Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van de tijd tot knockdown van volwassen Drosophila melanogaster met behulp van een Drosophila Activity Monitor (DAM2) als reactie op een warmtestressor voor luchtgeleiding in een couveusekamer. De DAM2 meet de activiteit door individuele vliegbewegingen te registreren terwijl ze een infraroodstraal kruisen. De analyse van de gegevens wordt vergemakkelijkt door een nieuw uitvoerbaar bestand dat door de auteurs is gemaakt.
Methodenartikel
Hittetolerantietesten met behulp van het Drosophila-activiteitsmonitorsysteem : een gids voor een uitvoerbare toepassing voor gegevensanalyse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De studie van hittetolerantie in Drosophila melanogaster is al tientallen jaren van bijzonder belang voor onderzoekers, met een gebruikelijke benadering voor het beoordelen van hittetolerantie het monitoren van de tijd tot knockdown (TKD) na blootstelling aan een verhoogde temperatuur. Klassiek worden vliegen gehuisvest in individuele flesjes en in een verwarmd waterbad geplaatst. TKD wordt vervolgens handmatig gemonitord door onderzoekers. Hoewel zeer goed ingeburgerd, blijven er problemen bestaan met betrekking tot subjectiviteit en consistente toepassing van een tastbare definitie van stopzetting van alle bewegingen, inclusief spierspasmen, bij het implementeren van deze handmatige testen. We hebben een high-throughput methode ontwikkeld voor het automatiseren van hittetolerantietesten met behulp van de TriKinetics Drosophila Activity Monitors (DAM2). Om het DAM2-systeem te begeleiden, hebben we een programma geschreven en een gebruiksvriendelijk uitvoerbaar bestand gemaakt om automatisch de laatste bewegingstijd af te lezen uit de gegenereerde activiteitsgegevens. Dit script schrijft vervolgens naar een .csv bestand de tijd tot hitteverlamming (TKD) voor elke vlieg. Uit onze gegevens blijkt dat deze geautomatiseerde DAM2-methode consistent en betrouwbaar is. Ondertussen zijn activiteitsprofielen die zijn gemaakt op basis van de gegevens van het aantal activiteiten interessant. Deze activiteitsprofielen kunnen worden samengesteld en hebben het potentieel om hittetolerantietests uit te breiden met de relatief niet-bestudeerde gedragscomponenten van hittetolerantie. In dit protocol wordt in detail beschreven hoe u het DAM2-systeem en de HoTDAM! software om de warmtetolerantie in D. melanogaster te schatten.
Inleiding
Ectothermen reageren doorgaans op hittestress met verhoogde locomotorische activiteit. Dit fenomeen is al tientallen jaren duidelijk voor onderzoekers, met de karakteristieke gedragsrespons beschreven door Cowles en Bogert in 19441. Ze beschreven hoe een organisme onder hittestress eerst een verhoogde locomotorische beweging zal vertonen. Naarmate de hittestress toeneemt, worden korte uitbarstingen van activiteit afgewisseld met perioden van inactiviteit. De temperatuur waarbij het organisme geen gecoördineerde beweging meer kan vertonen, is het kritische thermische maximum (CTmax). Gespierde spams volgen en uiteindelijk stort het organisme in 1,2. Deze ineenstorting is moeilijk te definiëren en vertegenwoordigt iets dat lijkt op "hitte, strengheid, coma of dood"2. Hier zullen we de term fysiologische ineenstorting gebruiken om theoretisch te verwijzen naar dit wazige eindpunt van hittestress.
Drosophila melanogaster en andere kleine insecten zijn waardevolle modellen geweest om hittestress te bestuderen. Om ten minste een deel van de complexe verzameling eigenschappen die warmtetolerantie vormen te schatten, hebben veel onderzoekers handmatig de tijd en de temperatuur waargenomen waarbij fysiologische ineenstorting optreedt, die respectievelijk de tijd tot knockdown (TKD) en CTmax vertegenwoordigen. Hoewel deze handmatige testmethoden zeer goed ingeburgerd zijn, hebben ze enkele nadelen. Een operationele definitie van fysiologische collaps kan moeilijk vast te stellen en op de juiste manier toe te passen op alle gevallen, vooral wanneer waarnemers minder ervaren zijn. Op welk punt gaat het organisme bijvoorbeeld van spierspasmen naar collaps? Het patroon van spierspasmen en aanvalsactiviteit voorafgaand aan collaps kan onvoorspelbaar zijn en kan nauwkeurige observatie bemoeilijken 2,3, waardoor de nauwkeurigheid en precisie in gevaar komen. Ondertussen beperkt de moeilijkheid bij observatie ook het aantal organismen dat tegelijk kan worden getest, waardoor de schaalbaarheid wordt beperkt.
Aangezien een toename van de activiteit een consistente reactie op hitte is en TKD en CTmax uiteindelijk het punt zijn waarop de activiteit stopt, hebben we geprobeerd de Drosophila Activity Monitors (DAM2) van TriKinetics te gebruiken om warmtetolerantietests te automatiseren. We hebben onlangs een methode gepubliceerd voor een geautomatiseerde test, samen met gebruiksvriendelijke software, met behulp van het DAM2-systeem4. De test werd gevalideerd door metingen van hittetolerantie in termen van TKD te vergelijken met een klassieke handmatige observatie-gebaseerde TKD-test op basis van verschillende factoren. We hebben ook de locomotorische activiteitscomponent van TKD-assays onderzocht om het induceerbare thermotolerantiefenotype verder te karakteriseren. We hebben de test en bijbehorende software HoTDAM genoemd! (Hittetolerantietesten met behulp van het Drosophila Activity Monitoring System). Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de geautomatiseerde hittetolerantietestmethode met behulp van het DAM2-systeem en de HoTDAM! software. De test is gemakkelijk te gebruiken en is gemakkelijk schaalbaar om veel organismen tegelijk te kunnen meten.
In dit manuscript hebben we TKD-testen uitgevoerd op thermosensorische mutante vliegen (transient receptor potential ankyrin 1; TRPA1) en hun genetische controles (White1118; w1118). Deze organismen werden gekozen om het belang te benadrukken van de karakteristieke verhoogde activiteit die wordt waargenomen tijdens hittestress voor de test. TRPA1-organismen vertonen dit ontsnappingsgedrag namelijk niet, wat het intrinsieke verband illustreert tussen geconserveerde gedragsreacties en schattingen van hittetolerantie, zoals TKD. We hebben de test uitgevoerd voor zowel vrouwen als mannen, samen met het implementeren van een warmtehardende voorbehandeling. De representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd, zijn gegevens van geheel nieuwe tests dan die welke zijn gebruikt in de oorspronkelijke validatietests die eerder zijn gepubliceerd.
Protocol
1. Vliegen houden
- Kies de juiste vliegvoorraad/lijn voor het onderzoek.
OPMERKING: Om de test te illustreren, gebruikten we de transiënte receptorpotentiaal TRPA1 knock-outvoorraad en de genetische controle ervan, de w1118-voorraad . - Houd de vliegenbestanden indien nodig onder consistente omstandigheden. Om dit protocol te volgen, moet u standaardvoedsel (maïsmeel, melasse en torula-gist) bij 25 °C onder een dagcyclus van 12:12 bewaren.
- Scheid mannen en vrouwen met lichte anesthesie.
OPMERKING: Afhankelijk van het experiment kunnen maagdelijke of gedekte vliegen worden gebruikt.- Laat volwassen mannetjes en vrouwtjes (afzonderlijk voor beide bestanden) 5 dagen paren en eieren leggen. Haal de volwassenen uit de flessen.
- Als volwassenen enkele dagen later beginnen te sluiten, maak je de flessen weer leeg. Scheid na 2 dagen de mannetjes en vrouwtjes met behulp van lichte etheranesthesie en laat ze afzonderlijk rijpen met een dichtheid van 25 vliegen per injectieflacon.
2. Voorbehandeling
- Pas de voorbehandeling of onafhankelijke variabele toe die de experimentele groepen definieert (genetisch, omgevings-, farmacologisch of anderszins).
- Om dit protocol te volgen, scheidt u de volwassenen op geslacht en behandelt u na 5 dagen de helft van de volwassenen door een afgesloten injectieflacon met de organismen gedurende 1 uur onder te dompelen in een waterbad bij 37 °C. Houd de bedieningselementen in de broedmachine op 25 °C. Laat de vliegen 24 uur na de voorbehandeling herstellen, voorafgaand aan de hittetolerantietest.
3. DAM2-systeem instellen
- Laad de vliegen in de DAM2 monitorbuizen en bedek de buizen aan beide uiteinden met katoen. Als de vliegen onmiddellijk op hittetolerantie moeten worden beoordeeld, gebruik dan geen anesthesie tijdens het laden van de organismen in de monitorbuizen om mogelijke verstorende effecten die verband houden met blootstelling aan anesthesie te voorkomen. Zuig in plaats daarvan individuele vliegen uit de flesjes in de monitorbuizen op.
- Plaats de analysebuisjes in de activiteitenmonitors en noteer op welke slotnummers de verschillende groepen zijn geladen.
OPMERKING: Deze kunnen worden gerandomiseerd, afhankelijk van het experiment, als de locatie binnen de monitor als een verstorende variabele kan worden beschouwd. - Software voor DAM2-data-acquisitie
OPMERKING: Het DAM2-systeem en de software worden uitgebreid beschreven in het DAMSystem3 Software Data Sheet dat beschikbaar is op de website van het bedrijf (zie de materiaaltabel). Raadpleeg de DAM2-instructies voor specifieke probleemoplossing en algemene functionaliteit. Hier geven we richtlijnen voor het gebruik van het systeem in het kader van onze hittetolerantietest.- Het DAM2-systeem bewaakt het aantal keren dat een individuele vlieg in elke buis een infraroodstraal breekt. De data-acquisitiesoftware indexeert en reset deze telling vervolgens elk gedefinieerd tijdsinterval. Selecteer onder voorkeuren het leesinterval dat in de test moet worden gebruikt. We hebben een leesinterval van 15 s gevonden om een goede balans te bereiken tussen resolutie en leesfouten.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het leesinterval in seconden niet korter te maken dan het aantal monitoren dat wordt gebruikt. Een korter leesinterval geeft een betere temporele resolutie aan de test, maar zal mogelijk ook het aantal leesfouten vergroten. De software kan achterop raken bij het indexeren van de metingen. Bovendien helpt een nieuwere, snellere computer om leesfouten te voorkomen. - Zorg er bij het overwegen van leesfouten voor dat de computer die wordt gebruikt om de DAM2-data-acquisitiesoftware uit te voeren, is ingesteld om nooit te slapen of in de sluimerstand te gaan om de test niet te onderbreken. Zorg er verder voor dat automatische updates (inclusief door de instelling gecontroleerde netwerkupdates) zijn uitgeschakeld tijdens het verzamelen van gegevens.
- Controleer of alle monitoren zijn aangesloten en communiceren met de software. Controleer of de status van elke monitor groen is onder het tabblad huidige gegevens .
OPMERKING: Zie de DAMSystem3 Software Datasheet voor details over welke problemen verschillende kleurcodes aanduiden. - De software voor gegevensverzameling schrijft automatisch het aantal activiteiten naar tekstbestanden in de map Gegevens in de systeembestanden. Om de gegevensanalyse te vergemakkelijken, verwijdert u alle tekstbestanden in deze gegevensmap voordat u de gegevensverzamelingssoftware voor een test start.
OPMERKING: De tekstbestanden worden automatisch ingevuld, dus het is toegestaan om ze uit deze map te verwijderen om oude gegevens te wissen zonder het programma te hinderen.
- Het DAM2-systeem bewaakt het aantal keren dat een individuele vlieg in elke buis een infraroodstraal breekt. De data-acquisitiesoftware indexeert en reset deze telling vervolgens elk gedefinieerd tijdsinterval. Selecteer onder voorkeuren het leesinterval dat in de test moet worden gebruikt. We hebben een leesinterval van 15 s gevonden om een goede balans te bereiken tussen resolutie en leesfouten.
4. Hittetolerantie test
- Laad de monitoren in de testincubator.
- Start de acquisitiesoftware en laat de software gedurende een bepaalde tijd indexeren (bijv. 40 indexen of 10 minuten als het leesinterval is ingesteld op 15 s) voordat u de hittestress toepast.
OPMERKING: Dit zorgt voor enige acclimatisering aan de buizen en herstel van de beweging van de monitoren tijdens het instellen. Vooral als de activiteit tijdens de test wordt geanalyseerd, zal deze acclimatiseringstijd een basisactiviteit vaststellen voorafgaand aan de inductie van hittestress. Afhankelijk van de specifieke aard van de test die wordt uitgevoerd, kan deze acclimatiseringsfase worden overgeslagen, waarbij de monitoren al bij de stresstemperatuur direct in de couveuse worden geplaatst. - Als u een statische (TKD) test uitvoert, stelt u de incubator zo snel mogelijk in op de ingestelde schadelijke temperatuur na de acclimatisatieperiode. De responsvariabele wordt geoperationaliseerd als de laatst geregistreerde bewegingstijd (d.w.z. de laatste niet-nulindex) om de TKD te schatten.
- Als u een dynamische test uitvoert, bepaalt u de snelheid waarmee de temperatuur na de acclimatiseringsperiode zal stijgen. Hier is de gemeten responsvariabele technisch gezien weer tijd. Het tijdstip waarop de laatste beweging wordt geregistreerd, valt samen met een temperatuur (CTmax), afhankelijk van de snelheid van het oplopen.
- Bewaak de activiteitsaantallen in realtime op het DAM-systeemdisplay in de acquisitiesoftware of bekijk direct de tekstbestanden in de gegevensmap in de DAMSystem3-programmabestanden. Kopieer de tekstbestanden en open de kopie in plaats van het originele bestand in de gegevensmap om problemen met het live opnemen van gegevens te voorkomen.
- Nadat er enkele minuten geen beweging in een van de vliegen te zien is, stopt u de acquisitiesoftware.
OPMERKING: Met onze testen hebben we ontdekt dat een paar tot enkele minuten inactiviteit een indicatie is van fysiologische collaps als gevolg van hittestress, vergelijkbaar met die gezien in de klassieke handmatige TKD-testen. Dit is echter afhankelijk van het spontane ontsnappingsgedrag. Overweeg daarom mogelijke verstorende variabelen als de specifieke behandeling in het onderzoek deze gedragsrespons zou kunnen veranderen. Verder zal, afhankelijk van de specifieke parameters van de test (bijv. temperatuur, behandeling), de lengte van de test uiteraard variëren.
5. Organisatie en analyse van gegevens
OPMERKING: Zie Aanvullende video S1 voor een uitleg over het downloaden van de uitvoerbare toepassing van de GitHub, evenals de basisfunctionaliteit van de software.
- Zodra de gegevens zijn verkregen, scant u de tekstbestanden op fouten met behulp van de software waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel) en selecteert u specifieke start- en stoppunten voor gegevens over samenvoegingsactiviteiten. Als er een acclimatiseringsinterval van 10 minuten is geïmplementeerd, begint u 10 minuten na de activiteitsregistratie met binning. Zie de discussie voor meer informatie over binning.
- Open de HoTDAM! analysesoftware en importeer de gescande monitorgegevensbestanden door te klikken op Bestand | Laad monitorgegevens.
OPMERKING: De software en de uitvoerbare toepassing zijn beschikbaar via GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) of via de website van het bedrijf in de sectie Analysesoftware . Houd er rekening mee dat de uitvoerbare toepassing op dit moment alleen compatibel is met Windows-besturingssystemen. - Voeg groepsaanduidingen toe om aan te geven welke behandelingsgroepen overeenkomen met welke cel binnen de DAM2-monitoren.
OPMERKING: De lay-out van de software-interface komt overeen met de lay-out van de monitoren. - Klik op Definitie van meerdere groepen starten om een dialoogvenster te openen om een groepsaanduiding toe te voegen die op meerdere cellen wordt toegepast. Zodra de groepsaanduiding is geaccepteerd, klikt u op de cellen om de groepsaanduiding toe te passen en klikt u vervolgens op Aanduiding van meerdere groepen stoppen.
OPMERKING: De software organiseert en exporteert DAMSystem3-gegevens naar .csv bestanden die moeten worden geanalyseerd in statistische software. - Exporteer de TKD (d.w.z. de laatste niet-nul-index) voor elke fly in de monitoren naar een .csv bestand door te klikken op Bestand | Knockdown-gegevens exporteren | Exporteer alle beeldschermen of exporteer geselecteerde beeldschermen. TKD voor elke vlieg wordt in de uitvoer georganiseerd op groepsaanduiding.
- Exporteer activiteitsgegevens voor elke vlieg door op Bestand | Activiteitsgegevens exporteren | Exporteer alle beeldschermen of exporteer geselecteerde beeldschermen naar een .csv bestand, waarbij alleen de tijdstempel- en telgegevens behouden blijven, waardoor het gegevensbestand gemakkelijker is om mee te werken, terwijl ook aangewezen groepslabels aan elke vlieg worden toegewezen.
OPMERKING: De eerste kolommen in de DAMSystem3-gegevensbestanden komen overeen met interne gegevens voor de monitors (bijv. lichtmonitoring of foutmeldingen) tijdens de acquisitie. De telgegevens staan in de kolommen 11-42 (zie het gegevensblad van DamSystem3 voor details). Als u de activiteitsgegevens exporteert met de analysesoftware, worden alle kolommen verwijderd, behalve de kolommen met de tijdstempel en de telgegevens. - Als u een CTmax-experiment uitvoert, gebruikt u de TKD om de CTmax te bepalen met behulp van de snelheid van temperatuurverhoging.
OPMERKING: De analysesoftware is op een objectgeoriënteerde manier geschreven in C# (broncode beschikbaar op GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) zodat aspecten van het programma eenvoudig kunnen worden aangepast om aanpassing aan specifieke doeleinden mogelijk te maken.
6. Statistieken
OPMERKING: Er kunnen veel verschillende tests worden gebruikt om de TKD-gegevens te analyseren, afhankelijk van de specifieke kenmerken van de experimentele opstelling.
- Gebruik overlevingsanalyse (bijv. Cox-regressie, Kaplan-Meier) om knockdown te conceptualiseren als een gebeurtenis die elke vlieg binnen de test zal ervaren.
OPMERKING: Voor een gedetailleerd overzicht, zie Bradburn's en Clark's 4-paper serie over overlevingsanalyse en de implementatie ervan 5,6,7,8. - Gebruik ANOVA om groepsverschillen te beoordelen en modaliteiten te vergelijken, vooral bij het valideren van de geautomatiseerde test voor specifieke aandoeningen.
- Analyseer de TKD-gegevens met behulp van Kaplan-Meier-overlevingsanalyse. Splits het bestand op voorraad zodat de analyse afzonderlijk wordt uitgevoerd (bijv. voor TRPA1 - en w1118-aandelenlijnen ). Kies de tijdsvariabele als TKD (in min), knockdown als de gebeurtenis, voorbehandeling als de factor en geslacht als de lagen.
- Voer de log-rank-, Breslow- en Tarone-Ware-tests uit om de voorbehandeling voor elke laag (d.w.z. geslacht) te vergelijken, ter illustratie en laat verschillende methoden zien.
- Bouw overlevingsplots.
Resultaten
De analyses voor TRPA1 - en w1118-bestanden werden afzonderlijk uitgevoerd. Percentiel TKD-tijden en andere beschrijvende gegevens zijn te vinden in Tabel 1.
| Percentielena | ||||||||
| Geslacht | Behandeling | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | Schatten | Std. Fout | Schatten | Std. Fout | Schatten | Std. Fout | ||
| W1118 | ||||||||
| Vrouwelijk | Beheersen | 16 | 42.50 | 0.43 | 40.75 | 2.00 | 38.75 | 0.43 |
| Gehard | 16 | 48.75 | 4.55 | 43.25 | 2.50 | 38.50 | 1.95 | |
| Mannelijk | Beheersen | 16 | 43.25 | 1.88 | 39.75 | 0.25 | 37.00 | 2.38 |
| Gehard | 16 | 46.50 | 5.63 | 35.50 | 2.00 | 30.75 | 3.03 | |
| TRPA1 | ||||||||
| Vrouwelijk | Beheersen | 16 | 34.25 | 2.17 | 29.25 | 7.50 | 21.50 | 0.72 |
| Gehard | 15 | 37.25 | 4.84 | 28.75 | 1.77 | 25.75 | 0.86 | |
| Mannelijk | Beheersen | 15 | 38.25 | 3.29 | 32.00 | 1.29 | 24.50 | 7.92 |
| Gehard | 16 | 27.50 | 0.72 | 25.75 | 1.00 | 22.75 | 6.06 | |
Tabel 1: Beschrijvende statistieken voor Kaplan-Meier-overlevingsanalyses van w1118- en TRPA1-vliegen . Percentiel TKD-waarden worden in minuten gegeven. Gehard verwijst naar een voorbehandeling van 37 °C gevolgd door 24 uur herstel voorafgaand aan een hitteschok bij 39 °C. De controles werden tijdens de voorbehandeling op 25 °C gehouden. OPMERKING: In overlevingsanalyses is het75e percentiel het laatste tijdstip waarop 75% van de steekproef nog steeds activiteit vertoont.
Voor de w1118-vliegen vonden log-rank-tests een significant verschil in de kans op knockdown tussen geharde en controlevrouwtjes (p = 0,026), zodat geharde vrouwtjes een kleinere kans hadden om in de loop van de test te worden neergeslagen door de hittestressor. Ondertussen vonden log-rank-testen geen significant verschil in de kans op knockdown tussen geharde en controlegroep w1118 mannetjes (p = 0,798). Voor de TRPA1-vrouwtjes werd geen significant verschil in de kans op knockdown gevonden tussen geharde en controle-organismen (p = 0,547) met behulp van log rank-testen. Ten slotte vonden log-rank-testen voor de TRPA1-mannetjes een significant verschil in de kans op knockdown tussen geharde en controle-organismen (p = 0,014), zodat controle-organismen een kleinere kans hadden om te worden neergeslagen door de hittestressor. Zie Tabel 2 voor alle resultaten van de overlevingsanalyses (inclusief gegeneraliseerde Wilcoxon- en Tarone-Ware-tests) en Figuur 1 voor overlevingscurves.
| Geslacht | χ2 | Df | p-waarde | |
| W1118 | ||||
| Vrouwelijk | Log Rang (Mantel-Cox) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| Breslow (Gegeneraliseerde Wilcoxon) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| Tarone-Ware | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| Mannelijk | Log Rang (Mantel-Cox) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| Breslow (Gegeneraliseerde Wilcoxon) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| Tarone-Ware | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| TRPA1 | ||||
| Vrouwelijk | Log Rang (Mantel-Cox) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| Breslow (Gegeneraliseerde Wilcoxon) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| Tarone-Ware | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| Mannelijk | Log Rang (Mantel-Cox) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| Breslow (Gegeneraliseerde Wilcoxon) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| Tarone-Ware | 5.20 | 1 | 0.023 |
Tabel 2: Significantietesten waarin de kans om actief te blijven wordt vergeleken tussen voorbehandeld en controlew 1118 en TRPA1 vrouwelijke en mannelijke vliegen. Gehard verwijst naar een voorbehandeling van 37 °C gevolgd door een herstel van 24 uur voorafgaand aan een hitteschok bij 39 °C. Controle-organismen werden tijdens de voorbehandeling op 25 °C gehouden.
Figuur 1: Overlevingscurven die het percentage organismen weergeven met resterende activiteit in de loop van de TKD-test voor w1118- en TRPA1-vliegen . Gehard verwijst naar een voorbehandeling van 37 °C gevolgd door een herstel van 24 uur voorafgaand aan een hitteschok bij 39 °C. Controle-organismen werden tijdens de voorbehandeling op 25 °C gehouden. TKD is binnen enkele minuten sinds de introductie van de 39 °C hittestressor. Afkortingen: TKD = time to knockdown; TRPA1 = voorbijgaande receptorpotentiaal ankyrine 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gemiddelde activiteit uitgezet tegen de tijd is te zien in figuur 2 voor geharde en gecontroleerde TRPA1 en w1118 mannetjes en vrouwtjes.
Figuur 2: Gemiddelde activiteit versus tijd voor w1118 - en TRPA1-vliegen voor de duur van de TKD-test. Afkortingen: TKD = time to knockdown; TRPA1 = voorbijgaande receptorpotentiaal ankyrine 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Er zijn waarschijnlijk talloze en nieuwe manieren om de activiteitsgegevens te analyseren, vooral wanneer rekening wordt gehouden met groepseffecten en het opnemen van TKD. Aangezien activiteitsanalyse tijdens hittetolerantie relatief onbestudeerd is, hebben we geen potentieel nieuwe statistische benaderingen onderzocht om activiteitsgegevens te analyseren. Een dergelijke statistische test zou een veel uitgebreider literatuuronderzoek en discussie rechtvaardigen dan hier op zijn plaats is. In plaats daarvan hebben we eenvoudigweg de gemiddelde activiteit voor elke groep (voorbehandeling of controle) versus tijd in een grafiek weergegeven, omdat we deze methode eerder hebben gepubliceerd om de activiteit te illustreren met een passend literatuuronderzoek.
Aanvullende video S1: Walkthrough voor het downloaden van de uitvoerbare toepassing van GitHub en de basisfunctionaliteit van de software. De meest recente release (op dit moment alleen compatibel met Windows) is te vinden op de GitHub waarnaar wordt verwezen (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) of via een geïndexeerde link op de sectie Analysis Software van de website van het bedrijf. Zodra de release is gedownload, moeten de bestanden worden geëxtraheerd en moet de HoTDAM! applicatie kan worden geopend. Antivirussoftware kan voorkomen dat de applicatie wordt uitgevoerd; Het kan nodig zijn om toestemming te geven aan de applicatie. Zodra de interface actief is, kan de gescande DAM2 (File Scan Software) worden geüpload (File | Laad monitorgegevens). De interface voor groepsaanduiding vertegenwoordigt de lay-out van de activiteitenmonitor en stelt de gebruiker in staat om behandelingsgroepen afzonderlijk aan te wijzen, één voor één of meerdere tegelijk, met de functie Multi-Select Group Definition . Alle monitoren sluiten elkaar uit met betrekking tot de functionaliteit van de groepsaanduiding en moeten afzonderlijk worden gedefinieerd. TKD- en activiteitsgegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar .csv bestanden (Bestand | Knockdown-gegevens of -bestand exporteren | Activiteitsgegevens exporteren) voor een geselecteerde monitor afzonderlijk of voor alle monitors tegelijk. Als alle beeldschermen tegelijk worden geëxporteerd, worden de TKD- of activiteitsgegevens geëxporteerd naar één .csv bestand, maar worden de gegevens voor elke beeldscherm gescheiden in het bestand. De geëxporteerde TKD-bestanden groeperen vliegen in groepen met de laatste activiteit die niet nul is voor elke buis. Activiteitenbestanden houden alle buizen gescheiden, maar associëren groepsaanduidingen en verwijderen alle informatie uit de bestanden, behalve tijdstempel- en telgegevens voor elke buis. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De hittetolerantietestmethode die we hier beschrijven is veelzijdig en schaalbaar. Eerder hebben we al een validatiestudie gepubliceerd waarin we de HoTDAM! methode naar een klassieke, op observatie gebaseerde TKD-test en ontdekte dat de geautomatiseerde test dezelfde algemene trend liet zien over verschillende factoren4 (Figuur 3). Met andere woorden, op dezelfde manier als de klassieke handmatige TKD-test, was de DAM2 geautomatiseerde test in staat om organismen te differentiëren op basis van geslacht, testtemperatuur, hardingsvoorbehandeling en hersteltijd na verhardingsvoorbehandeling voorafgaand aan de test. Hoewel wordt aangenomen dat de geautomatiseerde test objectiever is in die zin dat TKD niet afhankelijk is van observatie door onderzoekers, suggereren onze gegevens niet dat dit de DAM2-test aanzienlijk superieur maakt aan de handmatige test in termen van het ontdekken van een effect. We ontdekten dat de assays vrij gelijkaardig waren in termen van precisie, en als er iets is, zijn de effectgroottes binnen de geautomatiseerde assay iets kleiner (zie aanvullend materiaal van Rokusek et al.4 voor gedetailleerde beschrijvende statistische en ANOVA-gegevens voor zowel de geautomatiseerde DAM2 als de handmatige op observatie gebaseerde assays van onze validatiestudies). De reden hiervoor heeft waarschijnlijk te maken met het inherente verschil in wat de testen meten in termen van TKD, dat hieronder in detail wordt besproken.
Figuur 3: Vergelijking van de geautomatiseerde DAM2-test met een klassieke op waarneming gebaseerde TKD-test. Grafieken tonen het gemiddelde TKD in minuten en foutbalken zijn de standaardfout van het gemiddelde. Onafhankelijke factoren die worden vergeleken zijn (A) geslacht op basis van testtemperatuur, (B) verharding op basis van testtemperatuur, (C) geslacht op basis van hersteltijd, (D) verharding op geslacht, (E) testtemperatuur op basis van hersteltijd en (F) verharding op basis van hersteltijd. Absolute TKD heeft de neiging langer te zijn in de geautomatiseerde test, maar de algemene trends over de factoren heen zijn consistent tussen de testen. Deze figuur is ontleend aan Rokusek et al. 4. Afkorting: TKD = time to knockdown. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De illustratieve gegevens die hier worden gepresenteerd, vertegenwoordigen volledig afzonderlijke experimenten van onze oorspronkelijke verificatieproeven, die ook verschillende vlieglijnen gebruikten. De test (TKD en activiteit) was gevoelig voor de effecten van de voorbehandeling van verharding in de w1118-voorraad (we gebruikten een Canton S wildtype-stam in de oorspronkelijke experimenten) wat ondersteunt dat de basisfunctionaliteit van de test stabiel is onder variabele omstandigheden, hoewel tot nu toe slechts een paar lijnen zijn getest. De test is veelzijdig in die zin dat deze niet beperkt is tot TKD-metingen. Aangezien TKD in onze test wordt gedefinieerd als het stoppen van de locomotorische activiteit, kan de CTmax worden bepaald als de temperatuuroploopsnelheid bekend is. Ten slotte is de test volledig geautomatiseerd en kan deze eenvoudig worden opgeschaald door meer activiteitsmonitors toe te voegen, waardoor veel grotere steekproeven mogelijk zijn dan mogelijk zou zijn met een handmatige observatiemethode.
Enkele belangrijke punten waarmee u rekening moet houden bij het uitvoeren van de test en analyse zijn de volgende. Gebruik een broedmachine die snel een ingestelde temperatuur kan bereiken, zodat de monitoren bij de opfoktemperatuur in de broedmachine kunnen worden geladen en rustig kunnen zitten om aan de nieuwe omgeving te wennen voordat de hittestressor wordt toegepast. Als de temperatuur te langzaam stijgt, begint de test meer te lijken op een dynamische CTmax-test in tegenstelling tot een statische TKD-test. Als de software bijvoorbeeld 40x mocht indexeren voorafgaand aan de inductie van de hittestress om een basislijn vast te stellen, kan de software het gegevensbestand uitvoeren vanaf index 40 voor het bepalen van TKD en gegevensanalyse. Het uitgangspunt is in termen van de tijdstempel die door de software is geregistreerd, dus houd rekening met het indexinterval (bijv. 40 indexen is 10 minuten als het indexinterval 15 s is).
De File Scan Software kan ook worden gebruikt om indexen te "bin" en kan de tellingen optellen of gemiddelden. Toen we bijvoorbeeld activiteitsgegevens in een grafiek maakten (zie hieronder), hebben we elke vier indexen samengevoegd met het optellen van tellingen (d.w.z. we exporteerden activiteit elke minuut in plaats van elke 15 s). Houd er rekening mee dat de File Scan Software geen gedeeltelijke starttijden toestaat bij het binning, in termen van de tijdstempel. Als de eerste index bijvoorbeeld om 12:10:15 uur stond, met een indexinterval dat is ingesteld op 15 s, dan begint het binning na 1 minuut op de volgende dichtstbijzijnde minuut (bijvoorbeeld 12:11:00). Als er dus activiteit in minieme stappen wordt gebruikt voor analyse, maar de resolutie van intervallen van 15 s voor TKD gewenst is, start u de acquisitiesoftware binnen 15 s van de dichtstbijzijnde hele minuut (bijv. ergens na 12:09:45 en vóór 12:10:00). Deze complicatie is te wijten aan het feit dat de data-acquisitiesoftware de klok van het computersysteem als tijdstempel gebruikt, aangezien de DAMSystem3 waarschijnlijk is gebouwd met slaapstudies in gedachten.
In termen van statistische benaderingen van TKD-vergelijking, stellen we dat overlevingsanalyse meer informatie biedt dan alleen het vergelijken van gemiddelde of mediane knockdown-tijden tussen groepen. Overlevingscurves kunnen visueel inzicht bieden in het tijdsverloop van knockdown voor de populaties tijdens de test. Op dezelfde manier kunnen statistische tests worden afgestemd op de specifieke vraag die in het onderzoek wordt gesteld. Gegeneraliseerde Wilcoxon-tests leggen bijvoorbeeld meer gewicht op vroege gebeurtenissen, terwijl log-rank-tests evenveel gewicht geven aan alle tijdstippen en gevoeliger zijn voor verschillen op de latere tijdstippen. Als de hazard ratio's niet proportioneel zijn (d.w.z. overlevingscurves kruisen) is Tarone-Ware strenger. Aangezien er geen censuur van gegevens mag zijn, aangezien alle organismen de gebeurtenis (knockdown) hebben meegemaakt, zou een argument kunnen worden aangevoerd voor het gebruik van niet-parametrische, rangschikkingstests zoals Mann-Whitney U en Kruskal-Wallis samen met de Kapan-Meier-overlevingscurves9. Als een onderzoek geïnteresseerd is in knockdown na een bepaalde tijd in plaats van TKD nadat alle organismen zijn neergehaald, zou het gebruik van overlevingsanalyse en de log-rank of gegeneraliseerde Wilcoxon-tests robuust zijn voor gecensureerde gegevens (d.w.z. een scenario waarin niet alle organismen zouden zijn gestopt met bewegen of instorten aan het einde van de test). We hebben de resultaten van log-rank, gegeneraliseerde Wilcoxon en Tarone-Ware in Tabel 2 gegeven om te illustreren.
Tijdens hittestress en voorafgaand aan CTmax dienen gedragsveranderingen (bijv. ontsnappingsgedrag) als coping-mechanismen. Deze aangeboren gedragsstrategieën worden in het hele dierenrijk geconserveerd, maar zijn vooral belangrijk voor ectothermen gezien hun lagere capaciteit voor metabole thermoregulatie10,11. Het is duidelijk dat gedrag een belangrijk aspect is van het ectotherm hittestress fenotype, maar relatief schaars onderzoek heeft deze gedragsaspecten van hittetolerantie onderzocht. Aangezien de test die we beschrijven gebaseerd is op de karakteristieke toename van locomotorische activiteit als reactie op hittestress, is het zeer geschikt om de locomotorische aspecten van hittestressreacties te onderzoeken. Tegelijkertijd brengt dit vertrouwen op spontane activiteit enkele beperkingen met zich mee. Het is belangrijk om te onthouden, vooral bij het onderzoeken van componenten van locomotorische reacties op hittestress, dat zowel TKD als activiteit intrinsiek gerelateerd zijn. Om een situatie aan te tonen waarin dit beperkend zou zijn voor onze test, hebben we hier gegevens verstrekt van TRPA1-organismen met een tekort aan thermosensatie. Wanneer de organismen een tekort hebben aan de TRPA1-receptor, vertonen vliegen niet de karakteristieke locomotorische respons op hitte12. In de hier getoonde representatieve gegevens is de activiteitsrespons in de TRPA1-organismen afgestompt. De TKD-metingen zouden niet gemakkelijk te vergelijken zijn met wildtype organismen, aangezien de maat een andere locomotorische respons weergeeft.
Generaliseerbaarheid en directe vergelijking van de resultaten, vooral met de klassieke hittetolerantietesten, is ook een mogelijke beperking (Figuur 3). Vaak zullen op observatie gebaseerde tests een mechanische of andere stimulus inhouden om ervoor te zorgen dat een immobiel organisme inderdaad fysiologische ineenstorting ervaart en niet alleen een gebrek aan spontane activiteit vertoont 3,13. Aangezien onze test gebaseerd is op spontane activiteit, is er een inherent verschil in de operationele definitie van TKD dat de vergelijking zou kunnen bemoeilijken. Met andere woorden, we hebben TKD gedefinieerd als het stoppen van de locomotorische activiteit, terwijl klassieke testen TKD over het algemeen definiëren als fysiologische collaps. Verder zijn geautomatiseerde tests zoals degene die we beschrijven afhankelijk van verwarmde lucht, terwijl handmatige tests over het algemeen een waterbad omvatten en dus een efficiëntere warmteoverdracht. Al deze beperkingen van de vergelijking tussen testmodaliteiten vertegenwoordigen nadelen van de generaliseerbaarheid van de geautomatiseerde methode. Tegelijkertijd is gemeld dat op observatie gebaseerde methoden complicaties vertonen met directe vergelijkingen tussen onderzoeken en 2,14,15. We stellen dat ondanks de beperkingen, geautomatiseerde tests een haalbare manier zijn om de hittetolerantie in termen van TKD of CTmax te schatten.
Andere geautomatiseerde hittetolerantietesten voor TKD en CTmax zijn eerder geïmplementeerd en beschreven in de literatuur 16,17,18,19, waarbij sommige gebruik maken van de DAM2-activiteitsmonitors 18,19. Verder hebben ten minste enkele onderzoeken gebruik gemaakt van op video gebaseerde methoden 16,20,21, evenals de DAM2-activiteitsmonitors 20, om activiteitsprofielen van fruitvliegen te onderzoeken in relatie tot hittetolerantie in de context van acute hittestress. Als zodanig is het automatiseren van hittetolerantietesten, ook met het DAM2-systeem, geen nieuw idee. Wat nieuw en van waarde is in onze test, is het gemak van gegevensbeheer zoals gefaciliteerd door de HoTDAM! (analyse)software. Activiteitsgegevens zijn moeilijk om mee te werken en het kan tijdrovend en omslachtig zijn om zelfs de eenvoudigste maatregelen (bijv. TKD) uit de grote datasets te halen zonder het gebruik van software of scripts die voor elk scenario op maat moeten worden gemaakt. HoTDAM! is gratis en beschikbaar als een volledig functionele uitvoerbare applicatie met een eenvoudige en gebruiksvriendelijke interface. Er is geen voorafgaande ervaring met coderen vereist. Verder is de software op een objectgeoriënteerde manier geschreven met documentatie om wijziging te vergemakkelijken. As such, HoTDAM! Kan eenvoudig worden aangepast aan specifieke behoeften. De broncode is beschikbaar naast de uitvoerbare applicatie. Het is onze hoop dat HoTDAM! kan laboratoria bedienen die nieuw zijn op het gebied van hittetolerantietests door een eenvoudige manier te bieden om TKD en CTmax te meten, en kan laboratoria die ervaring hebben met hittetolerantietests bedienen door aanpasbare software aan te bieden om gegevensbeheer te vergemakkelijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Het beschreven project werd ondersteund door Institutional Development Award (IDeA) subsidies van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (5P20GM103427 en 1U54GM115458). Het UNK Undergraduate Research Fellows-programma en het UNMC Medical Student Summer Research Program.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 14 mL polystyreen testbuisjes | Falcon | 352057 | |
| 30 gallon aquarium | Wal-mart | ||
| 8 oz flessen | Genesee | 32-129F | |
| Constant Climate Chamber | Memmert | HPP750eco | |
| maïsmeel | Lab Scientific | FLY801010 | |
| DAM2 Drosophila Activiteitsmonitor | TriKinetics | DAM2 | (DAMSystem3 Data Sheet) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| DAMSystem data-acquisitie software | TriKinetics | gratis download | |
| Drosophila agar | Lab Scientific | FLY80201 | |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Ether | Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan software | TriKinetics | voor het scannen van tekstfouten, het verzamelen van gegevens en uitvoer | |
| FlyStuff Flugs voor flessen | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs voor flesjes | Genesee | 49-102 | |
| FlyStuff flesjes | Genesee | 32-113RL | |
| HoTDAM software | Github of Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| Immersiecirculatie verwarmer | PolyScience | MX-CA11B | |
| moutwijn | Lab Scientific | FLY80084 | |
| propionzuur | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Glasbuisjes 5 x 65 mm voor DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| kleine verfkwast | Wal-mart | ||
| SPSS Statistics | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| torula gist | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 mutante stam | Bloomington Stock center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stam | Bloomington Stock center | 3605 |
Referenties
- Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
- Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
- Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
- Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
- Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
- Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
- MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
- Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
- Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
- Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).
Herprints en machtigingen
