Directe injectie van de nervus vagus voor ratten

Samenvatting

We presenteren een protocol voor directe injectie van de nervus vagus bij ratten, waardoor het geneesmiddel rechtstreeks in de zenuw kan worden toegediend zonder complicaties na injectie. Deze methode is van toepassing op preklinische neurologische onderzoeken waarbij het autonome zenuwstelsel wordt gemanipuleerd. Het kan worden gebruikt voor directe zenuwinjectie voor andere zenuwen bij ratten en andere soorten, met de nodige aanpassingen.

Samenvatting

Er is een relatieve overvloed aan strategieën en methodologieën om de afgifte van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel te vergemakkelijken. Rechtstreekse toediening van geneesmiddelen aan het perifere zenuwstelsel komt echter minder vaak voor, omdat er minder gedetailleerde publicaties over methoden beschikbaar zijn om onderzoekers te helpen. Hier beschrijven we een directe zenuwinjectiemethode voor de toediening van geneesmiddelen door het perifere zenuwstelsel, waarbij de nervus vagus als modelzenuw wordt gebruikt. Deze methode kan worden gebruikt bij de behandeling van aandoeningen van het autonome zenuwstelsel door zich te richten op de linker nervus vagus, hoewel deze algemene injectiemethode met kleine aanpassingen kan worden geëxtrapoleerd naar injectie van andere zenuwen. Deze methode verklaart alle cruciale stappen die betrokken zijn bij de procedure met microchirurgie bij verdoofde volwassen ratten onder een ontleedmicroscoop. Het gebruik van een trackingkleurstof wordt beschreven om de monitoring van de injectiegetrouwheid in realtime te vergemakkelijken. Er worden illustraties gegeven van succesvolle en mislukte injecties. Als ze op de juiste manier worden uitgevoerd, kunnen directe injecties van de nervus vagus worden uitgevoerd op een veilige manier die goed wordt verdragen door de rat zonder complicaties na de bevalling. Toen de chirurgen bijvoorbeeld eenmaal in deze methode waren getraind, werden zes van de zes ratten met succes geïnjecteerd zonder complicaties. Deze methode van directe zenuwinjectie voor preklinische studies bij ratten is in staat om middelen (inclusief maar niet beperkt tot gentherapie) af te leveren aan perifere zenuwen.

Inleiding

De toepassing van de juiste methode van medicijntoediening is een van de kritische factoren voor het bereiken van succesvolle therapeutische resultaten. Ondanks de overvloed aan methoden voor de toediening van therapeutische middelen aan het centrale zenuwstelsel (CZS), zijn er slechts enkele methoden gerapporteerd voor toediening van het perifere zenuwstelsel (PNS) door directe zenuwinjectie. Directe zenuwinjectie, zoals injectie in de dorsale wortelganglia (DRG) bij ratten, is geprobeerd in preklinische studies voor een beter begrip van pijnmechanismen, geneesmiddeltoxiciteit, genoverdracht ^1,2,3 en algemene methodeontwikkeling ^1,4. Aanvullende rapporten over directe zenuwinjectie zijn onder meer injectie van de ruggenmergzenuw⁴, injectie van de heupzenuw¹ en injectie van de nervus vagus bij ratten⁵ en muizen⁶. Onlangs is een methode voor suprachondriale injectie voorgesteld voor een betere verdeling van therapieën in de kop van de oogzenuw bij konijnen⁷.

DRG wordt beschouwd als de ideale locatie voor directe injectie van transgen-geladen vectoren zoals adeno-geassocieerd virus (AAV) vanwege de sensorische functie van de cellichamen in de DRG². Er zijn zowel chirurgische als niet-chirurgische methoden van DRG-injecties beschreven ^1,8. Er zijn echter controversiële conclusies gevonden over de consistentie van de resultaten met de niet-chirurgische methode van DRG-injectie¹. Er is gesuggereerd dat een chirurgische methode met een gedeeltelijke laminectomie 100% succesvol is voor DRG-injectie bij ratten zonder enige verandering in gedragsresultaten³, evenals een methode met gedeeltelijke osteotomie bij muizen⁹. Verschillende studies rapporteren de DRG-injectiemethoden voor medicijnafgifte, die zijn gebruikt in preklinisch gentherapieonderzoek bij ratten en muizen ^1,2,10. Vectorgebaseerde gentherapiestudies met gelokaliseerde injecties kunnen de volgende voordelen bieden: verminderde off-target expressie, vermindering van systemische toxiciteit en kleinere virale ladingen en injectievolumes, verminderd risico op immunogene complicaties^11,12.

De directe injectiemethode in de heupzenuw, de langste zenuw van het lichaam, is geprobeerd door de rechter heupzenuw halverwege de dij van een rat bloot te leggen. De methode maakte gebruik van een pipet van getrokken glas uitgerust met een microprocessorgestuurd injectiesysteem om een totaal volume van 10 μL kleurstof te injecteren met een debiet van 1,2 μL/min¹. Dit experiment toonde een gebrek aan kleurstofverdeling tot het niveau van DRG, en de verdeling was meestal beperkt rond de injectieplaats. Evenzo zijn andere methoden van directe zenuwinjecties, zoals injecties van de ruggenmergzenuw, met kleurstof uitgeprobeerd om de juiste hoeveelheid injectievolume en het kleurstofverdelingspatroon bij ratten te evalueren. Er wordt gesuggereerd dat 2 μL optimaal is voor injectie van de ruggenmergzenuw, terwijl 3 μL kleurstof door DRG-injectie de verdeling in zowel dorsale als ventrale wortelganglia bij ratten liet zien¹. Er is gemeld dat het volume voor DRG-injectie bij muizen optimaal is van 1,0 μl tot 1,5 μl op basis van stam en lichaamsgrootte ^2,9.

De directe injectiemethode van de nervus vagus werd gebruikt bij ratten⁵ en muizen⁶ om de rol van neurale beschadiging of cellulaire integriteit bij het overbrengen van menselijke α-synucleïne te evalueren. Deze twee studies, uitgevoerd door dezelfde groep onderzoekers, beschrijven een korte methode om AAV-vectoren rechtstreeks in de linker nervus vagus in het cervicale gebied te injecteren. Bij ratten omvatte de methode een glazen capillair met een tipdiameter van 60 μm om een vector van 2 μL te injecteren met een debiet van 0,5 μL/min met een Hamilton-spuit van 5 μL. Bij muizen werd een totaal volume van 750 nL vectoroplossing geïnjecteerd met een debiet van 160 nL/min met behulp van een 36-G stompe stalen naald die op een 10 μL NanoFil-spuit 6 werd^aangebracht. Deze experimenten toonden aan dat het transgen werd afgeleverd en tot expressie werd gebracht in axonen in de pons en middenhersenen van de ratten en muizen. Evenzo vertoonde de dorsale motorische kern van de linker nervus vagus een positieve immunoreactie met transgen. Deze bewijsstukken illustreren dat de directe injectiemethode van de nervus vagus een betrouwbare methode zou kunnen zijn in gentherapie, waarbij de cellulaire transductie wordt uitgebreid naar verschillende locaties van de hersenen, die axonen door de nervus vagus projecteren. Deze methoden vermelden echter niet het gebruik van kleurstof om de injectiegetrouwheid te volgen.

Hier wordt een methode beschreven voor directe injectie in de linker nervus vagus met behulp van niet-toxische volgkleurstoffen die grotendeels van toepassing zijn op onderzoekers in preklinische studies. Mogelijke valkuilen die problemen kunnen veroorzaken bij de toediening van medicijnen en de manieren om deze te overwinnen, worden besproken. Deze situaties worden geïllustreerd met foto's om te laten zien wat de levering mislukt en hoe deze succesvol kan worden gemaakt.

Protocol

Het volgende protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de instelling en goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Voorbereiding van de huisvesting

OPMERKING: Dit protocol is voor volwassen ratten van ten minste 2 maanden oud. Kleinere dieren (waaronder muizen en jongere ratten) zijn mogelijk, maar worden niet aanbevolen en zullen aanzienlijk moeilijker zijn.

1. Geef vochtig voer of ander zacht voedsel (veterinaire herstelgel) gedurende 48 uur voorafgaand aan de nervus vagus. Aangezien dieren na de ingreep moeite kunnen hebben met eten, moet u deze items vóór de operatie aan de dieren introduceren om hen te helpen vertrouwd te raken met de smaak van deze items en eetmotivatie op te wekken.
2. Huisratten individueel in een kooi ten minste 1 week voor de operatie, evenals 1 week na de operatie. Dat stelt hen in staat om te wennen aan de stress van het alleen zijn en voorkomt krabben aan wonden na een operatie door een nestgenoot.

2. Voorbereiding van de chirurgische items en ruimte

1. Maak van tevoren een lijst van alle benodigde items en controleer nogmaals of alle items beschikbaar zijn voor de operatie.
2. Steriliseer alle items met de juiste sterilisatiemethoden vóór de operatie.
3. Stel de steriele operatieruimte in onder de snijmicroscoop. Plaats een verwarmingskussen onder de microscoop om de rat warm te houden tijdens de operatie.
4. Leg alle chirurgische materialen op een operatietafel op een steriel laken. Houd voldoende ruimte voor een operatie onder de ontleedmicroscoop. Zorg ervoor dat de focus van de microscoop optimaal is en het operatiegebied omvat om de zenuw zichtbaar te maken.
5. Plaats de spuitpomp dicht bij de operatiefase, zodat de lengte van de slang voldoende is om de injectieplaats te bereiken.
6. Plaats het chirurgische gereedschap naar de zijkant van de dominante hand van de chirurg.

3. Bereiding van een mengsel van het kandidaat-geneesmiddel en de trackingkleurstof

1. Zorg ervoor dat het kandidaat-geneesmiddel wordt verdund om de vereiste concentratie in het aanbevolen verdunningsmiddel te bereiken, zodat 5 μl van het geneesmiddel gemengd met kleurstof de vereiste hoeveelheid van het toe te dienen kandidaat-geneesmiddel geeft. Een maximaal injectievolume met de directe nervus vagus methode wordt aanbevolen op 5 μl (inclusief tracking dye, zie stap 3.2).
2. Meng een compatibele kleurstof met het kandidaat-geneesmiddel om de injectietrouw in realtime te kunnen volgen. Een eindconcentratie van 1% Luxol Fast Blue of 0,002% fluoresceïne zijn bijvoorbeeld compatibele kleurstoffen om te gebruiken.
   LET OP: Gebruik de kleurstof in de optimale concentratie in het mengsel van kleurstof en kandidaat-geneesmiddelen. Wanneer de concentratie kleurstof in het mengsel te laag is, is het mogelijk dat deze niet zichtbaar is om de injectie te volgen. Wanneer de concentratie kleurstof te hoog is, kan dit resulteren in een mengsel dat te dik is en een hoge viscositeit heeft, waardoor de injectienaald verstopt raakt.

4. Het kandidaat-geneesmiddel en het kleurstofmengsel in de slang laden

1. Sluit een glazen spuit van 100 μl met de zuiger verwijderd aan op een naald van 27 G.
2. Sluit het ene uiteinde van ongeveer 45 cm gesteriliseerde polyethyleen slang aan op de naald van 27 G.
3. Neem een plastic spuit van 3 ml en plaats deze in een naald van 27 G. Vul de spuit met ongeveer 0,5 ml 0,9% normale zoutoplossing.
4. Vul de polyethyleenslang met de 0,9% normale zoutoplossing vanaf het open uiteinde om de volledige lengte van de slang en het hele vat van de glazen spuit te vullen totdat deze overloopt.
   NOTITIE: Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat luchtbellen vast komen te zitten in de slang.
5. Verwijder de spuit en naald van 3 ml en gooi deze weg.
6. Steek de zuiger van de spuit in de cilinder van de glazen spuit en duw deze iets naar voren tot het midden van de cilinder.
7. Plaats de glazen spuit in de spuitpomp.
8. Trek de zuiger met behulp van de spuitpomp iets naar achteren om een luchtruimte van ongeveer 1,5 cm te creëren aan het open uiteinde in de lengte van de slang.
9. Pipetteer ten minste 5 μL mengsel van kleurstof en kandidaat-geneesmiddel met een micropipet van 10 μL en laat het op een gesteriliseerd stuk parafilm vallen.
10. Zuig het kandidaat-medicijnmengsel op in de slang door de zuiger via de spuitpomp terug te trekken. Houd de luchtbel tussen de 0,9% zoutoplossing en de injectieoplossing, maar vermijd anders dat er luchtbellen in de injectieoplossing terechtkomen. Markeer het niveau van het injectiemengsel in de slang met een stift.
    OPMERKING: De luchtspleet tussen het kandidaat-geneesmiddel-kleurstofmengsel en de steriele zoutoplossing in de slang is van cruciaal belang om vermenging van de twee oplossingen te voorkomen.
11. Plaats de naald van 35 G op de slang. Bevestig de naald met tape op het schone oppervlak van de chirurgische fase, zodat de naald niet losraakt, niet beweegt en iets anders aanraakt, en gesteriliseerd blijft.

5. Primen van de injectienaald

1. Stel het programma van de spuitpomp in op 0.5 μL/min.
2. Laat de spuitpomp ongeveer 10-15 s aanzetten, totdat de injectieoplossing uit de punt van de naald begint te komen. Een kleine hoeveelheid van het mengsel aan de punt van de naald zonder een lek bij het gewricht van de slang en injectienaald (of ergens anders langs de lengte van de spuit, slang of naald) geeft aan dat de opstelling correct is.
   OPMERKING: Als een klein druppeltje aan de punt van de naald niet wordt gezien, duidt dit op een verstopping van de naald. Naaldverstopping kan optreden als gevolg van de hoge viscositeit van het kandidaat-geneesmiddel en het kleurstofmengsel, overtollige lucht die in het systeem zit en de glazen spuit niet goed in de spuitpomp zit. Zie afbeelding 1 voor een voorbeeld van lekkage bij de overgang tussen de naald en de slang. Priming is van cruciaal belang omdat het helpt om te bepalen of de naald vrij is en de injectie in de zenuw soepel zou verlopen.

6. Voorbereiding van de rat op een operatie

1. Verkrijg het lichaamsgewicht van de rat om de benodigde dosis pijnstillers te berekenen. Carprofen wordt bijvoorbeeld subcutaan gebruikt in een dosering van 5 mg/kg bij ratten.
   OPMERKING: Carprofen wordt aanbevolen om vóór injectie bij 4 °C te bewaren.
2. Verdoof de rat met een isofluraanverdamper met een debiet van 3%-4% voor inductie van anesthesie gedurende ongeveer 2-3 minuten. Verlaag het isofluraandebiet tot ongeveer 1,75%-2% voor het behoud van de anesthesie.
3. Breng de rat over naar een aparte tafel met een opstelling voor ontharing en voorbereiding van de locatie. Zorg ervoor dat deze tafel zich dicht bij de operatieruimte bevindt.
4. Breng kunstmatige scheurzalf aan in beide ogen van de rat om overmatige uitdroging te voorkomen.
5. Dien pijnstillers toe volgens het goedgekeurde institutionele dierprotocol om pijn onder controle te houden wanneer de rat weer bij bewustzijn komt.
6. Scheer het operatiegebied met een tondeuse aan de ventrale zijde van de nek in het cervicale gebied. Scheer tot ongeveer 2 cm loodrecht vanaf de middellijn aan beide zijden van kin tot borstbeen.
7. Steriliseer het gebied met 70% ethylalcohol en 10% betadine, veeg het gebied afwisselend drie keer af met een alcoholdoekje en povidon-jodium. Veeg vanuit het midden van het gebied naar buiten toe in een cirkelvormig patroon.
8. Breng de rat in rugligging onder de microscoop over naar het chirurgische stadium. Pas de focus van de microscoop aan om het operatiegebied in het cervicale gebied te visualiseren.

7. Het uitvoeren van een operatie bij ratten om het kandidaat-medicijn rechtstreeks in de linker nervus vagus te injecteren (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4)

OPMERKING: Voor dit deel van de methode is een tweede persoon nodig om de chirurg te assisteren.

1. Plaats de rat op een verwarmingskussen in rugligging onder de ontleedmicroscoop die is gekoppeld aan een gemonteerde lamp.
2. Haak de voorste bovenkaaktanden van de rat vast met een stuk niet-resorbeerbare hechtdraad en bevestig het open uiteinde van de hechtdraad in de neuskegel zodat het neusgat van de rat zich tijdens de narcose altijd in de neuskegel bevindt.
3. Plaats de rat zo dat zijn kop aan de linkerkant van de rechtshandige chirurg ligt (of de rechterkant van een linkshandige chirurg). In deze positie staat de voorkant van de chirurg loodrecht op het lichaam van de rat. Plaats een kussen van gesteriliseerde meter onder de nek en pas de hoek van het cervicale gebied van de rat aan zodat het cervicale gebied recht wordt. Dit maakt het gemakkelijker om de linker nervus vagus te lokaliseren en de injectie uit te voeren.
4. Drapeer het hele lichaam van de rat met een gesteriliseerd laken en houd de operatieruimte open.
5. Bevestig vier oprolpennen afzonderlijk met 4 magnetische fixatoren met elastomeren en plaats de fixators op de vier hoeken van de chirurgische fase.
6. Injecteer lokale anesthetica epidermaal op de middellijn van het cervicale gebied waar de incisie wordt gemaakt. Zo wordt meestal een mengsel van lidocaïne en bupivacaïne gebruikt.
7. Maak een ongeveer 2 cm lange longitudinale huidincisie op de middellijn tussen de kin en het borstbeen met een scalpelmes in de ventrale zijde van de nek bij het cervicale gebied (Figuur 3A).
8. Maak de gesneden randen van de huid bot los met gesteriliseerde katoenen uiteinden.
9. Trek de huidranden in tegengestelde richting van de plaats van de incisie in met behulp van de oprolpunten.
10. Scheid het dashboard met wattenstaafjes om dieper te gaan. Duw de speekselklieren naar de zijkant.
11. Scheid de sternomastoïde spieren met wattenstaafjes en trek ze opzij met de pinnen. Naarmate de scheiding van de sternomastoïde spier wijder wordt, verschijnt de luchtpijp in het midden, bedekt met de sternohyoïde spier (Figuur 3B).
    OPMERKING: Pas op dat u geen druk uitoefent op de luchtpijp.
12. Verhoog de weefselscheiding aan de linkerkant van de luchtpijp van de rat totdat de halsslagaderschede verschijnt, die de gemeenschappelijke halsslagader bevat die samen met de linker nervus vagus loopt.
13. Maak voorzichtig een klein puntgaatje in de halsslagaderschede met een fijne tang en let erop dat u de halsslagader onder de microscoop niet verwondt. Scheid de linker nervus vagus van de gemeenschappelijke halsslagader met een fijne tang.
    OPMERKING: Het operatiegebied is anatomisch kritiek. De wand van de halsslagader is dik, glad en niet gemakkelijk gewond, maar de scherpe punt van de fijne tang kan deze verwonden en er kan een bloeding optreden. Let tegelijkertijd op om de zenuw niet te verwonden.
14. Zodra de zenuw door de tang van de slagader is gescheiden, gebruikt u een gebogen naald van 25 G die op een spuit van 1 ml uit dat gat is bevestigd om de zenuw te "haken" en vast te houden aan de niet-dominante hand (Figuur 4A).
    OPMERKING: De punt van de gebogen naald is stomp gemaakt om de zenuw en slagader niet te beschadigen. De afrondingshoek van de naaldpunt wordt op maat gemaakt tot ongeveer 90° met behulp van een hemostaat (Figuur 2).
15. Houd met de dominante hand de naald vast die is geladen met het kandidaat-medicijn-kleurstofmengsel en prik voorzichtig in de zenuw in dezelfde richting als de zenuw, zodat de afschuining van de naald naar boven wijst.
    1. Voor een gemakkelijke prik houdt u de zenuw recht door voorzichtig aan de haak van 25 G te trekken. Steek de naald in de zenuw en ga meer dan 0,5 cm naar voren, terwijl u de naald evenwijdig aan de nervus vagus houdt. Trek vervolgens iets naar achteren zodat er ongeveer 0,4-0,5 cm naald in de zenuw blijft.
       OPMERKING: De hoek van de naald moet ondiep genoeg zijn om in de zenuw door te dringen zonder naar de andere kant te gaan.
16. Het kan voorkomen dat de naald op het moment van primen vrij buiten de zenuw is, maar het kandidaat-medicijn-kleurstofmengsel niet soepel door de zenuw stroomt. Om deze situatie te voorkomen, beperkt u het aantal zenuwprikken met een enkele naald niet meer dan 3 keer. Als de naald bot wordt, neemt de kans op blokkering of anderszins slechte injectie toe.
17. Zorg ervoor dat de naald zich volledig in de zenuw bevindt. Houd de positie onbeweeglijk aan en zet de spuitpomp aan.
    OPMERKING: Controleer zorgvuldig op de injectieplaats om te zien of het kandidaat-mengsel van geneesmiddel en kleurstof niet terugstroomt uit de zenuw.
18. Terwijl de injectie wordt uitgevoerd, moet u voortdurend controleren of de infusie in de zenuw blijft en soepel stroomt. Gebruik de markering op de infuusslang om de beweging van het geneesmiddel-kleurstofmengsel vanaf het startpunt te volgen.
    1. Als het kandidaat-mengsel van geneesmiddel-kleurstof niet soepel stroomt, trekt u de naald eruit en herhaalt u de priming-stap (stap 5.2). Steek vervolgens de naald weer in de zenuw en hervat de infusie.
19. De zenuw begint de kleur van de kleurstof te ontwikkelen (Figuur 4B). Ga door met de infusie met 0,5 μl/min gedurende 10 minuten om alle 5 μl van het kandidaat-geneesmiddel-kleurstofmengsel te infuseren.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de blootgestelde weefsels indien nodig te irrigeren met een kleine hoeveelheid warme 0,9% steriele zoutoplossing om overmatige uitdroging en schade te voorkomen.
20. Nadat de 5 μl is toegediend en de spuitpomp is gestopt, houdt u de naald nog 1 minuut op zijn plaats zodat al het kandidaat-mengsel van geneesmiddel en kleurstof zich vanaf de injectieplaats kan verspreiden. Verwijder de naald.
21. Verwijder de gebogen naald van 25 G. Gebruik steriele wattenstaafjes om de tissues voorzichtig terug te brengen naar hun oorspronkelijke locatie. Verwijder de oprolpunten.
22. Sluit de wond af met een niet-resorbeerbare hechtdraad (resorbeerbare hechting kan ook worden gebruikt). Breng indien nodig een kleine hoeveelheid weefsellijm aan tussen de hechtingen om de wond perfect af te sluiten.

8. Postoperatieve zorg voor een rat

1. Laat ongeveer 3 ml 0,9% warme zoutoplossing subcutaan infuseren nadat de wond is gesloten. Dit helpt de ratten om onmiddellijk te rehydrateren.
2. Plaats de rat in een warmtebron totdat hij volledig hersteld is van de anesthesie tot normale toestand. Let op alles wat wordt waargenomen dat abnormaal is tijdens het herstelproces.
   OPMERKING: de herstelduur kan langer zijn als de zenuwinjectieprocedure lang duurt.
3. Breng de rat over in zijn huiskooi met vochtig voer op de bodem van de kooi. Zorg ervoor dat er altijd water beschikbaar is. Observeer de rat postoperatief gedurende ongeveer 2 uur om er zeker van te zijn dat de rat het niet koud heeft.
   OPMERKING: Plaats de rat nog uren in een warmtebron als het koud aanvoelt.
4. Monitor de rat om 12 uur, 24 uur, 36 uur, 48 uur en 72 uur na de operatie met schriftelijke aantekeningen van observaties. Herhaal pijnstillers volgens het goedgekeurde institutionele dierprotocol om pijn onder controle te houden. Carprofen wordt bijvoorbeeld twee keer subcutaan gedoseerd met een snelheid van 5 mg/kg met een interval van 24 uur. Raadpleeg een dierenarts als de pijn langer dan 48 uur bij de rat blijft.
5. Herhaal de subcutane injectie van ongeveer 3 ml 0,9% warme zoutoplossing om 24 uur, afhankelijk van de toestand van de rat.
6. Ga door met het evalueren van de wond. Zorg ervoor dat de wond droog is en aan het genezen is.
   OPMERKING: Roodheid, zwelling en pijnlijke toestand van de wond met inactiviteit en dofheid van de rat kunnen een indicatie zijn van wondontsteking en kunnen aanvullend overleg met de dierenarts rechtvaardigen. Een rat met pijn zal een gebogen rug, gegolfde vacht, rode ogen en inactieve toestand vertonen. Het wordt meestal gevonden in een hoek van de kooi.
7. Verwijder de niet-resorbeerbare hechtingen binnen 2 weken nadat de wond is genezen.

Resultaten

In de huidige studie werden zes volwassen ratten (3 mannetjes en 3 vrouwtjes) gebruikt. Van de zes ratten werd één rat meerdere keren geïnjecteerd om een toestand van falende injectie aan te tonen die een diffusie van kleurstof rond de injectieplaats vertoont Figuur 5A. Alle andere ratten vertoonden een vlotte injectie en zenuwverkleuring, zoals te zien is in Figuur 4B en Fig...

Discussie

De methode voor directe injectie in de linker nervus vagus kan veilig en zonder complicaties na de operatie bij ratten worden uitgevoerd. Medicijnafgifte aan de nervus vagus kan worden gebruikt om het autonome zenuwstelsel (ANS) aan te pakken. Dit omvat bepaalde kritieke stappen die oefening en een matige tot hoge mate van chirurgische vaardigheid vereisen.

Deze chirurgische ingreep vereist een uitgebalanceerde algemene anesthesie bij ratten. De chirurg stree...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL BD Tuberculin Syringe with Detachable 25 G x 5/8". Needle	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Wordt gebruikt om verbinding te maken met een gebogen naald om de nervus vagus te trekken en vast te houden op het moment van injectie.
0.5% Bupivacaïne Hydrochloride Injectie	Hospira	NDC 0409-1162-19	Lokaal anesthetica die worden gebruikt om lokaal weefsel te verdoven.
100 mL 0.9% Natriumchloride-irrigatie USP	Stericare Solutions	Artikelnr. 6240	Normale zoutoplossing, gebruikt om rat en weefsel te rehydreren.
20 Blunt, Retractor Tips, 7,5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Wordt gebruikt om weefsels uit elkaar te trekken en vast te houden tijdens de operatie.
3 mL BD-Luer-Lok Syringe, Sterile, Single Use	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Wordt gebruikt om zoutoplossing in rat te injecteren en de zoutoplossing in de polyethyleenbuis te vullen.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescerende kleurstof zichtbaar in de zenuw. Wordt gebruikt om de injectiegetrouwheid te volgen.
Dierenweegschaal	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Wordt gebruikt om het lichaamsgewicht van de rat te meten.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF chirurgische handschoenen	Ansell	ASTM D3577	Steriele handschoen, het wordt gebruikt tijdens de operatie door een chirurg.
Kunstmatige tranen zalf 3,5 g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Wordt gebruikt in ogen om overmatige uitdroging van de ogen te voorkomen.
Baby-Myxter Hemostat	Fine Science Tools	13013-14	Wordt gebruikt om bloedingen te stoppen in geval van nood. Ook gebruikt om de 25 G x 5/8" in naald te buigen.
BD Intramedic PE-buis	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Wordt gebruikt in het injectie-setupsysteem om verbinding te maken met Hamilton-naald en NanoFil-naalden. Het houdt ook het injectiemengsel vast.
BD Precison Glide-naald, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Wordt gebruikt om zoutoplossing in rat te injecteren en om een gebogen naald te maken.
BD Precison Glide-naald, 27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Wordt gebruikt om steriele zoutoplossing in de BD Intradermic-buis te vullen.
Benchmark Accuris ”NextPette” variabel volume pipette micro-starterset bevat 4 pipetten: 10/20/200/1000 μL, plus stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Wordt gebruikt om steriele oplossing te pipetten.
Betadine, Povidine Jodium 10%	Honestmed	67618015017	Wordt gebruikt om het chirurgische gebied te desinfecteren.
Carprofen injecteerbare oplossing 50 mg/mL	Geleeverd door Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In ons geval gebruikten we verdund carprofen op de dosis van 5 mg/kg, geleverd door het Animal Resource Center van het University of Texas Southwestern Medical Center.
Gebogen naald (op maat gemaakt)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in naald is gekromd tot 90 graden met behulp van een hemostat. Het uiteinde van de naald is bot gemaakt. Het moet worden gesteriliseerd voor gebruik. Het wordt gebruikt om de nervus vagus te hakken en vast te houden op het moment van scheiding en injectie.
Dissectiemicroscoop	Motic	SMZ-171-BLED (binoculaire met verlichting)	Wordt gebruikt om het critische anatomische gebied te vergroten op het moment van scheiding van de nervus vagus, injectie en om lekkage van de injectie te controleren.
Drapblad	Dynarex	Bestelnummer#8122	Wordt gebruikt als kleed na sterilisatie.
Dukal katoenen applicatoren, niet-steriel	Dukal	Artikel 9003	Wordt gebruikt om botweefsel te scheiden, moet worden gesteriliseerd voor gebruik.
Dumont #7 - Fijne pincetten	Fine Science Tools	11274-20	Wordt gebruikt om de linker nervus vagus te scheiden van de arteria carotis communis. Het is gebogen, dus gemakkelijk te gebruiken.
Ethicon PDS II ongeverfde monofilamentnaald - NAALDEN, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Wordt gebruikt bij het naaien van de wond.
Ethilon Nylonnaald Zwarte monofilament	Ethicon	1856G	Wordt gebruikt bij het naaien van de wond als er niet-absorbeerbare naald wordt gebruikt. Wordt ook gebruikt om de rattand te hakken om de neus in de neuskoker te bevestigen.
Fijne pincetten - spiegelafwerking	Fine Science Tools	11412-11	Wordt gebruikt op het moment van scheiding van de nervus vagus van de arteria carotis communis. Dit is recht.
Fijne schaar - scherp	Fine Science Tools	14060-09	Gedaan om weefsel te snijden.
Hamilton-reinigingsoplossing	Hamilton	HT18311	Wordt gebruikt om de Hamilton na gebruik schoon te maken.
Hamiltonnaald, 27G, kleine hub RN-naald, 2”, PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Wordt gebruikt om verbinding te maken met BD Intramedic™ PE-buis.
Hamilton-sering, 710RN	Hamilton	7638-01	Wordt gebruikt om het medicijn vast te houden op het moment van injectie van de nervus vagus.
Insulinesering	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Wordt gebruikt om carprofen en lokale anesthetica te injecteren.
Lidocaine