Nieuwe en efficiënte methode voor Drosophila-hartfluorescentiekleuring met cryosectie

Samenvatting

Het Drosophila-protocol voor hartdoorsnede en fluorescentiebeeldvorming vereenvoudigt het bestuderen van de hartstructuur en pathologieën. Deze aanpak omvat eenvoudige secties, kleuringen en beeldvorming, waarbij de technische expertise die nodig is voor traditionele dissectie wordt omzeild. Het verbetert de toegankelijkheid, waardoor Drosophila een breder bruikbaar model wordt voor hartgerelateerd onderzoek binnen de bredere wetenschappelijke gemeenschap.

Samenvatting

Drosophila-hartmodellen worden veel gebruikt bij het bestuderen van hartveroudering en het modelleren van hartziekten bij de mens. De dissectie van Drosophila-harten vóór beeldvorming is echter een nauwgezet, tijdrovend proces dat geavanceerde training en motoriek vereist. Om deze uitdagingen aan te gaan, presenteren we een innovatief protocol dat gebruikmaakt van cryosectie voor de fluorescentiebeeldvorming van Drosophila-hartweefsel . Het protocol is gedemonstreerd bij beeldvorming van het volwassen Drosophila-hart , maar kan worden aangepast voor ontwikkelingsstadia. De methode verbetert zowel de efficiëntie als de toegankelijkheid van fluorescentiekleuring met behoud van de integriteit van het weefsel. Dit protocol vereenvoudigt het proces zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de beeldvorming, waardoor de afhankelijkheid van technici met hoogontwikkelde training en motorische vaardigheden wordt verminderd. Concreet vervangen we complexe technieken, zoals capillaire vacuümzuiging, door eenvoudigere methoden zoals weefselinbedding. Deze benadering maakt het mogelijk om hartstructuren gemakkelijker en reproduceerbaarder te visualiseren. We demonstreren het nut van dit protocol door effectief belangrijke cardiale markers te detecteren en fluorescentie- en immunokleuringsbeeldvorming met hoge resolutie te bereiken die ingewikkelde details van de hartmorfologie en cellulaire organisatie onthult. Deze methode biedt een robuust en toegankelijk hulpmiddel voor onderzoekers die de cardiale biologie van Drosophila onderzoeken, en faciliteert gedetailleerde analyses van hartontwikkeling, functie en ziektemodellen.

Inleiding

Hart- en vaatziekten (HVZ) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, verantwoordelijk voor ongeveer 17,9 miljoen sterfgevallen per jaar, goed voor bijna 1/^{3 van alle} wereldwijde sterfgevallen. Drosophila melanogaster (algemeen bekend als fruitvlieg) is veel gebruikt als modelorganisme voor het bestuderen van de genetische, cellulaire en moleculaire basis van hartontwikkeling, fysiologie, metabolisme, veroudering en cardiomyopathieën 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Drosophila-modellen zijn ook gebruikt om de rol van de hartspier bij de systemische regulatie van obesitas^{te bestuderen 10}, een belangrijke risicofactor voor cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Drosophila genoomsequencingstudies¹¹ hebben een significante conservering van genen bij mensen aangetoond, inclusief genen die verband houden met het ontwikkelen van verschillende organen, waaronder het hart. Van deze sterk geconserveerde genen zijn sommige betrokken bij hartdisfunctie, zoals cardiomyopathieën of kanalopathieën³. De recente ontwikkeling van effectieve technieken om de hartprestaties te bestuderen heeft de toepassingen van het model uitgebreid om langetermijnveranderingen in de hartfysiologie van volwassenen te onderzoeken als gevolg van factoren zoals lichaamsbeweging, voeding en veroudering⁸. Technische en logistieke uitdagingen belemmeren echter vaak het gebruik van dit modelsysteem. Een uitdaging bij het gebruik van Drosophila in cardiale studies is een nauwkeurige dissectie van het hart op een manier die de cytoarchitectuur en myocardiale elementen behoudt.

Het Drosophila-hart of het dorsale vat bestaat uit een buisachtige structuur die bestaat uit een enkele laag cardiomyocyten, pericardiale cellen die langs de hartwand zijn geplaatst, ondersteund door alaire spieren, en bij volwassenen, vergezeld van een laag ventrale longitudinale spiercel¹². Nauwkeurige dissectie om toegang te krijgen tot deze delicate structuren is een tijdrovend en arbeidsintensief proces. De huidige norm omvat technisch uitdagende dissectie en capillaire vacuümzuiging, waarvoor geavanceerde training en motorische vaardigheden nodig zijn 13,14,15,16. Meestal begint de dissectie met het insnijden van de ventrale lichaamswand, en de uitdagingen doen zich snel voor met de minuscule anatomie van het hart, de fragiele structuur en de moeilijk bereikbare dorsale locatie. Dit in combinatie met traditionele dissectietechnieken maakt een nauwkeurige analyse van de hartstructuur en -functie mogelijk, wat een verbeterd hulpmiddel biedt voor het bestuderen van hart- en vaatziekten bij Drosophila¹³. Aan de hand hiervan hebben Alayari et al. bijvoorbeeld een protocol opgesteld voor het fluorescerend labelen van Drosophila-hartstructuren, waardoor de visualisatie van cardiale morfologie en structuur wordt vergemakkelijkt. Ondanks deze inspanningen worden traditionele hartdissectie en -kleuring geconfronteerd met verschillende uitdagingen, waaronder de moeilijkheid om de weefselintegriteit te behouden en de gespecialiseerde training die nodig is voor effectieve hartkleuring.

De methode biedt een innovatieve oplossing voor dit probleem door de hele procedure te vervangen door een eenvoudiger protocol dat gebruikmaakt van cryo-inbedding van Drosophila , thorax en buik, gevolgd door immunokleuring en fluorescentiebeeldvorming. Deze eenvoudig te leren aanpak zorgt voor een snellere en eenvoudigere visualisatie van hartstructuren met een grotere reproduceerbaarheid. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige methode met droogijs die zorgt voor een uniforme uitlijning van de Drosophila-buiknagelriem op hetzelfde z-vlak, waardoor de cryosectiestap stroomafwaarts wordt gestroomlijnd. We tonen de effectiviteit van dit protocol aan bij het detecteren van belangrijke cardiale markers, hartmorfologie en cellulaire organisatie met zowel immunofluorescente als confocale microscopie. Het gemak en de hoge werkzaamheid van deze aanpak zijn met name nuttig voor op Drosophila gebaseerde hartonderzoeken met een hoge doorvoer.

Protocol

1. Voorbereiding van apparatuur

1. Zorg ervoor dat de cryostaat is ingeschakeld en is ingesteld op -20 °C. Zorg ervoor dat de temperatuur voldoende tijd heeft om dit punt te bereiken. Als de machine op omgevingstemperatuur is, kan het afkoelen tot de optimale snijtemperatuur ongeveer 5 uur duren.
2. Schakel de glijbaanverwarmer of broedmachine in en zorg ervoor dat deze op 37 °C is ingesteld. Zorg ervoor dat de glaasjes voldoende tijd hebben om de gewenste temperatuur te bereiken.
   OPMERKING: In dit stadium kunnen gelabelde dia's op de verwarmer of broedmachine worden geplaatst en voor onbepaalde tijd worden gelaten totdat ze in secties worden geplaatst.
3. Zorg ervoor dat droogijs klaar is voor gebruik. IJs kan bij – 80 °C uit de opslag worden gehaald zodra stap 5 is bereikt.

2. Bereiding van oplossingen

1. Bereid 50 ml PBS voor. Bereid 10 ml 10 ml Ethelyne glycol tetraazijnzuur in PBS. Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde in PBS waarbij het uiteindelijke volume gelijk is aan 100 μl maal het aantal experimentele groepen.
2. Bereid een reinigingsoplossing van 70% ethanol in water in een spuitfles. Bereid alle fluorescerende kleuroplossingen voor.
   OPMERKING: In dit protocol wordt beschreven hoe u eenvoudige kleuringen kunt uitvoeren met behulp van eenvoudige fluorescerende vlekken of kleurstoffen. In dit geval beschrijven we het gebruik van 1x falloïdine 594 in een verhouding van 1:250 in PBS. De concentraties fluorescerende vlekken zijn afhankelijk van het reagens en de experimentele doelen. Er moeten voorbereidende tests worden uitgevoerd om de juiste concentratie te vinden. Antilichaamkleuring zal hier niet in detail worden beschreven, maar zou van toepassing moeten zijn met behulp van conventionele kleuringsmethoden.

3. Afname van weefsel

1. Verdoof 5-10 vliegen met behulp van een CO₂ -vliegenmat en plaats de vliegen in beeld onder de microscoop met een vergroting van 1x-2x. De CO₂ -regelaar moet tussen 1 en 5 kPa registreren op de CO₂ -mat.
   OPMERKING: Er zijn andere methoden voor verdoving beschikbaar (bijv. FlyNap²) en deze methoden hebben geen significante invloed op de resultaten.
2. Onthoofd met een veerschaar, knip de vleugels af en verwijder de poten van 5 tot 10 vliegen. Wat overblijft is de thorax en de buik, samen worden ze het lichaam genoemd.
   NOTITIE: Om de lichamen van vliegen in stap 5 op de juiste manier uit te lijnen, mogen eventuele resterende vleugel- of beenlengtes een vlakke uitlijning langs de onderkant van de mal niet in de weg staan. Dit bereik je door de vleugels en poten zo dicht mogelijk bij de borstkas af te knippen.
3. Plaats de lichamen met een borstel voorzichtig in gelabelde buisjes van 1,5 ml op ijs totdat alle experimentele groepen zijn verzameld.

4. Fixatie van heel weefsel

1. Nadat u de buisjes uit het ijs hebt gehaald, voegt u 100 μL 10 mM EGTA, pH 8, toe aan elke buis om het hartweefsel in de buik te ontspannen. Zorg ervoor dat alle lichamen 10 minuten onder water staan en op de orbitale schudder worden geplaatst. Tafelcentrifuge kan worden gebruikt om de lichamen te vergemakkelijken om onder te dompelen.
2. Verwijder de oplossing en gooi deze weg in de buis. Pipetteer 100 μL PBS in elke buis om het weefsel gedurende 10 minuten te wassen en plaats het op de orbitale schudder. Verwijder en gooi weg nadat de tijd is verstreken.
3. Pipetteer 100 μL 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing in elke buis. Zorg ervoor dat alle lichamen in de oplossing zijn ondergedompeld.
4. Plaats ze 15 minuten op een orbitale schudder en stel de snelheid in op ongeveer 100 eenheden. Zorg ervoor dat de instelling de weefsels niet in beweging brengt buiten contact met de oplossing.
5. Nadat deze tijd is verstreken, gooit u de PFA weg en vervangt u deze gedurende 10 minuten door 1x PBS, waarbij u er opnieuw voor zorgt dat alle lichamen in contact komen met de oplossing. Breng de buizen terug naar de orbitale schudder met een vergelijkbare snelheid als in stap 4.4 voor elke resterende wasbeurt.
6. Gooi de vorige oplossing elke keer weg en was de tissue 2x met PBS gedurende 10 minuten elk, voor een totaal van 3 wasbeurten.
7. Nadat de laatste was is weggegooid, brengt u het lichaam over naar een 10% sucrose in PBS-oplossing en zorgt u ervoor dat ze in contact komen met de oplossing in de buis. Voor een optimale verzadiging laat je ze een nacht of lang genoeg staan, zodat de lichamen naar de bodem zinken.
   OPMERKING: Nachtelijke cryoprotectie heeft de voorkeur, maar als beeldvorming op dezelfde dag nodig is, geef de cryoprotectant dan zo lang mogelijk de tijd om het weefsel te infiltreren.

5. Voorbereiding van de mal

1. Haal nu het droogijs uit de opslag en selecteer een paar stukken om in een klein metalen of plastic bakje te plaatsen. De afmetingen van de bak moeten zodanig zijn dat de vorm kan worden ingebracht en direct op een enkel, groot en bij voorkeur plat stuk droogijs kan worden geplaatst.
2. Vul een gelabelde mal voor ongeveer 50% met een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding. Probeer het binnendringen van bubbels te verminderen door de verbinding langzaam te laten stromen.
3. Plaats met een borstel de lichamen voorzichtig op het oppervlak van de OCT in de mal. Meerdere experimentele groepen moeten in dit stadium duidelijk worden gescheiden.
   OPMERKING: Het is belangrijk om verdunning van de OCT-verbinding door verontreiniging met de sucrose-oplossing door de borstel te voorkomen. Bovendien kan plaatsing diep in de OCT met behulp van de borstel veel luchtbellen veroorzaken. Vermijd deze fouten om later doorsnedeproblemen te voorkomen.
4. Duw met een tang elk lichaam naar de bodem van de mal met de dorsale wand van de thorax en buik, meestal langs de bodem. Pas vervolgens het lichaam zo aan dat de buik prioriteit krijgt als plat langs de onderkant van de vorm. Lijn alle lichamen in de X-, Y- en Z-dimensies zo uit dat elke sectie alle onderwerpen tegelijk bevat.
5. Er kan een kromming van de buik zijn, vooral bij de mannetjes; Maak dit zo goed mogelijk af voor de technicus. Dit is essentieel voor langere secties die in het coronale vlak moeten worden verzameld. Vermijd het doorboren of pletten van de lichamen tegen de bodem van de mal tijdens dit proces. Werk methodisch om elk onderwerp correct uit te lijnen.
6. Zodra alle vakken op hun plaats zitten, neem je de vorm en plaats je de bodem direct op een stuk droogijs. Controleer of de OCT na enkele ogenblikken na het contact begint te bevriezen. Laat dit doorgaan totdat alle onderwerpen in het bevroren deel van de vorm zijn gewikkeld.
7. Zodra dit stadium is bereikt, brengt u de vorm over naar -20 °C om overal te bevriezen. Vul het resterende deel van de vorm als het eerste deel volledig bevroren is. De mallen kunnen vervolgens bij -80 °C worden bewaard voor later gebruik door ze in aluminiumfolie te wikkelen of direct te snijden.
   OPMERKING: Vermijd open blootstelling aan de lucht bij -20 °C en -80 °C tussen de twee vriesfasen. Hierdoor kan er vocht ontstaan tussen de lagen.

6. Cryosecties van mallen

OPMERKING: Het is over het algemeen raadzaam om een blanco vorm voor te bereiden en te snijden voordat u experimentele groepsvormen snijdt. Dit stelt ons in staat om de juiste functionaliteit van het wiel, het mes en het anti-rolglas te garanderen direct voordat we weefsel snijden. Laat bovendien alle schimmels die uit koudere opslag komen 30 minuten acclimatiseren in de cryostaat.

1. Bevestig de boorkop aan de mal door een royale hoeveelheid OCT op het blok aan te brengen en het bit erop te plaatsen en plat te drukken. Laat dit volledig bevriezen in de cryostaat, meestal binnen 5 minuten.
2. Haal het bit en het OCT-blok uit de mal en plaats het in de boorkop, waarbij u ervoor zorgt dat het blok van boven naar beneden goed georiënteerd blijft. Draai de boorkopsleutel vast totdat het bit goed vastzit.
3. Lijn het blok uit met het zaagblad met behulp van de instelknoppen en diepteregelaars van de boorkop. Stel de sectiebreedte in op 20 μM of lager.
   OPMERKING: Dunnere secties zijn wenselijker om het aantal mogelijke verzamelde secties te vergroten. De eerste 2-6 secties van elk onderwerp moeten de gewenste onbelemmerde delen van het hart bevatten, wat een functie is van de oriëntatie en de sectiebreedte. Men moet proberen de oriëntatie van de boorkop goed te krijgen voordat men de belangrijke 2-6 secties snijdt.
4. Snijd elk plakje met langzame maar consistente bewegingen, zodat het anti-rolglas elk plakje kan opvangen. Verzamel secties met behulp van verwarmde dia's. Laat de glaasjes minimaal 30 minuten maar niet langer dan 1 uur voor de eerste wasbeurt bij kamertemperatuur drogen.

7. Fluorescentie kleuring

1. Verwijder onmiddellijk na de droogperiode overtollige OCT rond de secties met een scheermesje. Zorg ervoor dat u het weefsel in dit stadium niet tegenkomt. Als het de bedoeling is dat het objectglaasje op een later tijdstip wordt gekleurd, bewaar deze dan bij -80 °C.
2. Omlijn deze rand op elke dia met behulp van een hydrofobe markering. Deze rand dient om was- en vlekkenoplossingen op het weefsel te houden.
   OPMERKING: Dit protocol beschrijft hoe u moet kleuren en wassen met behulp van een pipetmethode, schuifemmers en rekken kunnen ook worden gebruikt. Vervang eenvoudig het pipetteren van de oplossingen op de objectglaasjes door het onderdompelen van de objectglaasjes in elk van de verse oplossingen. Zoals we onlangs hebben gedaan voor beeldvorming van de hersenen¹⁷, kan een immunokleuringsprocedure ook worden toegepast op hartkleuring.
3. Was alle objectglaasjes 3x gedurende 5 minuten met PBS door voorzichtig op het objectglaasje te pipetteren, vermijd indien mogelijk pipetteren direct op het tissue. Voer dit uit met behulp van de 1000 μL pipet en de bijbehorende tips. Probeer de oplossing niet snel te spuiten, omdat hierdoor weefsels van het oppervlak van het objectglaasje kunnen loskomen.
4. Gooi de laatste wasbeurt weg en pipetteer de fluorescentievlekoplossing (1:250, 1x falloïdine) op de tissues. Laat dit 1 uur incuberen bij kamertemperatuur in het donker.
5. Na dit punt zijn de proefpersonen lichtgevoelig. Voer alle volgende stappen uit in het donker of door de dia's af te dekken. Gooi de fluorescentievlek weg en spoel met behulp van de 1000 μL pipet 3x gedurende 5 minuten met PBS.

8. Montage en voorbereiding voor beeldvorming

1. Gooi de laatste wasbeurt weg en laat een kleine hoeveelheid PBS op de dia achter. Pipetteer 3-5 druppels montagemedia op de dia met behulp van de pipet van 1000 μl en vermijd directe ontplooiing op het weefsel.
2. Plaats het dekglaasje zo op de dia dat de productie van luchtbellen tot een minimum wordt beperkt. Gebruik voor het gemak een tang om het dekglaasje aan de ene rand te plaatsen en laat de andere kant geleidelijk zakken totdat het gelijk ligt met de schuif. Ga voorzichtig om met de vers gemonteerde objectglaasjes en bewaar ze plat gedurende minimaal 24 uur bij 4 °C.
3. Dicht dia's af met nagellak, of als het montagemedium hard wordt, vermijd dit dan. Nagellak die neon of glitter bevat, mag niet worden gebruikt. Afhankelijk van de fluorescerende vlek kunt u onmiddellijk beeldvorming uitvoeren of objectglaasjes opslaan om later vast te leggen.

9. Beeldvorming

OPMERKING: Voor het vastleggen van foto's werd een Olympus BX 63-microscoop met 10x, 40x en 60x lenzen gebruikt. De juiste filters voor DAPI, Lipid Spot 488 en Phalloidin 594 werden ook gebruikt.

1. Inspecteer de dia's voordat u ze beeldt, en maak ze schoon met een tissuedoekje en 70% ethanol in wateroplossing. Als dia's onmiddellijk na de montage worden afgebeeld, wees dan extra voorzichtig bij het schoonmaken om te voorkomen dat het dekglaasje wordt verstoord.
2. Selecteer de juiste belichtingstijden voor elk kanaal op basis van de helderste fluorescerende onderwerpen in het algehele experiment. Vermijd oververzadiging terwijl u een zo helder mogelijk beeld genereert en de achtergrond verkleint. Onderzoek snel elke experimentele groep met een liveweergave van elk kanaal om ervoor te zorgen dat de belichting op de juiste manier is ingesteld.
3. Stel scherp op elk onderwerp en gebruik hetzelfde kanaal voor alle onderwerpen voor consistentie. Leg vervolgens elk onderwerp vast. Leg alle experimentele groepen vast die op dezelfde dag voor vergelijking worden gebruikt om verschillen in fluorescerend verval tussen vergeleken groepen te voorkomen.
4. Bewaar de objectglaasjes na de beeldvorming in het donker bij 4 °C om ze later opnieuw vast te leggen.

Resultaten

De hierboven beschreven methode vergemakkelijkt de studie van het Drosophila-hart met behulp van fluorescentiebeeldvorming zonder vervelende dissectie. Dit is het belangrijkste voordeel van deze methode, aangezien de conventionele methode van hartdissectie de ontwikkeling van complexe motorische vaardigheden vereist. Geïllustreerd in figuur 1, is de methode toegankelijker dan hartdissectie voor nieuwe onderzoekers en biedt het flexibiliteit van expe...

Discussie

We hebben een efficiënt protocol ontwikkeld voor het voorbereiden van een Drosophila-hartbuis voor visualisatie met behulp van fluorescerende of confocale beeldvorming. Dit wordt voorafgegaan door een bespreking van een veelgebruikte, maar tijdrovende en arbeidsintensieve methode voor het verkrijgen van toegang tot en het bewaken van de cytologische integriteit van het Drosophila-hart. Onze innovatieve en efficiënte methode biedt een beknopt en efficiënt alternatief voo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
1000 µL Pipette Tips	Olympus Plastics	23-165R
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris Buffered Saline	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
Anti-Roll Glass	IMEB	AR-14047742497
Bovine Serum Albumin	Fisher	9048-46-8
Centrifuge Tubes 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Charged Slides	Globe Scientific	1415-15
Cryosectioning Molds	Fisher	2363553
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Cryostat Blades	C.L. Sturkey	DT554N50
Dry Ice
Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Fly Pad	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
Hardening mounting Media with Dapi	Vectashield	H-1800
Kimwipes	Kimtech	34120
Microscope	Olympus	SZ61
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher	4585
Paraformaldehyde 20%	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
Razor Blades	Gravey	#40475
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-10
Sucrose	Fisher	S5-500