Method Article

Identificatie en classificatie van positiespecifieke GABA A-receptorsubeenheid missense-varianten voor hun rol in hippocampale piramidale neuronen

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie introduceert een multischaalkader, variërend van DNA- tot eiwitfunctie en neuraal gedrag. Het presenteert een nieuwe benadering voor het onderzoeken van voorspelde pathogene mutaties in de GABA A-receptorsubeenheid, waarbij wordt verondersteld dat epileptogene mutaties en proximale mutaties, voorspeld als pathogeen, vergelijkbare effecten kunnen hebben op het CA1-piramidale neuronmodel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van de effecten van functioneel onbekende varianten in epilepsie-geassocieerde genen is cruciaal voor het ophelderen van de pathofysiologie van de ziekte en het ontwikkelen van gepersonaliseerde therapieën. Met een multischaalkader, dat zich uitstrekt van DNA-sequentie tot eiwitfunctie en neuraal gedrag, beschrijven we een nieuwe benadering voor het voorspellen en onderzoeken van pathogene mutaties, waarbij we veronderstellen dat epileptogene mutaties in de GABA A-receptorsubeenheid en nabijgelegen voorspelde mutaties vergelijkbare effecten kunnen hebben op het CA1-piramidale neuronmodel. Door de karakteristieke relaties tussen voorspelde pathogene mutaties en proximale epileptogene mutaties te onderzoeken, wil de studie de effecten van voorspelde mutaties schatten op basis van de effecten van epileptogene mutaties op hippocampale piramidale neuronsimulaties.

De methodologie begint met het verzamelen van genetische gegevens van de GABAA-receptor γ2-subeenheid, gevolgd door het opschonen en formatteren van de gegevens in R met behulp van een aangepast script. Vervolgens zullen ensemblevoorspellers worden toegepast om de pathogene missense-varianten van de γ2-subeenheid te identificeren en te prioriteren. Het in kaart brengen van een specifieke pathogene variant (voorspeld) op de subeenheid structurele domeinen gedeeld door epileptogene mutaties zal worden geïllustreerd, vergezeld van moleculaire modellering van hun effecten en beschouwing van evolutionaire conservering. Vervolgens zullen variantspecifieke meta-analyse en parameternormalisatie worden uitgevoerd, gevolgd door correlatieanalyse om eventuele significante relaties tussen voorspelde mutaties en proximale epileptogene mutaties te identificeren. Met behulp van een op Python gebaseerde neurale simulator zal een multi-compartimenteel geleidingsgebaseerd neuronmodel worden beschreven, dat het effect van wild-type en epileptogene mutanten weergeeft. Simulatie van neurale responsen gegenereerd door epileptogeen GABAA-receptorsubtype zal worden overwogen voor de ruwe schatting van het effect van de voorspelde pathogene varianten op de neurale respons. Voor zover wij weten, is dit het eerste protocol dat een multischaalkader onderzoekt om de effecten van GABAA-receptorvarianten op neuronaal gedrag te schatten, cruciaal voor epilepsieonderzoek. Dit protocol kan dienen als basis voor het verbeteren van voorspellingen van cellulaire fenotypes veroorzaakt door potentieel pathogene varianten van GABAA-receptoren geassocieerd met epilepsie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor bijna alle ziekten bij de mens speelt genetische variatie een belangrijke rol bij de individuele vatbaarheid. Daarom biedt inzicht in hoe sequentievariaties zich verhouden tot ziekterisico een waardevolle manier om belangrijke processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten bloot te leggen en nieuwe benaderingen voor preventie en behandeling te identificeren1. Dit geldt ook voor neurologische ontwikkelingsstoornissen, die behoren tot de meest voorkomende chronische medische aandoeningen in de pediatrische eerstelijnszorg2. Aandoeningen zoals autismespectrumstoornis, verstandelijke beperking en epilepsie illustreren hoe genetische variatie de individuele gevoeligheid tijdens de ontwikkeling aanzienlijk beïnvloedt3.

De zich ontwikkelende hersenen zijn vatbaarder voor epileptische aanvallen dan de volwassen hersenen vanwege genetisch geprogrammeerde neurologische ontwikkelingsmismatch in de kritische balans tussen excitatie en remming4. Aangezien GABA (gamma-aminoboterzuur), de primaire remmende neurotransmitter in de volwassen hersenen, prikkelend is tijdens de embryonale en vroege postnatale ontwikkeling, is dit niet gunstig voor de stabiliteit die nodig is om aanvallen in jonge hersenen te voorkomen. Deze tijdelijke toestand, veroorzaakt door het gebrek aan voldoende expressie van K-Cl co-transporters5, kan bijdragen aan een verhoogd risico op epileptische activiteit in de aanwezigheid van disfunctionele GABAA-receptoren. GABAA-receptoren bemiddelen excitatoire en remmende acties van GABA, afhankelijk van de intracellulaire concentratie van het Cl-ion 6. Naarmate de hersenen ouder worden, verstoren mutaties in de GABA A-receptorcoderende genen, evenals in andere ionkanalen, de prikkelbaarheid, en mutaties in genen die betrokken zijn bij het neuronale metabolisme, celsignalering en synapsvorming7, kunnen aandoeningen veroorzaken zoals epilepsie bij afwezigheid bij kinderen8.

Klinische interventies maken steeds meer gebruik van genetische analyse om de precisie bij de behandeling van neurologische ontwikkelingsstoornissen te verbeteren2. Genetische tests bij pediatrische epilepsie bieden potentiële doelen voor benaderingen van precisiegeneeskunde9, wat het belang van genetische varianten benadrukt bij het begeleiden van behandelingsbeslissingen. Bovendien ontvangt ~25% van de epilepsiepatiënten met de novo mutaties genetische diagnoses die potentiële doelwitten voor precisiegeneeskunde identificeren, wat de aanzienlijke waarde van genetische varianten bij het sturen van behandelingsbeslissingen onderstreept10. Dit is aangewakkerd door de vooruitgang in sequencingtechnologieën van de volgende generatie, zoals gerichte genpanels, sequencing van het hele exoom en sequencing van het hele genoom, die genetische ontdekkingen drastisch hebben versneld11. Het toenemende aantal nieuwe genontdekkingen brengt echter een uitdaging met zich mee wanneer de resultaten een variant van onbekende betekenis (VUS) opleveren, een classificatie die tegenstrijdig bewijs of onvoldoende informatie weerspiegelt over de moleculaire rol van de variant in de pathogenese van de ziekte. Varianten die zijn geclassificeerd als VUS komen overeen met één categorie binnen het vijfledige variantclassificatiesysteem dat is voorgesteld door het American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) en de Association for Molecular Pathology (AMP)12.

Het aanpakken van de uitdaging van functioneel onbekende genetische varianten vereist inspanningen op twee belangrijke dimensies: klinische praktijk en onderzoek. Klinisch gezien kan de onzekerheid rond VUS het beheer en de besluitvorming van patiënten bemoeilijken13. Vanuit het oogpunt van wetenschappelijk onderzoek ishet van cruciaal belang om pathogene varianten te identificeren onder het toenemende aantal varianten van onzekere betekenis en om hun rol in de pathofysiologie en fenotypische effecten van de ziekte te bepalen1. Een ideaal scenario zou zijn om de moleculaire, neuronale en netwerkeffecten van alle functioneel niet-gekarakteriseerde varianten nauwkeurig te voorspellen, waardoor de middelen, tijd en moeite die nodig zijn voor laboratoriumonderzoek worden geminimaliseerd. Deze aspecten onderstrepen het belang van het nauwkeurig classificeren van genetische varianten om een nauwkeurige diagnose van genetische epilepsie mogelijk te maken, een gepersonaliseerde behandeling te ondersteunen en de ontdekking van potentiële farmacologische doelen te vergemakkelijken. De huidige voorspellende instrumenten 14,15,16,17 zijn relatief nauwkeurig, maar bieden doorgaans alleen binaire classificaties (pathogeen versus goedaardig) en missen ziektespecifieke inzichten in moleculaire pathofysiologie, fenotypische gevolgen en onderliggende mechanismen. Dit artikel richt zich op de onbekende missense-varianten van geselecteerde GABA A-receptorsubeenheid-coderende genen en presenteert een raamwerk dat gericht is op het verbeteren van onderzoeksbegeleiding door contextuele factoren van varianten zoals moleculaire, evolutionaire en structurele aspecten op te nemen, evenals simulaties van neurale pathologie afgeleid van in vitro biofysische gegevens van epilepsie-geassocieerde mutaties. Onze methodologie richt zich op de identificatie van onbekende pathogene varianten van de γ2-subeenheid van de GABAA-receptor, een belangrijke subeenheid die betrokken is bij de pathofysiologie van epilepsie 18,19,20. Dit wordt gevolgd door de verkenning van positiespecifieke matching van deze voorspelde varianten met de epilepsie-geassocieerde mutaties die worden gekenmerkt door structurele en elektrofysiologische gegevens. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt om het varianteffect te schatten op een model van hippocampale piramidale neuron dat een GABA A-receptorsubtype tot expressie brengt, samengesteld uit γ2-, α1- en β3-subeenheden (γ2-GABAA-receptoren), verantwoordelijk voor snelle synaptische remming6. Het is belangrijk op te merken dat GABAA-receptoren zich samenstellen uit een grote subeenheidspool (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π en ρ1-ρ3) en afhankelijk van de samenstelling van de subeenheid verschillen GABAA-receptoren in hun modulatie, biofysische kenmerken, evenals regionale, cellulaire en subcellulaire expressiepatronen in combinatie met specifieke functies 6,21,22,23, 24,25. De huidige studie richt zich dus alleen op de γ2-GABAA-receptoren of γ2-bevattende GABAA-receptoren.

GABA A-receptorsubeenheden zijn samengesteld uit karakteristieke structurele kenmerken: een lang N-terminaal extracellulair domein (ECD), vier transmembraanoverspannende domeinen (TM1 tot TM4), een intracellulaire linker die de TM1 en TM2 verbindt, een extracellulaire linker die de TM2 en TM3 verbindt, een grote intracellulaire lus tussen TM3 en TM4 (TM3-TM4-lus) en een korte extracellulaire C-terminus 6,26, 27. okt. Er wordt gesuggereerd dat de GABAA-receptor functioneert via een complex "lock and pull"-mechanisme, waarbij GABA-binding de β en α subeenheden vergrendelt, waardoor ze aan de extracellulaire domeinen (ECD's) van de subeenheden trekken en ze tegen de klok in draaien27. Deze beweging buigt de transmembraandomeinen (TMD's), waardoor het ionenkanaal27 wordt geopend. De kanaalactiviteit lijkt dus samen te worden gecoördineerd met structurele cassettes binnen de GABAA-receptoren. Het blijkt dat epilepsiemutaties disfunctie in kanaalactiviteit veroorzaken via vervorming van deze structurele cassettes28. Bijgevolg is onze studie gebaseerd op het idee dat voorspelde pathogene varianten in de nabijheid van functioneel geïdentificeerde epileptogene mutaties in de specifieke structurele cassettes van de GABA A-receptorsubeenheden vergelijkbare patronen van elektrofysiologische of biofysische vervorming in kanaalfunctie kunnen vertonen, zoals waargenomen in gevallen van deze epileptogene mutaties. Hoewel de aanwezigheid van epileptogene structurele cassettes in de GABA A-receptorsubeenheden28 dit idee indirect ondersteunt, toont onze studie de complexiteit en uitdaging aan van het correleren van biofysische parameters van epileptogene mutaties met die van voorspelde pathogene mutaties. Om deze complexe relaties te ontmaskeren, is ons raamwerk belangrijk omdat het een multischaalbenadering belicht, variërend van DNA- tot eiwitfunctie en neuraal gedrag dat cruciaal is voor epilepsieonderzoek. Deze benadering integreert computationele genetica met moleculaire modellering en neurale simulaties, terwijl ook het belang wordt benadrukt van complementaire methoden, zoals machine learning getraind op grote datasets, die de effecten van mutaties op kanaalstructuur, activiteit en neurale prikkelbaarheid kunnen vastleggen. Bovendien maakt de simulatie van epileptogene γ2-GABAA-receptoractiviteit op het hippocampale piramidale neuronmodel de replicatie mogelijk van in vitro cellulair fenotype geassocieerd met GABAA-receptorkanalopathie en de demonstratie van veranderde responsen van één neuron in het centrum van netwerkdisfunctie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In silico voorspelling van pathogene varianten

  1. Gegevensverzameling van varianten
    1. Zoek met behulp van de ClinVar-database29 naar varianten van onzekere significantie (VUS) in het coderende gebied van het gen van belang via de website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Voer het gensymbool (bijv. GABRG2) in de zoekbalk in en filter de resultaten om alleen de gewenste soorten varianten op te nemen, zoals single-nucleotide, missense-varianten met onzekere betekenis. Download en sla de gegevens op als data.xlxs (Aanvullend Bestand 4: Aanvullende Tabel S1). Noteer de datum van de gedownloade gegevens.
      OPMERKING: In het huidige protocol zal de menselijke γ2-subeenheid van de GABAA-receptor , met name Homo sapiens gamma-aminoboterzuur type A-receptorsubeenheid gamma2 (GABRG2), transcriptvariant 1, mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), ook bekend als γ2L, worden geanalyseerd. Het is belangrijk om het referentietranscript van het gen van interesse en andere corresponderende identificatiegegevens in verschillende databases (UniProt, ENSEMBL, PDB) vast te leggen, aangezien verschillende rekenmethoden verschillende identificatiegegevens kunnen vereisen (Aanvullend Bestand 4: Aanvullende Tabel S2). Als de database of het computationele hulpmiddel de versienummers van de sequentie-ID's niet herkent, probeer dan zowel de ID met het versienummer (NM_198904.4) als zonder het versienummer (NM_198904).
    2. Basisinformatie referentie-eiwit
      1. Selecteer in de NCBI-database https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Nucleotide in de zoekopties en voer de NCBI Ref. seq. ID van het gen van belang (NM_198904.4). Door vervolgens in de rechterkolom naar beneden te scrollen, klikt u op het eiwit onder de categorie Gerelateerde informatie om het eiwit (NP_944494.1) te vinden dat wordt gecodeerd door het transcript NM_198904.4. Noteer aan de hand van de informatie die voor het eiwit NP_944494.1 wordt gegeven de sequentieposities van de specifieke regio's in de vorm van een tabel (Aanvullend bestand 4: Aanvullende tabel S3).
        OPMERKING: Het is belangrijk om de voorlopig bekende informatie te bepalen voor de sequentiepositie van functioneel en structureel kritieke regio's, motieven of residuen zoals eiwitdomeinen, fosforyleringsplaatsen, ligandbindingsplaatsen en moleculaire interactie-interfaces. Dit kan worden bereikt door database- (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) en literatuuronderzoek te combineren.
  2. Organisatie van variantgegevens
    1. Organiseer de gegevens om te voldoen aan de invoervereisten voor de gekozen voorspellers. Zorg ervoor dat het formaat van de opgehaalde gegevens is georganiseerd om te voldoen aan de vereisten van de dbNSFP-server http://database.liulab.science/dbNSFP. Verwijder hiervoor onnodige kolommen uit het data.xlsx bestand (Aanvullend bestand 4: Aanvullende tabel S1 uit stap 1.1.1), waarbij alleen de volgende kolommen in de opgegeven volgorde worden bewaard:
      "GRCh38Chromosoom", "GRCh38Locatie", "Naam", "Eiwit verandering".
    2. Sla het bestand op onder een nieuwe bestandsnaam: "data1.xlsx" (aanvullende tabel S4). Formatteer het data1.xlsx bestand in R door de code uit te voeren (aanvullend bestand 1: Data_GABAA. R), die de geformatteerde gegevens als data1_output.xlsx opslaat (Aanvullend bestand 4: Aanvullende Tabel S5) in de werkmap die relevant is voor het R-project.
      OPMERKING: Verschillende computationele methoden vereisen verschillende gegevenstypen en -formaten. Het verzamelen en ordenen van gegevens op basis van specifieke formaatvereisten, zelfs voor een dozijn varianten, kan foutgevoelig en tijdrovend zijn, dus deze stap is belangrijk, tenzij de variantenpool uit slechts een paar varianten bestaat. Dan is het mogelijk om de gegevens handmatig te ordenen.
  3. Voorspelling van pathogeniteit
    1. Breng de inhoud van het data1_output.xlsx-bestand over naar de academische versie van dbNSFP-server30,31 die toegankelijk is via http://database.liulab.science/dbNSFP. Om dit te doen, kopieert/plakt of uploadt u het bestand rechtstreeks in .txt formaat.
    2. Zorg ervoor dat de volgende opties vooraf zijn geselecteerd en bevestigd op de server: HG38 (genoomopbouw), ClinPred32 en BayesDEL33 voordat u ze indient. Binnen een paar minuten genereert de server de resultaten.
      OPMERKING: In het huidige protocol zijn twee ensemblevoorspellers, namelijk BayesDEL33 en ClinPred32, geselecteerd op hoge nauwkeurigheid34 en bruikbaarheid. Er kan echter ook worden gekozen voor andere voorspellers, zoals AlphaMissense, dat beschikbaar is in de dbNSFP-database30,31. De selectie van in silico-tools is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder het genereren van voldoende meerdere lijnen computationeel bewijs voor krachtige voorspelling12. Ensemble-voorspellers die de analyse van meerdere voorspellende algoritmen integreren, kunnen dit doel dienen.
    3. Download het uitvoerbestand (een .txt formaat) en sla het op als data2.xlsx (Aanvullend bestand 4: Aanvullende tabel S6).
    4. Stel de filters in data2.xlsx (Aanvullend Bestand 4: Aanvullende Tabel S6) in door in het menu op de filteroptie te klikken en de consensusvarianten in beide kolommen te bepalen door te filteren op D. Dit geeft de lijst met de meest pathogene varianten; sla het op (zie tabblad Consensus in Aanvullende Tabel S6 [ Aanvullend bestand 4]).
  4. Variant selectie
    1. Bepaal onder de consensus pathogene voorspellingen de varianten in de nabijheid van epileptogene mutaties verkregen uit de literatuur. Zorg ervoor dat deze laatste structurele en biofysische parameters hebben die geschikt zijn voor neuronmodellering.
      OPMERKING: Deze stap is verkennend en heeft ook betrekking op het onderzoeken van het eiwit van belang in termen van zijn structurele, fysisch-chemische en biofysische parameters. In de huidige studie werden deze gegevens verkregen van Brünger et al.35 en Guo et al.36 naast een onderzoek naar epilepsie-geassocieerde mutaties. Bovendien werden als optie AlphaMissense37-scores benaderd vanuit de dbNSFP-database 30,31 met herhaling van stap 1.3 (Aanvullend bestand 4: Aanvullende tabel S7). Meer details worden gegeven in de paragrafen 2.1.1 en 2.1.2 van het protocol en in de resultaten (zie "Clustervarianten voor structurele en biofysische parameters").
    2. Gebruik voor basisvisualisatie Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) en HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) servers om de varianten in de vorige stap te onderzoeken in de context van geselecteerde GABRG2-genmutaties : P302L40 en K328M (of K289M41, wanneer het 39-residu signaalpeptide wordt uitgesloten).
      OPMERKING: Vanwege de enorme complexiteit moet structurele evaluatie van varianteffecten op meerdere analyseniveaus worden uitgevoerd. Tools zoals Protter38 zullen het mogelijk maken om de varianten duidelijk te visualiseren in de context van topologische kenmerken van het eiwit en gebruiksvriendelijke servers zoals HOPE39 zullen inzicht geven in het varianteffect door moleculaire modellering. Bovendien is een uitgebreid literatuuronderzoek van het eiwit van belang om de informatie over mutaties die verband houden met epilepsie te identificeren en te integreren.
    3. Analyse van evolutionaire conservering en structurele inzichten
      1. Open Jalview 42,43,44, een open-source programma voor het bewerken, visualiseren en analyseren van eiwitten.
      2. Importeer sequenties voor uitlijning. Klik op Bestand in het bovenste menu | Sequenties ophalen; selecteer de database in het dialoogvenster (zoals UniProt); klik op het tabblad ID's ophalen; en zoals beschreven in het dialoogvenster, voert u UniProt-toetredings-ID's van het interessante gen (GABRG2) van menselijke en andere gewervelde diersoorten in: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Klik op OK.
        OPMERKING: UniProt-toetredingsnummers van eiwitten gecodeerd door GABRG2 zijn als volgt: P18507 (P18507-2) voor Homo sapiens, P22723 voor Mus musculus, A0A2I3TKX0 voor Pan troglodytes, F1RR72 voor Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 voor Canis familiaris en A0A8M1P4D6 voor Danio rerio.
      3. Afhankelijk van het gen van belang, zijn sommige sequenties mogelijk niet geannoteerd; voer daarom een BLAST-zoekopdracht uit om relevante informatie en potentiële homologen te identificeren voor een beter contextueel begrip. Upload in dit geval het FASA-formaat van eiwitsequenties via de optie Sequenties/Van toevoegen onder het menu Bestand om meerdere sequentie-uitlijningen van de gewenste sequenties te produceren.
      4. Zodra de uitlijning is geladen, observeert u de sequenties die worden weergegeven voor het vergelijken van meerdere sequenties. Elke rij vertegenwoordigt een reeks en elke kolom vertegenwoordigt een positie in de uitlijning. Gebruik verschillende benaderingen om de beste uitlijningsmethode te bepalen; klik bijvoorbeeld op de webservices in het menu Sequentie en selecteer de optie T-Coffee met vooraf ingestelde programma's uitvoeren , die een optimale uitlijning mogelijk maakt.
      5. Klik met de rechtermuisknop op de sequentie P18507 Homo sapiens (de referentiesequentie in deze studie) en stel deze in als de referentiesequentie. Kies Opmaak in het bovenste menu en klik op Omloop voor de visualisatie van de volledige uitlijning in het scherm. Klik in hetzelfde menu Opmaak op de schaal hierboven om de visualisatie van specifieke residunummers te verbeteren. Om de visualisatie verder te verbeteren, past u de kleurenschema's aan door naar Kleur te gaan en verschillende opties te selecteren (bijv. Glanskleur, Chemische eigenschap); Wijzig indien nodig de lettergrootte.
      6. Klik op Berekenen in de menubalk en selecteer Consensus automatisch berekenen om geconserveerde regio's te markeren.
      7. Concentreer u op de positie van interessante varianten die zijn geïdentificeerd in de in-silico-voorspellingsstap en onderzoek specifieke variantposities. Annoteer specifieke residuen door er met de rechtermuisknop op te klikken en Annotatie toevoegen te selecteren. Schrijf het label (bijv. variant-ID) met de juiste kleurcode en sla het op.
        OPMERKING: In de huidige analyse werden P302L (paars) en A303T (rood) geselecteerd om ze te visualiseren in de uitlijning van de meervoudige sequentie samen met de structurele gegevens (zie de volgende paragraaf).
    4. Driedimensionale reconstructie van het volledige eiwit met de geselecteerde geconserveerde residuen
      1. Klik in het bestand dat uit de vorige stap is verkregen met de rechtermuisknop op de referentiesequentie (GABRG2 human) en selecteer 3D-structuurgegevens.
      2. Identificeer de juiste structurele gegevens (7QNE, Chain C)26 in het vervolgkeuzemenu en selecteer Nieuwe structuurweergave openen met Jmol.
        OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de residuen die zijn geselecteerd in de uitlijning van meerdere sequenties op te nemen in de structurele gegevens door Jmol, een open-source Java-gebaseerde viewer voor 3D chemische structuren.

2. Parameterselectie en biofysische modellering

  1. Variantspecifieke meta-analyse en parameternormalisatie
    1. Onderzoek de huidige literatuur om geïdentificeerde subeenheidvarianten te verzamelen met elektrofysiologische datakanaalgeleiding (gGABAA), deactiveringstijd (τ-deactivering), stijgtijd (τ-stijging) en maximale stroomamplitude (Imax). Geef de samenstelling van de subeenheid, het celtype en de wildtype-metingen voor elk geval op. Label de varianten en hun controles dienovereenkomstig (bv. bekend voor varianten met geïdentificeerde biofysische kenmerken en bekende controle voor de wildtypemetingen voor elke variant).
    2. Verkrijg AlphaMissense-pathogeniteitsscores voor varianten met geïdentificeerde biofysische kenmerken.
      OPMERKING: Zie protocolsectie 1.3 voor meer details.
    3. Maak een gegevenskader met subeenheid en aminozuurpositie voor elke variant, de oorspronkelijke en gewijzigde aminozuren, pathogeniteitsscore en biofysische parameters verkregen uit de literatuur. Om experimentele discrepanties te voorkomen, normaliseren we de biofysische parameters voor geïdentificeerde varianten als x-voudige veranderingen op wildtype-metingen.
  2. Vergelijkende variantanalyse op basis van structurele en functionele kenmerken
    1. Organiseer de voorspelde varianten op een dataframe; etiket dienovereenkomstig (bijv. voorspeld voor varianten waarvoor geen literatuur beschikbaar is over hun biofysische kenmerken).
    2. Classificeer de varianten op basis van hun locatie in de aminozuursequentie en tertiaire structuur. Voeg structurele classificatieparameters toe (bijv. lokalisatie in alfa-helices, spoelen, bètavellen, extracellulaire, intracellulaire of transmembraandomeinen, poriënvoering, agonistbinding, eiwit-eiwitinteracties) aan het gegevenskader en geef informatie voor elke variant met betrekking tot hun aminozuurpositie.
    3. Classificeer de varianten op basis van hun afstand tot het membraancentrum en de porie-as. Voeg de afstand tot de porie-as en de afstand tot de parameters van het membraancentrum toe aan het gegevensframe.
    4. Analyseer de correlatie tussen structurele en biofysische parameters over bekende varianten. Evalueer indien mogelijk de voorspelde varianten met betrekking tot de verkregen correlaties.
  3. Synaps en neuron modelbouw
    1. Gebruik de Brian245, een open-source neurale simulator ontwikkeld in Python voor het modelleren en simuleren van spiking neurale netwerken, om een multi-compartimenteel biofysisch model van GABAergische synaps te bouwen op een multi-compartimentele geleiding-gebaseerde hippocampale piramidale neuron.
    2. Ontwerp het op geleiding gebaseerde model door ionkanaalpoortkinetiek, passieve en actieve parameters en postsynaptische geleiding te definiëren. Definieer het op geleiding gebaseerde model zoals gegeven in aanvullend bestand 2, waarin de vergelijkingen worden beschreven die in het model worden gebruikt.
      1. Stel de membraancapaciteit (Cm) in op 1 μF/cm2 en de intracellulaire weerstand (Ra) op 200 Ω cm.
      2. Gebruik de gemodificeerde geleidingsmiddelen van het Hodgkin-Huxley-type voor hippocampale piramidale neuronen39 met gL = 0,0003 S/cm2, gK = 0,036 S/cm2, EL = -76,5 mV, ENa = 50 mV en EK = -90 mV.
      3. Pas de dichtheidsverdeling van NaV-kanalen over gNa aan als 0,05 S/cm2 voor soma, 0,5 S/cm2 voor axon initial segment (AIS) en node of Ranvier (NR) en 0,005 S/cm2 voor dendrieten. Stel gK en gNa in als 0 in gemyeliniseerde segmenten.
      4. Bouw ionenkanaalpoortkinetiek voor Na,V en KV zoals beschreven in aanvullend bestand 2.
      5. Introduceer synaptische stromen (Isyn) als de som van alle glutamaterge en GABAerge synapsen in een compartiment. Neem zowel snelle AMPA-receptor-gemedieerde stroom (IAMPA) als langzame NMDA-receptor-gemedieerde stroom (INMDA) op in de glutamaterge stroom (Iglu). Neem alleen snelle GABA A-receptor-gemedieerde stroom op in GABAerge stroom (IGABA). Stel dat er voor elke presynaptische piek een constante hoeveelheid glutamaat wordt afgegeven aan de synaps; daarom is de activering van receptoren spike-tijdafhankelijk (sAMPA en sNMDA) en weerspiegelen de totale receptorgeleidingsmiddelen (gAMPA en gNMDA) de hoeveelheid glutamaat die bij elke gebeurtenis vrijkomt.
      6. Gebruik het synaptische model zoals beschreven in aanvullend bestand 2.
        OPMERKING: Voor een gedetailleerde uitleg van de vergelijkingen, zie Aanvullend Bestand 2 waarin de vergelijkingen worden beschreven die in het model worden gebruikt.
    3. Verkrijg de experimenteel gemeten diameter voor soma en neurieten en de lengte van elk neurietcompartiment en vertakkingspatronen uit eerdere literatuur46,47. reduceer de echte neuronmorfologie tot een multi-compartimenteel model, door de cel in meerdere compartimenten te verdelen, dat de hoofdvertakkingsstructuur nauwkeurig behoudt en de bilaterale symmetrie behoudt.
    4. Stel de morfologische (segmentlengte en diameter; d.w.z. d_soma: 30 μm; l_AH: 5 μm; d_AH_i: 1,5 μm; d_AH_f: 1,3 μm; l_AIS: 40 μm; d_axon: 1 μm; l_myseg: 100 μm; l_NR: 2 μm; l_AxTer: 4 μm; d_AxTer: 2 μm; l_approx: 100 μm; l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i: 4 μm; d_approx_f: 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis: 2 μm; l_apLM: 70 μm; d_apLM: 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal: 1,4 μm; l_nAcDbasal_stem: 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1,5 μm) en biofysische parameters (zoals gegeven in paragraaf 2.3.2) voor elk compartiment van het piramidale neuronmodel46,47 zoals ook beschreven in het Python-script (aanvullend bestand 3: GABAAvar.py).
    5. Bepaal de biofysische parameters voor het GABAerge synapsmodel door de wildtype-controlemetingen te evalueren die zijn verkregen in stap 2.1.1.
  4. Ontwerp de topologie van het neuronmodel en wijs morfologische en biofysische parameters toe, waaronder het specificeren van de ruimtelijke rangschikking en onderlinge verbindingen van de compartimenten, op basis van de eerder verkregen morfologische en vertakkingsinformatie. Wijs de juiste morfologische (bijv. segmentlengte en diameter) en biofysische parameters (sectie 2.3.2) toe aan elk compartiment van het model, zoals beschreven in aanvullend bestand 3: GABAAvar.py.
  5. Opbouw van synapsen en stroominjectie
    1. Maak de presynaptische activiteit met behulp van SpikeGeneratorGroup (een klasse uit de Brian2-bibliotheek) zoals aangegeven in "GABAAvar.py" (aanvullend bestand 3). Sluit de spike-generator aan op het doelcompartiment van het modelneuron met behulp van Synapses-klasse om synaptische verbindingen te modelleren.
    2. Stel een aanhoudende constante stroom (Iinj) in op 0.85 nA en plaats deze op de soma om de subdrempelactiviteit na te bootsen die wordt aangedreven door de ionische stroombelasting op een bepaald moment, zoals beschreven in aanvullend bestand 3: GABAAvar.py.
  6. Om opnamemonitoren te bouwen, registreert u spanningssporen van doelcompartimenten met behulp van StateMonitor.
  7. Bouw en beheer het netwerk.
    1. Bouw het netwerk met het modelneuron, verbindingen en monitoren met behulp van netwerk.
    2. Stel de tijdstap van de simulatie in op defaultclock.dt (bijv. 0,01 ms).
    3. Voer de simulatie uit op het netwerk met network.run(T*ms), waarbij T in het voorbeeld is ingesteld op 1.000 ms.
  8. Testen van de impact van GABAA-receptor missense-mutaties
    1. Definieer de impact van elke missense-mutatie op de kanaalkinetiek aan de hand van de biofysische parameters die zijn verzameld in stap 2.1.1.
    2. Voer de stimulatie uit door deze parameters te wijzigen en plot de resultaten met behulp van "matplotlib.pyplot" zoals aangegeven in "GABAAvar.py" (aanvullend bestand 3).
  9. Test parametercombinaties om de veranderingen in vuurpatronen en -snelheden te analyseren. Plot resultaten voor vergelijkingen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie maakt gebruik van een multischaalbenadering om de pathogene varianten in de γ2-subeenheid van de GABAA-receptor , een sleutelcomponent in de pathofysiologie van epilepsie, te voorspellen en te karakteriseren. Door het gebruik van voorspellende modellen, moleculaire modellering, evolutionaire conservering, structureel onderzoek, correlatieanalyse en neurale simulaties, verbetert deze benadering de classificatie van varianten, met aan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door een combinatie van computationele genetica, moleculaire modellering en neurale simulaties toe te passen, heeft de aanpak die in dit artikel wordt gepresenteerd het potentieel om de classificatie van GABA A-receptorvarianten te verbeteren, wat waardevolle inzichten biedt voor zowel epilepsieonderzoek als klinische toepassingen. Een uitgebreide analyse voor de identificatie en prioritering van voorspelde pathogene mutaties wordt gepresenteerd en uitgebreid tot een raamwerk ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben met betrekking tot dit werk.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Çağla Koca voor haar hulp bij de bouw van het modelneuron.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Brian2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, Frankrijk; Imperial College London, Verenigd Koninkrijk2.8.0.4Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP server  Genos Bioinformatics LLC, VSv3.0Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
HOPE  Centre for Molecular and Biomolecular Informatics CMBI, Radboud Universiteit, Nederland 1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview  University of Dundee, VKJV2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter NotebookProject Jupyter, VShttps://jupyter.org/install 
PhytonPython Software Foundation, VS3.13https://www.python.org/downloads/
Protter  ETH Zürich, ZwitserlandVersie 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R The R Foundation for Statistical Computing, VSR versie 4.3.2  https://www.r-project.org/ 
RStudioPosit software, PBC, VSRStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm" Releasehttps://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles