes in vieren werd gesneden. Eerst beschrijven we de fabricage van de polydimethylsiloxaan (PDMS) mal die wordt gebruikt om gekanaliseerde agar te gieten. Vervolgens laten we stap voor stap zien hoe je de gekanaliseerde agar kunt fabriceren. De hele procedure zal naar verwachting 3 uur duren zonder expertise. Na de PDMS-fabricageprocedure hebben pads die met de mal zijn gemaakt dezelfde tijd nodig om te maken als typische agarpads (een paar minuten).
Protocol
1. Polydimethylsiloxaan (PDMS) klaarmaken voor fabricage
- Giet een verhouding van 1:10 van het snelle uithardingsmiddel op de basis in een wegwerpweegschaal. Meng de niet-uitgeharde vloeistof gedurende 45 s tot de vloeistof volledig is geïntegreerd en vol bubbels zit.
- Plaats de bak schuin in een vacuümdroogoven. Wissel de druk 3x tussen -0,09 en -0,1 kPa om luchtbellen naar boven te laten komen.
- Houd het vacuüm ongeveer een uur aan bij een drukbereik van -0,09 tot -0,1 kPa totdat er nog maar weinig zichtbare belletjes zijn, die handmatig kunnen worden verwijderd.
2. Het vervaardigen van PDMS-mal van vinylplaat
- Spoel de vinylplaat en de glasplaat af met gedeïoniseerd (DI) water. Zorg voor de afwezigheid van stof om de beste mal te verkrijgen. Laat de vinylplaat aan de lucht drogen tot gebruik.
- Leg een vel aluminiumfolie op de kookplaat om overtollig PDMS op te vangen.
- Plaats een glasplaat aan elk uiteinde van de vinylplaat om de maldikte in te stellen op de breedte van de glasplaten. Dit zorgt voor een gelijkmatige hoogte bij het drukken van de ruit op het niet-uitgeharde PDMS.
- Giet de niet-uitgeharde PDMS-vloeistof aan één kant van de vinylplaat.
- Observeer luchtbellen met behulp van lichtreflectie van het vloeistofoppervlak en verwijder ze met een pipetpunt. Kantel de glasplaat en breng de plaat langzaam naar beneden zodat er lucht kan ontsnappen en voorkom dat er luchtbellen worden geïntroduceerd.
- Hard de PDMS uit bij 80 °C gedurende 35 minuten.
- Haal de vinylplaat van de kookplaat en laat afkoelen. Trek de PDMS voorzichtig van de vinylplaat om scheuren te voorkomen.
- Gebruik een nieuwe glazen dia als richtlijn om de PDMS met een scherp scheermes door te snijden om een gekanaliseerde agarvorm te maken.
3. Het vervaardigen van gekanaliseerde agarstootkussens met NaN3
OPMERKING: De procedure en materialen voor platte agarpads zijn eerder vastgesteld9. Deze procedure lijkt erg op elkaar.
- Voeg 0,6 g agar en 30 ml NGM vloeistof9 bouillon toe aan een kolf. Voeg een roerstaaf toe en verwarm op een hete plaat op 120 °C.
- Voeg 120 μL NaN3 bouillon (1 M bouillonconcentratie) toe nadat de gel is gesmolten.
- Was de PDMS-vorm met water en laat deze aan de lucht drogen. Plaats de PDMS-mal tussen twee sets diaparen.
- Pipetteer de agar op en neer om de pipetpunt op te warmen. Pipetteer 300 μL gesmolten agar op de PDMS-mal en verdeel de agar handmatig over kanalen, omdat de plaatsing van de dia's de agar langs de kanalen verspreidt.
- Plaats een microscoopglaasje direct op de agar en rust op de objectglaasjes aan de zijkanten. Verwijder het schuifje nadat de agar is afgekoeld.
4. Montage van C. elegans
- Zodra de dia's zijn afgekoeld, tilt u de dia recht van de mal zonder te knippen.
- Verplaats dieren naar de kanalen nadat ze zijn geïmmobiliseerd door NaN3
- Draai de dieren in de gewenste richting.
- Plaats een dekglaasje op de pad. Kantel het kussen en duw lichtjes van de ene naar de andere kant om lucht naar de zijkant te duwen en luchtbellen te voorkomen.
Resultaten
PDMS-mal fabriceren
Door de vacuümdruk tijdens de fabricage van de matrijs te laten draaien, worden luchtbellen uit de niet-uitgeharde PDMS doorboord en verwijderd, waardoor een luchtbelvrije matrijs wordt gegarandeerd. Zoals te zien is in figuur 3D , stijgen bubbels naar de oppervlakte en doorboren. Bubbelvrije mallen kunnen schone kanalen produceren.
Stolling van PDMS-mal
Wanneer u de ruit op de vinylplaat plaatst, vermijd dan het creëren van luchtspleten. Deze openingen kunnen leiden tot ongelijkmatige dikte of oppervlaktedefecten. Bubbels, indien aanwezig, kunnen visueel worden gedetecteerd. Door de ruit van de ene naar de andere kant te drukken, wordt lucht verplaatst, waardoor de vorming van luchtbellen tot een minimum wordt beperkt en een gelijkmatige matrijsdikte wordt gegarandeerd, zoals weergegeven in afbeelding 4A.
Gebruik van gekanaliseerde agarpads voor fijne oriëntatie van C. elegans
De gekanaliseerde agarpads maken een nauwkeurige oriëntatie van C. elegans mogelijk. We stellen de oriëntatie van het dier in door het dier lichtjes te rollen met een platina draadpriem, terwijl we de oriëntatie verifiëren met behulp van oriëntatiepunten, zoals de vulva of de S-vormige darm (Figuur 5A,C). We bevestigen de oriëntatie onder een fluorescerende dissectiemicroscoop voordat we de dieren overbrengen naar een omgekeerde microscoop die wordt weergegeven in figuur 5B,D.
Beoordeling van regeneratie van neuronvezels met gekanaliseerde agarpads
Gekanaliseerde agarpads verbeteren de beeldvormingskwaliteit van neuronale regeneratie door het dier optimaal te oriënteren. Door geregenereerde neuronvezels dichter bij de objectieflens te plaatsen, wordt lichtverstrooiing en -absorptie verminderd, waardoor de helderheid van het beeld wordt verbeterd. Figuur 5E,F laat zien dat het plaatsen van de regeneratieplaats dichter bij het doel de beeldkwaliteit verbetert, waardoor een nauwkeurigere analyse van neuronale hergroei mogelijk wordt.
Figuur 1: Caenorhabditis elegans op vlakke en gekanaliseerde pads. (A) Dier op een plat agarkussen in DV-oriëntatie; Vulva gezichten dekglaasje. (B) De introductie van het dekglaasje duwt de vulva opzij en dwingt het dier in zijwaartse oriëntatie. (C) Dier op gekanaliseerd agarkussen in DV-oriëntatie. (D) Dierlijke resten in DV-oriëntatie na introductie van dekglaasjes. (E) Brightfield-beeld van rolmutant op gekanaliseerd agarpad in DV-oriëntatie. (F) Brightfield-afbeelding met dekglaasje, hetzelfde dier als E blijft in DV-oriëntatie. Afkortingen: DV = dorsaal-ventrale; Lat = lateraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Materialen en apparatuur voor PDMS-fabricage. (A) SYLCAP 284-F siliconen elastomeerset. (b) Schaal. (C) Plastic spuit. (D) Vacuüm exsiccatuur. (E) Kookplaat. (F) 12-inch langspeelbare vinylplaat, uit elkaar halen als dat nodig is. (G) Glas. Afkorting: PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mengen en vacumeren van niet-uitgeharde PDMS. (A) Meng de basis en het uithardingsmiddel in de tray. (B) Plaats de bak in een vacuümkamer. (C) Cyclus vacuüm drie keer om bubbels naar boven te laten komen. (D) Na een uur knapten de meeste bubbels. Let op verbeterde transmissie via PDMS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Introductie van een ruit op niet-uitgeharde PDMS zonder bubbels. (A) Introductie van ruit op vinylplaat zonder bubbels. (B) Gestolde PDMS-mal verwijderd uit het record, met inzetkanalen voor detaillering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Helderveld- en fluorescentiebeelden van C. elegans gemonteerd op gekanaliseerde agar. (A) Brightfield-beeld van een dier in bilaterale DV-oriëntatie. Anatomisch oriëntatiepunt voor DV-oriëntatie: spiraalvormige S-vormige darm (donkerder weefsel aangegeven door pijl) kruist de middellijn ~60% van de afstand van neus tot staart. (B) Fluorescentiebeeld van neuronen in DV-oriëntatie, hetzelfde dier als A. (C) Brightfield-afbeelding van een dier in lat-oriëntatie. Anatomisch oriëntatiepunt voor de oriëntatie van de lat: vulva naar de zijkant gericht. (D) Fluorescentiebeeld van neuronen in lat-oriëntatie, hetzelfde dier als C. (E) Oriëntatie met regeneratie (pijl) in de diepere (verte) kant van een dier. (F) Oriëntatie met regeneratie bij ondieper dier dichter bij het objectief; regeneratie duidelijker (pijl). Schaal balken = 20 μm. Afkortingen: DV = dorsaal-ventrale; Lat = lateraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Het belangrijkste voordeel van gekanaliseerde agarpads is hun vermogen om de oriëntatie van dieren voor beeldvorming te behouden. De kanalen zijn geschikt voor volwassen dieren, waardoor een gecontroleerde rotatie mogelijk is die wordt gehandhaafd bij het introduceren van het dekglaasje. We hebben met succes wildtype-, roller- en dumpy-dieren in beeld gebracht. We oriënteren dieren op de juiste manier met behulp van anatomische oriëntatiepunten, waardoor beeldvorming en vergelijking van meerdere structuren in één gezichtsveld mogelijk is en doelcellen dichter bij het oppervlak worden gebracht. Deze rotatie vergemakkelijkt met name de visualisatie in de dorsale of ventrale (bilaterale weergaven), waardoor de linker- en rechterkant van het dier kunnen worden vergeleken.
Voorheen zou de visualisatie en vergelijking van deze bilaterale structuren 3D z-stacks en mogelijke normalisatie van signalen vereisen om rekening te houden met verminderde transmissie op grotere diepten. De gedefinieerde oriëntatie die mogelijk wordt gemaakt door gekanaliseerde agar zorgt dus voor een consistentere beeldvorming over meerdere wormen en zou verbeterde metingen mogelijk moeten maken. Dit is met name nuttig voor postoperatieve beoordeling van geregenereerde neuronale vezels, die kunnen groeien in richtingen die moeilijk in beeld te brengen zijn, zoals de omtrek2.
Bovendien vermindert de gekanaliseerde agar de stress bij dieren omdat ze in een depressie worden geplaatst die de dekslipdruk verlicht en de normale fysiologie bevordert5. Hoewel slappe stammen tijdens het monteren kunnen draaien, stimuleren de kanalen een lineaire dierconfiguratie en rotatie van het hele dier. In een andere implementatie kan de patroonvorming ook de beweging van dieren beperken om de hoeveelheid verdoving te verminderen die nodig is om het dier in beeld te brengen of te observeren8.
Ten slotte is de gekanaliseerde agar-techniek ook zeer toegankelijk. Na de fabricage van de matrijs vereist het maken van gekanaliseerde agarpads ongeveer dezelfde hoeveelheid tijd, expertise en kosten als het maken van gewone platte agarpads. Alle componenten die nodig zijn om de PDMS-mal te maken, zijn gebruikelijk in veel academische laboratoria of online gekocht. De duurzaamheid van PDMS-mallen maakt ze een kosteneffectieve optie voor laboratoria, die in de loop van de tijd bestand zijn tegen intensief gebruik. PDMS-mallen kunnen jaren en honderden toepassingen meegaan. We blijven een 17 jaar oude mal gebruiken met matige degradatie. We raden aan om de mallen bij kamertemperatuur in een container te bewaren om ze vrij te houden van vuil, dat indien nodig kan worden weggespoeld met gedeïoniseerd water.
Ondanks deze voordelen zijn er verschillende beperkingen verbonden aan onze techniek. De kracht van de houweel die wordt gebruikt om dieren op het kussen te plaatsen, kan de kanalen vervormen, wat mogelijk de positionering van het dier kan beïnvloeden. Zoals bij elke fijne manipulatie, kan het positioneren en draaien van het dier in de gewenste richting tijdrovend zijn, wat de blootstelling van het dier aan verdoving verhoogt en mogelijk stress veroorzaakt. Kanalen kunnen ook lucht vasthouden en bellen vormen tijdens het plaatsen van het dekglaasje, wat de helderheid van de beeldvorming kan verstoren door licht te verstrooien. We bespreken manieren om bubbels in het protocol te minimaliseren. Onze ervaring geeft aan dat de meeste nadelen van gekanaliseerde agar grotendeels worden vermeden door een beetje training en oefening.
Toekomstige richtingen voor het optimaliseren van deze kanalen zijn onder meer het ontwikkelen van ontwerpen die zijn afgestemd op specifieke experimentele behoeften, waaronder verschillende maten en vormen voor verschillende leeftijden en fenotypes van C. elegans. Het fabriceren van aangepaste kanaalgroottes door nanofabricage10 kan de fysiologische impact op dieren verminderen in vergelijking met generieke kanalen5. Concluderend kan worden gesteld dat de implementatie van gekanaliseerde agarpads beeldvorming met hoge resolutie van obscure structuren bij oudere dieren mogelijk maakt. Deze pads behouden de oriëntatie van C. elegans, wat leidt tot een verbeterde beeldkwaliteit en gedetailleerde visualisatie, terwijl de stress op de dieren wordt verminderd door de ondersteunende structuur van de kanalen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Financiering werd verstrekt door NIH R56NS128413. We danken Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) voor hulp bij het verwerken van vinylplaten. We danken de leden van Chung Laboratory voor hun inzichtelijke opmerkingen over het manuscript.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 125 mL Erlenmeyer kolf | Corning | 4980-125 | |
| 33 1/2 RPM of 12-inch langspeel (LP) vinylplaat | N/A | N/A | Individuele kanaaldepte: 50 µm, breedte: 200 µm |
| 30 mL plastic spuit | Fisher Scientific | 50-793-817 | |
| 90% Platinum, 10% Iridium draad | Tritech Research | PT-9010 | gebruikt om platina-pick te maken |
| aluminiumfolie | Amazon | N/A | |
| Calciumchloride | Fisher Scientific | AAL131910B | |
| glaspaneel | N/A | N/A | 7 inch x 5 inch glaspaneel uit frame |
| glaspipet | Fisher Scientific | 13-678-20A | gebruikt om platina-pick te maken |
| hotplate | Thermofisher | SP88857104 | |
| Magnesiumsulfaat | Fisher Scientific | AA3333736 | |
| microscoopglazen | Mckesson | 938360 | |
| agar van moleculaire biologiekwaliteit | Benchmark Scientific | A1705 | |
| Kaliumfosfaat dibasisch | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Kaliumfosfaat monobasisch | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Natriumazid | Fisher Scientific | AAJ2161022 | |
| Natriumchloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| vierkante dekglas | Fisher Scientific | 12-541-016 | |
| SYLCAP 284-F (Fast Cure) Siliconen Elastomer Encapsulant Kit, Transparant, Optisch Helder, 10:1 Mix, 500 Gm/ML (0,5 Kg), Sneller Dan Sylgard 184 en Soortgelijk | MicroLubrol | N/A | |
| vacuümdesiccator | Fisher Scientific | 08-648-100 | |
| weegschaal | Fisher Scientific | 01-549-750 |
Referenties
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).
- Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior. Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Zellag, R. M., et al. CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis. Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).
- Huang, Y. C., et al. A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission. Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).
- Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).
- Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record. MicroPubl Biol. 2018, (2018).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).
- Gerhold Abigail, R., et al. Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging. Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).
Herprints en machtigingen
